Microbiologia

Microbiologia lezione 2 – 24/02/22

Nel corso dell’evoluzione possiamo individuare 3 linee di cellule microbiche dette dominio: batteri, archea ed eucarioti; quindi, tutti gli esseri viventi sono divisibili entro questi domini. Gli archea, pur condividendo molte caratteristiche con i batteri, sono in 2 linee diverse, mentre provengono dallo stesso ramo evolutivo degli eucarioti, anche se poi si sono differenziati.

Le cellule degli organismi viventi si dividono in procarioti ed eucarioti, uni e pluricellulari. Ai procarioti appartengono sia batteri che archea, non hanno membrana nucleare che racchiude il materiale genetico, quindi nemmeno il nucleo, sono quasi privi degli organuli del citoplasma, ma i pochi presenti differiscono per alcune caratteristiche tipo le dimensioni. Queste differenze sono rilevanti nell’aspetto riproduttivo delle cellule, infatti, le cellule procariote compiono una riproduzione asessuata che consegue una clonazione di sé stessa, mentre quelle eucariote mediante la meiosi, è una riproduzione sessuata.

Morfologie principali dei procarioti

Le morfologie principali dei procarioti sono: cocco (forma sferica), bacillo (forma bastoncellare), vibrione (virgola), spirillo (ondulata), spirocheta (spirale). In generale tali morfologie possono essere molto varie, nei bacilli, ad esempio, c’è molta eterogeneità di dimensioni e caratteristiche. Oppure nel caso dei cocchi, a volte anche dopo la divisione alcune sfere restano attaccate e danno origine a diplococchi (2 cocchi), o restano formando una catenella (streptococco, batterio del mal di gola), o forma a tetrade (4 insieme), sarcina (8 tipo un cubo), o ancora stafilococco (come un grappolo), in ogni caso le cellule sono indipendenti tra di loro, anche se non separate al 100%.

Involucri esterni e differenze tra Gram-positivi e Gram-negativi

Gli involucri esterni in generale sono molto simili, trovano qualche differenza tra i Gram-positivi (verdi) e Gram-negativi (blu). Nei Gram-negativi, la parete cellulare di peptidoglicano (polisaccaride della parete cellulare) è monostratificata, e presenta all’esterno una membrana ondulata per aumentare la superficie ed internamente una membrana plasmatica. Lo spazio tra le membrane prende il nome di periplasma o spazio periplasmatico, in cui possono essere presenti degli enzimi che resistono agli antibiotici. Mentre nei Gram-positivi, non c’è membrana esterna, ma sono presenti solo la parete cellulare di peptidoglicano polistratificata e la membrana plasmatica.

La struttura della membrana nei batteri è la stessa che si trova negli eucarioti, è costituita da un doppio strato fosfolipidico e proteine inserite dentro. I fosfolipidi presentano una molecola di glicerolo, legato ad un gruppo fosforico carico negativamente, e 2 code di acidi grassi mediante legame estere. Tale struttura determina una membrana esterna fortemente elettronica, e internamente a contatto con il citoplasma dà strutture cariche negativamente.

Lezione 3 - 02/03/22

I fosfolipidi che costituiscono le membrane sono costituiti da: glicerolo, un alcool con 3 gruppi OH, a 2 di questi sono esterificati (il legame estere è un legame tra OH e COOH per eliminazione di 1 H₂O) acidi grassi (acidi carbossilici), all’altro è legato l’acido fosforico (H₃PO₄), anche lui mediante legame estere. Il gruppo fosforico è protonato, infatti i suoi O presentano carica negativa, in modo che tutto sia fortemente polare, mentre le 2 catene di acidi grassi sono idrofobiche.

La catena del fosfolipide, può essere satura (sono presenti solo legami semplici) o insatura (non sono presenti solo legami semplici). Nel primo caso la struttura è abbastanza rigida, mentre nel secondo, si crea una sorta di curva che genera disordine, cioè fluidità nella membrana, questa condizione è utile ai microorganismi per sopravvivere in determinate situazioni, ad esempio in caso di basse temperature la struttura insatura è migliore e più al freddo vive l’organismo più insaturazione ci sarà.

Nella membrana cellulare degli eucarioti sono presenti degli steroli come colesterolo. Nei batteri, invece degli steroli ci sono gli opanoidi, che presentano una struttura simile, con la funzione di regolarne la fluidità. All’interno del doppio strato di fosfolipidi, sono presenti proteine, in percentuali variabili, possono essere integrali o strettamente associate alla parte eterna (estrinseche), interna.

