Microbiologia: batteriologia, virologia, micologia, parassitologia

Microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia microrganismi, cioè le forme di vita invisibili ad occhio nudo. Piante ed animali si sono evoluti dai microrganismi e la loro esistenza dipende completamente dall’invisibile e vasto universo microbico, che con le sue molteplici attività determina la maggioranza dei processi chimici sulla terra.

Tipi di microrganismi

I microrganismi possono essere suddivisi in quattro gruppi: batteri, miceti o funghi, alghe e protozoi. Sono costituiti da cellule; per la maggior parte sono unicellulari, mentre alcuni formano associazioni di cellule che, tuttavia, non costituiscono sistemi integrati come i tessuti in cui si differenziano le cellule degli animali e delle piante. Questa caratteristica, riconosciuta da Hackel, consentì la prima classificazione dei microrganismi, nel regno dei Protista, come organismi privi di differenziazione tissutale ed organizzati in maniera più semplice rispetto alle piante ed agli animali.

Tipi di cellule

• Le procariotiche, più semplici e prive di compartimenti interni delimitati da membrana
• Le eucariotiche, ricche di organelli, incluso il nucleo che rappresenta il più importante carattere distintivo tra i due tipi.

Si è così stabilita una differenziazione classificativa tra Protisti inferiori (o Procarioti) a cellula procariotica, suddivisi in Eubatteri ed Archeobatteri, e Protisti superiori a cellula eucariotica (alghe, miceti, protozoi). I due tipi cellulari hanno caratteristiche funzionali comuni:

1. Sono altamente organizzate e capaci di crescere e riprodursi, ovvero contengono le informazioni ereditarie in una molecola di DNA che viene trasmessa alla discendenza. L’espressione dei caratteri contenuti nel DNA avviene attraverso i processi di trascrizione e traduzione.
2. Sono in grado di ottenere energia da diverse fonti ed utilizzarla per trasformare nutrienti in materiale cellulare (metabolismo).

Virus

I virus sono privi delle strutture necessarie alle funzioni vitali e dipendono, per la loro replicazione, da cellule viventi che forniscono energia, molecole e strutture, che li rende parassiti endocellulari obbligati. Sono costituiti da un acido nucleico (DNA o RNA), contenuto in un involucro proteico che, una volta all’interno di una cellula, assume la direzione delle sue attività metaboliche e dirige la replicazione dell’intero virus.

Domini cellulari

L’analisi della sequenza dei geni dell’RNA, dai batteri alle piante e animali, ha consentito di evidenziare come tutti gli organismi si siano evoluti da una comune cellula progenitrice. Le cellule possono essere distinte in tre domini:

• Bacteria o Eubacteria (procariote): comprendono i microrganismi più comunemente presenti in ambienti acquatici e nel suolo e gli agenti responsabili di malattie degli organismi multicellulari.
• Archaea (procariote): comprendono microrganismi molto specializzati fisiologicamente che risultano capaci di vivere in ambienti caratterizzati da condizioni estreme, come valori particolari di temperatura, pH, concentrazione salina, nutrienti, ecc.
• Eucarya: comprende tutte le cellule eucariotiche e, quindi, miceti, alghe e protozoi, piante e animali.

Si deve a Roger Stainer la suddivisione del regno dei protisti in procarioti ed eucarioti, per le importanti differenze dal punto di vista strutturale e metabolico. Gli eucarioti posseggono strutture che risultano assenti nei procarioti, come l'involucro nucleare, l'apparato di Golgi ed il RE, o presenti ma con differenze, come i ribosomi. Un'altra differenza consiste nella possibilità da parte degli eucarioti di assunzione di materiale nutritizio attraverso la membrana, mentre nei procarioti l'assunzione avviene attraverso pori di natura proteica. Infine nei procarioti la riproduzione avviene di norma in via asessuale per fissione binaria o per formazione di spore, mentre negli eucarioti si riscontrano fenomeni di sessualità.

