Microbiologia per i beni culturali

Sterilizzazione e tecniche di laboratorio

Per studiare solo i microrganismi presenti nel campione e non quelli dell'aria o dell'ambiente, dobbiamo lavorare in sterilità. La sterilizzazione avviene attraverso calore, umido o secco. Il calore, quando si raggiungono elevate temperature, uccide i microrganismi. Si può usare l'autoclave per sterilizzare, aumentando la pressione e la temperatura fino a circa 121°C in poco tempo (alta temperatura, tempo ridotto). La crescita dei microrganismi è logaritmica così come la sterilizzazione, con il tempo di riduzione della carica microbica decimale (10^-6, 10^-5…).

Per il calore umido, servono 120°C, mentre per il calore secco in stufa si possono raggiungere i 160°C, con il materiale che viene sterilizzato e tenuto dentro per 2 ore. Da 160°C a 170°C, il tempo si dimezza, da 120 minuti a 60 minuti.

Per sterilizzare enzimi, vitamine (termolabili) e liquidi usiamo la filtrazione. Il liquido viene fatto passare attraverso un filtro con dimensioni di micrometri (i microrganismi sono piccolissimi) che blocca i microrganismi.

Le radiazioni ionizzanti, come raggi X e gamma, permettono di superare le barriere cellulari, colpendo il DNA e rompendolo, impedendone la replicazione. Altrimenti si possono usare radiazioni non ionizzanti, come le lampade UV, che creano legami covalenti tra timine, mutando il DNA e facendo morire la cellula.

Uso della fiamma

Noi utilizziamo la fiamma Bunsen, dove le alte temperature uccidono i microrganismi. La fiamma blu è la più calorica e ossidante, permettendo di sterilizzare; la fiamma rossa è meno calorica, riducente e NON sterilizza, si accende quando ci si allontana dal tavolo di lavoro.

Materiali di laboratorio

• Contenitore di plastica
• Rack plastico e provette in vetro
• Tappi in metallo
• Pipette sterili da 10ml
• Propipettatore (per risucchiare liquido dal contenitore nella pipetta)
• Siringa senza ago
• Filtro (da attaccare alla siringa per travasare liquido filtrato in una provetta)
• Bottiglia di vetro (con tappo NON va chiuso completamente prima di metterlo nell'autoclave)
• Anse sterili, spatola, piastre Petri, micropipetta (per volumi piccoli)
• Bilancia, piaccametro, bilancia analogica (fino a 200g) e tecnica (fino a 2kg)

Preparazione delle soluzioni

1. 20ml di soluzione con glucosio al 5% m/V: devo prendere 1g di glucosio. Peso 1g di glucosio e lo sciolgo in 20ml di acqua distillata; nel vortex sciolgo eventuali grumi. Accendo il Bunsen, apro la siringa e prendo una parte del liquido. Apro il filtro sterile rimanendo vicino alla fiamma, senza toccarlo, attacco il filtro alla siringa e apro la provetta sterile, sempre vicino alla fiamma e senza appoggiare il tappo, travaso il contenuto della siringa e chiudo per mantenere sterilità. Metto da parte la provetta sterile e il contenitore con liquido non filtrato.

2. Preparo terreni di coltura usando PCB (terreno generico) e agar-agar. Voglio 10 ml di soluzione con PCB a concentrazione di 23,5 g/L. Ne faccio due pesate (ognuna da 0,235 g), ognuna la metto in una provetta. In una provetta aggiungo anche agar-agar con concentrazione di 17 g/L (0,17 g). In entrambe le provette aggiungo l'acqua e le chiudo con i tappi in metallo, nominando una con "PCB" e l'altra con "PCB + agar". Misuro il pH delle due travasandole in un piccolo becher: PCB circa 6,46, PCB + agar circa 6,60.