Struttura della membrana negli archea

Gli archea hanno una struttura un po' diversa, perché possono vivere ad alte temperature e alte concentrazioni saline. È sempre presente il gruppo fosforico, ma la coda idrocarburica è sostituita da una catena isopropenica, costituendo una struttura molto compatta, che gli permette di vivere in quelle condizioni. Al centro ha sempre il glicerolo, ma il legame tra esso e la catena è un legame etere (C-O-C). Di solito la membrana è costituita da un doppio strato fosfolipidico, ma in molti casi c’è un monostrato fosfolipidico, dove le catene sono legate al centro, in questo modo è più difficile creare disordine dovuto alle alte temperature. Altre volte, invece del fosfolipide c’è il glicolipide.

La membrana cellulare ha una funzione importante per il passaggio di sostanze, negli archea, anche per la produzione di energia, in quanto a differenza degli eucarioti, non hanno i mitocondri, traduzione di segnali tra l’interno e esterno, biosintesi di componenti cellulari…

Attraverso la membrana, le molecole idrofobiche passano facilmente, perché anche le code dei fosfolipidi che la compongono sono idrofobiche; le piccole molecole polari (acqua, glicerolo, urea), hanno qualche difficoltà in più, ma essendo piccole riescono, mentre quelle più grandi come zuccheri non riescono, così come quelle dotate di cariche elettriche. Però ci sono meccanismi che mediano il trasporto.

Tipi di trasporto attraverso la membrana

Il trasporto può essere: passivo, quando non richiede energia e avviene secondo gradiente di concentrazione, cioè la sostanza passa dal comparto in cui è più concentrata a quello dove lo è meno. Attivo, richiede energia che può essere ottenuta dall’ATP o liberata dal passaggio di una certa molecola, per gradiente di concentrazione; si divide in primario (abc), in cui l’ATP viene idrolizzato e questa energia è utilizzata per il trasporto di una molecola contro gradiente di concentrazione; secondario e riguarda il passaggio di 2 molecole, una secondo gradiente di concentrazione, che libera energia e permette all’altra il passaggio contro gradiente di concentrazione, prende il nome di antiporto le molecole si spostano nel verso opposto, simporto nello stesso verso; infine traslocazione di gruppo in cui l’energia viene fornita dalla traslocazione di un gruppo fosforico alla molecola trasportata in modo da trovarsi nella cellula, nella forma fosforilata.

Simporto lattosio galattosio: il lattosio, costituito da glucosio e galattosio, entra nella cellula e viene scisso dalla B galattosidasi nelle sue componenti; il glucosio viene facilmente metabolizzato, mentre il galattosio si accumula e crea un gradiente di concentrazione, questa fornisce l’energia per far entrare il lattosio; quindi, il lattosio entra e galattosio esce.

Il passivo si divide in diffusione semplice e facilitata, nel primo caso le molecole passano senza mediatore/ trasportatore, mentre quella facilitata, continua a non richiedere energia, ma necessita di una proteina che medi il trasporto, tali proteine possono essere: porine, che creano buchi nella membrana, per permettere il passaggio, e permeasi che agganciano il substrato da un lato e lo rilasciano dall’altro, in ogni caso sono specifiche per il tipo di sostanza. L’acqua oltre a quella semplice può passare attraverso porine specifiche.

Se la diffusione è semplice, all’aumentare della concentrazione esterna della sostanza che deve passare, ci sarà un aumento della velocità d’ingresso, se invece è mediata, il limite alla velocità d’ingresso sarà dato dal limite di saturazione, cioè se tutti i trasportatori sono impegnati, non potrà aumentare la velocità, quindi sarà inizialmente più veloce, ma si arriverà in un punto in cui tutte le molecole di trasportatore sono impegnate e non potrà aumentare la velocità.

Lezione 4 - 03/03/22

La molecola di base della parete cellulare dei batteri è costituita da un groviglio di filamenti di un polisaccaride chiamato peptidoglicano o mureina, è un etero-polisaccaride, costituito da unità ripetute di 2 amminozuccheri: n-acetilglucosammina e acido n-acetilmuramico, gli zuccheri sono legati da un legame glicosidico B 1,4 cioè, il C1 di uno zucchero è legato al C4 dello zucchero di fianco, mediante un legame di tipo B, cioè i due gruppi OH sono su 2 piani diversi rispetto all’anello. Questo legame è idrolizzato dal lisozima. Nei gram-negativi, all’acido n-acetilmuramico, è legata una corta catena peptidica di 4 amminoacidi, di cui 2 nella configurazione d (normalmente si trovano nella configurazione l) e 1 non presente tra i 20 amminoacidi principali.

Negli archea invece della mureina è presente la psedumureina, costituita dall’n-acetil glucosammina legata ad un altro amminozucchero; il legame tra gli zuccheri è B1,3 non scindibile dal lisozima. Inoltre, la sequenza degli amminoacidi è diversa. Nel complesso le 2 strutture sono simili, ma non uguali.

Nei gram negativi, il legame che permette ai vari filamenti di peptidoglicano di stare uniti, è di tipo covalente e avviene tra il 3° amminoacido di una catena e il 4° dell’altra. Nei gram positivi, il legame non è diretto, ma è mediato da un pentapeptide di glicina. La presenza del pentapeptide serve a fare più spazio tra i filamenti, in modo da inserirne di più, ciò caratterizza il maggiore spessore.

Il peptidoglicano viene sintetizzato nel citoplasma, sotto forma di precursori di acido n-acetilmuramico e n-acetilglucosammina, che costituiscono un dimero. Questa struttura viene trasportata all’esterno della membrana dove sarà utilizzata per assemblare il peptidoglicano direttamente nella sua sede definitiva. Essendo grandi zuccheri fanno fatica a passare dalla membrana, quindi si legano al bactoprenolo, una molecola fortemente idrofobica costituita da 55 C. Questo si lega a 2 gruppi fosforici e poi al dimero, mediante l’acido n-acetilmuramico. Il bactoprenolo è abbastanza grande ed idrofobico, da riuscire a trasportare il dimero dall’altra parte della membrana cellulare. Tra le unità portate all’esterno della cellula interviene l’enzima transglicosidasi che crea legami glicosidici tra i dimeri per costituire il peptidoglicano, mentre l’enzima transpeptidasi crea i legami tra gli amminoacidi, per legare i peptidoglicani tra loro e costituire effettivamente la parete. Dopo aver svolto la funzione di trasportatore, il bactoprenolo, torna nella sua posizione iniziale, e continua a svolgere la funzione, finché la parete non è completa.

Se immerso in una soluzione ipotonica e trattato con lisozima, a causa di quest’ultimo, si rompono i legami della parete cellulare del batterio che perde la forma che questa gli conferiva e assume quella sferica. Dato che è ipotonica, l’acqua per osmosi tende ad entrare nella cellula, fino a farla esplodere, in quanto entra molta acqua e non c’è più la parete che la trattiene. Facendo lo stesso trattamento in una soluzione isotonica, succederà la stessa cosa, ma ovviamente non entrerà acqua, quindi non scoppierà. Questa struttura di una cellula batterica priva di parete cellulare prende il nome di protoplasto.

La maggior parte dei gram-positivi presentano esternamente alla parete cellulare (perpendicolarmente), legati covalentemente all’acido muramico, degli acidi teicoici, molecole costituite da tanti polisaccaridi e gruppi fosforici, quest’ultimi responsabili della carica negativa della parete cellulare e conferiscono specificità alla cellula. A volte sono sostituiti da acidi lipoteicoici, che mediante una porzione idrocarburica si agganciano alla membrana cellulare. Entrambi hanno funzione strutturale, conferendo alla parete forza, facilitano l’assunzione di cationi grazie alla carica negativa, sono immunogenici, cioè responsabili della reazione immunitaria, in qualche caso tipo gli streptococchi sono responsabili del meccanismo di parassiticità, perché conferiscono l’adesione alla mucosa. Nei gram-negativi non sono presenti.

Nei gram-negativi, ciò che caratterizza un microorganismo dall’altro è la presenza del lipopolisaccaride localizzato nella parte più esterna della membrana mediante una porzione lipidica, è composta anche da una parte di polisaccaridi, suddivisa a sua volta in core polisaccaridico, uguale in tutti, e legato covalentemente, il polisaccaride A, diversa nelle specie. Oltre a rafforzare la membrana, questa struttura, ha un ruolo tossico per gli animali, dovuto ad un’endotossina.