3. Ho due piastre, denominate A e B. Prendo la beuta contenente PCB e passo il beccuccio velocemente sulla fiamma. Verso il contenuto nella piastra A, fino a ricoprire la superficie, prima di chiudere il tappo della beuta lo ripasso sulla fiamma. Prendo la beuta contenente PCB + agar e faccio lo stesso procedimento nella piastra B. Li lascio a riposo e noto che il terreno senza agar è rimasto liquido, l'altro si è solidificato (infatti quando li ho versati, quello con l'agar era caldo perché altrimenti sarebbe già stato solido). Prendo il liquido dell'esperimento 1 NON filtrato, prelevo 100ml con propipettatore e micropipetta, sempre vicino alla fiamma, e lo metto nella piastra A. Con la spatola spando il contenuto su tutta la superficie. La piastra non va MAI sollevata e il tappo non va appoggiato; con la sinistra tengo il coperchio e con la destra uso la spatola, chiudo il coperchio.

4. Preparazione di grammi di cloruro di sodio (NaCl) da mettere in 100ml per arrivare alla concentrazione molare di 0,015 mol: M = mol/V (L) --> g = mol x PA = 0,087 g. Faccio soluzione di 0,08 g NaCl e 100 ml acqua distillata. Prelevo con pipetta e il propipettatore 9ml e la metto in una provetta, ne prelevo 9ml alla volta fino a che non finisce (circa undici provette). Provette usa e getta sterili vicino al piano da lavoro.

Microbiologia

Definizione e importanza

La microbiologia è la disciplina che studia organismi che non si vedono a occhio nudo (meno di 0.3 mm) e che necessitano del microscopio anche per sapere come si stanno diffondendo nell'oggetto. Tutti gli oggetti vengono attaccati da microrganismi se in condizioni ambientali opportune (posizione, composizione chimica). Alcuni microrganismi hanno pigmentazioni che permettono di studiarli con la fluorescenza. Tutti gli interventi conservativi o cambiamenti nelle condizioni atmosferiche dei beni possono generare microorganismi. Hanno però anche degli utilizzi positivi. RELAZIONE ENTRO 17 GIUGNO.

Leggere articoli di laboratorio

Come leggere un articolo di laboratorio: l'autore per la corrispondenza è quello da contattare nel caso si vogliano maggiori informazioni. Sappiamo la rivista, l'anno di pubblicazione e l'indicazione del volume. I risultati vengono discussi. Ci sono 2 tipi principali di articoli: il research paper che presenta una ricerca nuova fatta da alcuni ricercatori, dagli autori del lavoro. La review dà informazioni sullo stato dell'arte per quel determinato argomento (utile per tesi).

Ricerca bibliografica

Ricerca bibliografica: cercare informazioni su un determinato argomento. Accesso alle banche dati (tante e online), si accede anche attraverso portale UNIMI. Un articolo scientifico non è un articolo divulgativo, quello divulgativo ha scopo narrativo e un'audience diversa, quello scientifico è più tecnico e strutturato. Il modo migliore per leggere un articolo: leggere prima il riassunto, poi la discussione, l'introduzione, i risultati e i metodi. Avere structured abstract: il riassunto è suddiviso in più parti: scopo del lavoro, metodi, risultati. Capire i punti principali: parole chiave, titolo, tabelle, grafici. Come fare ricerca bibliografica: uso banche dati scientifiche (Scopus) o umanistiche (AATA: aata.getty.edu).

Cellule e organismi viventi

La cellula è l'unità base di tutti gli organismi viventi; ci sono due tipi: procariota (sviluppate per prime) e eucariota. Le strutture interne delle cellule non sono le stesse, l'eucariota ha nucleo e membrana nucleare, la procariota no. Esperimenti hanno mostrato che considerando i gas presenti all'inizio della formazione della terra, e le scosse elettriche, si sono formati alcuni composti organici. L'eucariota è 10 volte maggiore della procariota.

Nell'eucariota troviamo i cloroplasti e i mitocondri. L'eucariota può avere parete o meno (nelle piante sì), mentre la procariota la ha sempre; la composizione è comunque diversa. L'informazione genetica è contenuta nel cromosoma (nella procariota uno solo), che non è circondato dalla membrana nucleare e si trova nel nucleoide.

DNA e RNA sono fatti da nucleotidi, unità base. Un nucleotide è fatto da zucchero 5C, base azotata e zucchero fosfato. Il DNA disteso è più lungo della cellula stessa, quindi si avvolge. Se formiamo nuovo DNA da una cellula si tratta del processo della replicazione, il passaggio da DNA a mRNA è la trascrizione, mentre la traduzione è il passaggio da mRNA a proteina.

Nella cellula abbiamo ribosomi, per la sintesi delle proteine, fatti da rRNA e proteine; sono composti da due subunità, e a noi interessano le subunità più piccole dei procarioti. L'RNA serve per classificare tutti gli organismi viventi, procarioti: bacteria, achaea, eukarya. Bacteria e archaea sono costituiti da cellule procariote, l'ultimo gruppo da eucariote. Ci danno relazioni tra organismi, relazioni filogenetiche. I geni possono dare origine a: mRNA che genera proteine, rRNA oppure tRNA (trasporta amminoacidi). L'rRNA è una molecola che ci serve per confrontare organismi diversi, ha delle sequenze molto conservate e altre molto variabili; fondamentale perché i tratti conservati servono per confrontare organismi molto diversi tra loro, quelli variabili per confrontare quelli simili tra loro. Andiamo a vedere la sequenza del gene che codifica per il 16S rRNA e 18S rRNA. Utilizzando questi geni possiamo mettere nell'albero filogenetico qualsiasi essere vivente. Animali, funghi e piante sono molto vicini (sono molto simili), mentre i procarioti sono molto lontani.

Biorecettività

La biorecettività è l'attitudine del materiale ad essere colonizzato da organismi viventi senza necessariamente subire un danno. La parola colonizzare è importante perché ci dice che quel microrganismo è stato lì per un po' di tempo. La colonizzazione non ha risvolti necessariamente negativi. Tutti i materiali hanno la loro biorecettività (tutti possono essere colonizzati). Dipende dal tipo di materiale e dall'ambiente che lo circonda; la chimica e la fisicità del materiale, ma anche lo stato di degrado del materiale è importante, così come la presenza di inquinanti. Sono stati fatti esperimenti inoculando a materiali diversi lo stesso microrganismo, esso si è sviluppato in modo diverso. Biomateriali uguali nello stesso ambiente ed esposizione presenteranno comunque biorecettività diversa. La biorecettività di un materiale può cambiare nel corso del tempo, e il materiale più studiato (in laboratorio o in situ) in ambito di biorecettività è la pietra (marmo di Carrara e la pietra di Lecce).

Parliamo di biorecettività primaria quando la pietra ha le stesse caratteristiche di quando è stata presa dalla cava, biorecettività secondaria quando il materiale nel corso del tempo ha subito un certo degrado chimico o fisico, quindi è diversa. La biorecettività terziaria riguarda tutte le attività umane che cambiano il modo di venire colonizzato del materiale. La biorecettività intrinseca è dovuta a particelle che si depositano sulla superficie a causa di inquinanti. Tutti gli studi sono stati fatti con lo stesso microrganismo: sono stati usati microrganismi fotosintetici inoculati su pietre esposte in un ambiente controllato, irradiate con una lampada e lasciate a temperatura costante per tre mesi. In alcuni casi si è osservata una crescita non solo in superficie ma anche in profondità, una crescita idrolitica. Una volta cresciute, queste comunità microbiche vengono studiate, per esempio osservando la presenza di clorofilla a, tramite estrazione con DMSO e analisi di fluorescenza (spettrofluorimetro); c'è una differenza tra i due metodi: con lo spettrofluorimetro non invadiamo, ma vediamo solo la crescita superficiale. Se si vuole vedere la crescita interna, è necessario usare l'estrazione di un frammento.