Quando si studia un microrganismo, la prima cosa che si fa è la colorazione di gram, seguita dall’analisi della sequenza dell’RNA ribosomiale 16s. La colorazione di gram si compone di diversi step; fissazione delle cellule ad un vetrino da microscopio, con un po' d’acqua, che verrà asciugata da una fiamma, le cellule indistintamente, mediante un cristalvioletto, vengono colorate di viola, si lava con acqua per eliminare l’eccesso. Successivamente si fissa la colorazione mediante lo ioduro di potassio, e si decolora con alcol, che discioglie la membrana esterna dei gram negativi che perderanno gran parte della colorazione in quanto era trattenuta da essa. Mentre la parete spessa dei gram positivi non viene sciolta, quindi mantengono il colore. Viene poi applicato un colorante rosso, safranina, e quelle bianche diventano rosse e le positive restano blu.

Oltre a quelli già visti, possono esserci degli strati ancora più esterni, di natura diversa. Negli archea, uno strato chiamato S o S-layer, costituito da glicoproteine e proteine. Non tutti gli archea hanno la membrana e presentano questo a stretto contatto con la membrana citoplasmatica o può essere l’unico strato esterno alla membrana. La funzione non è chiara, ma coinvolta nell’adesione cellulare, nel riconoscimento, e protezione. Nei patogeni può essere una protezione dall’anticorpo, perché fa fatica ad essere prodotto se c’è questo spesso strato.

Nei procarioti invece può essere presente lo strato mucoso o capsula, simili tra loro e costituiti da una struttura polisaccaridica. Se è molto compatto, tanto da impedire il passaggio di piccole particelle è una capsula, altrimenti strato mucoso, ma entrambi aderiscono bene alla parete esterna. Inoltre, dal punto di vista alimentare, la capsula è responsabile della consistenza di alcuni cibi.

Lezione 5 - 09/03/22

I flagelli sono gli organi di movimento che alcuni batteri possono avere esternamente, presenti sia nei gram-positivi che nei negativi. Possono essere monotrico (da 1 solo lato), anfitrico (entrambi i lati), lofotrico (più di uno come ciuffetti da uno o entrambi i lati) o peritrico (sparsi su tutta la superficie). Nella parte d’intersezione con la cellula, la struttura tra gram-positivi e negativi cambia, per le diverse membrane. È costituita da 3 porzioni: basale (utilizza energia per il filamento) che si inserisce negli involucri esterni, uncino una sorta di tramite tra basale e filamento, quest’ultima, si muove come un’elica. Il filamento è di natura proteica, costituito da tante piccole unità globulari di flagellina. La parte basale è costituita da diversi anelli inseriti nelle varie membrane, nei gram-positivi mancherà l’anello della membrana esterna. Questi anelli ruotano, impartendo il movimento. Se il verso è antiorario, la propulsione sarà avanti, altrimenti sarà indietro, se ci sono più di un flagello, i movimenti saranno coordinati. Il movimento avviene in seguito a degli stimoli, il più diffuso è di tipo chimico, se i nutrienti sono lontani, tende ad andare verso essi, se è in prossimità di repellenti si allontana. La risposta ad un gradiente chimico di concentrazione (cioè la spinta verso una zona più concentrata), si chiama chemiotassi. Il movimento non è lineare, ma è somma di tanti piccoli movimenti lineari, con frequenti cambi di direzione e in genere non è mai fermo. La risposta chemiotattica è un meccanismo che si compone di 3 sistemi di proteine che portano al movimento del flagello, 1 “mcp” dei recettori presenti nella membrana citoplasmatica che reagiscono con le molecole di soluto, e sono abbastanza specifiche, 2 “che” ricevono il segnale dalle mpc e lo trasmettono ad un altro tipo di proteine “che”, le più note sono le “chey” (3), che trasmetteranno il segnale al flagello, quando viene rilasciato il gradiente protonico di H⁺, che dà l’energia per la trasmissione del segnale.

Oltre al movimento chemiotattico, ci sono anche altri stimoli che innescano un meccanismo di risposta: luce (fototassi), ossigeno (aerotassi) un tipo particolare di chemiotassi, pH, alcuni microrganismi che vivono sott’acqua seguono nel loro movimento il campo magnetico della Terra, osmotassi…

Oltre al flagello ci sono altre appendici che non sono organi di movimento, presenti solo in alcuni batteri gram-negativi, si tratta di pili o fimbrie, pili strutture presenti in piccole quantità costituite dalla ripetizione di una proteina chiamata pilina, fimbrie più sottili e uniformemente distribuite,