Esperimento di biorecettività secondaria di granito di Vazquez-Nion del 2018: sono stati utilizzati dei sali sulla pietra, in cicli di attacco, 10 cicli e poi fatta la valutazione della crescita della biorecettività del materiale (variazione peso, porosità…). Se si fa un basso numero di cicli (cinque cicli), la biorecettività primaria è molto simile alla secondaria. Se si fa un numero di cicli più elevato, la secondaria risulta diversa da quella primaria. Inoltre, le caratteristiche del materiale favoriscono o meno alcuni microrganismi dal proliferare. Articoli da leggere: Guilliette O. Bioreceptivity, a new concept for building ecology studies; Vázquez-Nion Secondary bioreceptivity of granite: effect of salt weathering on subaerial biofilm growth; Miller, A.Z., Sanmartín, Bioreceptivity of building stones: A review.

Biodeterioramento è qualsiasi modificazione indesiderata nell'aspetto e nelle proprietà del materiale dovuto all'azione di organismi viventi. Questa è una colonizzazione negativa. Trovare un microrganismo sul materiale non vuol dire che stia causando un danno. Quando parliamo di beni culturali, non usiamo il termine biodegradazione, perché abbiamo un attacco a una molecola che però porta effetti positivi, non è una colonizzazione e non parliamo di solidi (come invece nel caso della biorecettività).

Interazione tra microrganismi e materiali

L'interazione tra microrganismi e materiali, biodeterioramento, può essere di natura fisica. Microrganismi ingombranti (cellule e matrici che producono) generano delle pressioni e causano un danno meccanico nel materiale. Danni di natura chimica derivano dal fatto che i microrganismi assimilano materiali dal terreno o dal materiale, oppure causano alterazioni estetiche. Chimicamente, il materiale stesso può essere fonte di materiale per il microrganismo, che ottiene quindi energia dal substrato, oppure il microrganismo produce dei metaboliti che vengono scartati e che interagiscono con il materiale. Possono produrre acidi organici, inorganici o basi, oppure composti che hanno capacità di chelare il substrato; scambiare ioni con la superficie o rilasciare enzimi (idrolasi, enzimi che scindono un legame aggiungendo una molecola di acqua. Le idrolasi rompono legami in molecole pesanti, per esempio polimeri, dando origine a molecole di peso molecolare minore). Esteticamente, possono comparire macchie, patine, e possono ricoprire la superficie in modo molto esteso.

I colori dei microrganismi sono dovuti ai pigmenti che essi producono; le funzioni sono diverse: assorbono luce, proteggono dai raggi UV, i pigmenti non sono tipici solo degli organismi fotosintetici (interno cellula endopigmenti, secreti all'esterno esopigmenti). È difficile capire se le alterazioni su materiale sono di natura biologica o chimica.

Agenti biologici principali

Gli agenti biologici più importanti sono batteri, alghe, funghi, licheni (muschi, piante, animali). I batteri sono procarioti unicellulari di varie forme, 2-3 micron, alcuni sono capaci di produrre endospore, la divisione è binaria. Forme sferiche (cocchi), allungata (bastoncino, bacillus), ricurvi (vibrioni, solfato riduttore), irregolari (pseudo micellari, arrivano a strutture ramificate). Il batterio che si prende ad esempio è escherichia coli.

Minore è il diametro, maggiore è il rapporto superficie/volume, maggiore è la velocità di scambio con l'esterno. La riproduzione binaria avviene per replicazione del DNA, aumento delle dimensioni, separazione dei cromosomi e formazione di un setto che permette alle cellule di separarsi. Quando parliamo di crescita nei batteri intendiamo un aumento nel numero di cellule. Il tempo di generazione è il tempo che occorre alla cellula per duplicare la popolazione (20 min a 10 ore). La crescita dei microrganismi è di tipo esponenziale.

Fasi di crescita dei microrganismi in laboratorio

• Fase Lag: di adattamento, i microrganismi devono adattarsi al nuovo ambiente.
• Fase esponenziale: rappresentata da una curva esponenziale, si ha un aumento esponenziale nel numero di cellule.
• Fase stazionaria: iniziano a mancare nutrienti, il numero di cellule che raddoppiano equivale a quelle che muoiono.
• Fase di morte: i nutrienti sono sempre più scarsi, la morte supera la riproduzione.

Molti batteri possiedono capsule e strati mucosi, che non sono di importanza vitale. Sotto la capsula c'è la parete cellulare, fatta da peptidoglicano o mureina, che protegge e irrigidisce la cellula anche dalla lisi osmotica.

Colorazione di Gram

La colorazione di Gram è fatta in laboratorio. Si prende un vetrino e si mettono delle gocce (batteri in liquido), si fa evaporare l'acqua e si fissano i microrganismi al vetrino (passando la fiamma sul retro, facendoli aderire). Si aggiunge una soluzione di cristal violetto e poi ioduro, che formano un complesso che in alcuni batteri viene trattenuto, in altri no. Se viene trattenuto, la cellula diventa violetta; se non viene trattenuto, la cellula risulta ancora non colorata. Per queste ultime viene fatta un'ulteriore colorazione con un altro composto.

Nei gram positivi il peptidoglicano ha tanti strati (costituisce il 90% della parete), quindi trattiene bene il complesso cristal violetto-ioduro. I gram negativi hanno pareti diverse, con due strati: uno interno (peptidoglicano monostratificato) e una parete esterna, la membrana esterna. Non riesce a trattenere il composto violetto-ioduro e quando viene aggiunto alcol si decolora e si può usare un altro composto. Sotto la parete abbiamo la membrana citoplasmatica, fatta da un doppio strato fosfolipidico, con parte apolare interna e parte idrofilica esterna. Sotto la membrana abbiamo il citoplasma, che contiene la zona nucleoide.

Alcuni batteri, come il bacillus, creano strutture di resistenza chiamate endospore batteriche. Sono un modo di vivere dei microrganismi che permette loro di vivere in condizioni avverse, ad esempio a temperature elevate, vivendo in uno stato di quiescenza per diversi anni. Attraverso la sporulazione, quando i fattori ambientali tornano favorevoli, si ha il passaggio da spora a cellula vegetativa. Quando il batterio rilascia endospore muore.

Tipi di batteri

Nei batteri abbiamo: attinobatteri, sono gram positivi, con strutture da sferiche a pseudomicellari, resistono bene alla disidratazione e formano pigmenti di tantissimi colori, spesso in ambienti esterni. I cianobatteri sono fototrofi, fanno la fotosintesi e hanno infatti una serie di pigmenti, come clorofilla a, ficoeritrine, ficocianine e alloficocianine. Possono essere con forma concoide o filamentosa, e sono inglobati in una matrice mucillaginosa molto cospicua. Alcuni hanno gli eterocisti, con cui ricavano azoto molecolare dall'aria. Ci sono i tilacoidi (membrane sulle quali sono depositati i pigmenti, si trovano nei ficobilisomi). Sopravvivono anche in luoghi dove c'è scarsità d'acqua e hanno pigmenti protettivi da UV (scitonemina). Crescono verticalmente e orizzontalmente. Sono in grado di intrappolare agenti inquinanti, presenti nell'aria, e con cambiamenti di temperatura possono causare danni meccanici. Vivono sia in superficie sia in profondità, nonostante siano fototrofi: ci possono essere porosità nel materiale e quindi penetrano, sono euendolitici. Oppure si trovano in profondità perché il materiale è in parte traslucido e fa passare comunque luce. Sono capaci di fissare il carbonio a partire dalla CO₂. Gli archea colonizzano intensamente dove ci sono fluorescenze saline, spesso creano patine di colore rosa.

Alghe eucariote

Le alghe eucariote non hanno radici, foglie o fusti, hanno dimensioni che variano da micron a metri. Contengono i cloroplasti per fotosintesi.