Cellula batterica

I batteri sono organismi unicellulari e rappresentano gli organismi più piccoli in grado di autoduplicarsi. Infatti, le dimensioni sono piuttosto ridotte (1μ circa), anche se variano da specie a specie. In base alla forma, i batteri si possono classificare in:

• Cocchi, con forma sferica
• Bacilli, con forma cilindrica. La forma dei due poli terminali può essere ad angolo retto oppure arrotondata o affusolata, queste differenze morfologiche indicano batteri di tipo diverso e classificabili in modo diverso.
• Coccobacilli, con forma variabile da tonda ad ovalare ad allungata
• Vibrioni, bastoncelli ricurvi su un solo piano, a forma di virgola, con un lungo flagello polare
• Spirilli o spirochete, ricurvi su più piani. Il più noto è Treponema pallidum.

La cellula batterica è costituita da strutture obbligatorie, cioè nucleoide, citoplasma, membrana citoplasmatica, mesosomi (solo nei Gram+), parete cellulare, e strutture facoltative, cioè capsula o glicocalice, flagelli o ciglia, pili e fimbrie.

Strutture della cellula batterica

• Citoplasma

  È una massa granulare composta principalmente da acqua, in cui sono disciolti ioni, sostanze organiche ed inorganiche. Ad esempio, glicogeno come materiale di riserva; lipidi (acido poli-β-idrossibutirico); polisaccaridi (amido e amilopectine). Sono, inoltre, presenti ribosomi e plasmidi. I ribosomi tendono ad addossarsi alla membrana citoplasmatica, a causa dell’assenza del RE. Sono ribosomi di 70s (50s+30s le singole subunità) e sono costituiti per il 60% di RNA e per il 40% di proteine. Sono deputati alla sintesi proteica. I plasmidi sono frammenti di DNA extracromosomico liberi nel citoplasma.

• Nucleoide

  Non è delimitato da involucro nucleare. Contiene il materiale genetico, costituito da un solo cromosoma (aploide) chiuso ad anello, formato da DNA a doppia elica. Inoltre è complessato con polianine (proteine simili agli istoni delle cellule eucariotiche) che servono a neutralizzare il ph acido dell’acido nucleico e a proteggerlo da variazioni di temperatura. La sua posizione nella cellula è centrale ma, non essendo legata al RE, fluttua nel citoplasma e si sposta a seconda delle fasi di duplicazione.

• Mesosomi

  Sono maggiormente presenti nei batteri Gram+. Strutture formate da microtubuli e microfilamenti presenti in invaginazioni della membrana cellulare, ed il fatto che essi tendano a formarsi in zone specifiche della membrana, suggerisce che esistano delle precise porzioni di essa con particolari specializzazioni funzionali e strutturali. Le funzioni che svolgono i mesosomi sono:

  • Intervengono nelle prime fasi della duplicazione del DNA
  • Trasportano i due DNA ai poli o agli emisferi delle cellule neoformate
  • Intervengono quando il batterio deve dividersi formando il setto trasverso: dopo la duplicazione del DNA, due mesosomi opposti all’altezza della linea equatoriale della cellula si accrescono seguendo una linea retta fino ad incontrarsi, separando le due cellule neoformate
  • Intervengono nella formazione delle spore
• Membrana citoplasmatica

  Formata da un doppio strato fosfolipidico, nel quale sono immerse proteine e colesterolo. I lipidi che si trovano all’interno di essa sono: fosfolipidi, amminoacidi esterificati con glicerolo, acidi grassi a catena ramificata e derivati del ciclopropano. Per quanto riguarda le proteine che si trovano all’interno di essa possono essere integrali, cioè attraversano lo strato lipidico da una parte all’altra, o periferiche.

  La sua funzione principale è quella di separare l’interno della cellula dall’esterno, ma svolge anche altre importanti funzioni:

  1. Ritenzione del contenuto cellulare
  2. Controllo degli scambi metabolici con l’ambiente esterno per diffusione passiva (ossigeno e acqua) e per trasporto attivo (permeasi)
  3. Sito di attività metaboliche grazie alla presenza di: enzimi biosintetici che catalizzano la sintesi dei lipidi di membrana, peptidoglicano, acidi teicoici, lipopolisaccaridi, ecc.
  4. Proteine respiratorie: intervengono nella generazione di ATP durante il trasporto di elettroni.
  5. Secrezione di enzimi extracellulari (Penicillin Binding Proteins) e altre proteine.
  6. Barriera osmotica

  Sulla superficie della membrana sono presenti recettori di origine proteica che legano molecole in grado di attivare specifiche funzioni. Le penicillin binding proteins (PBP) rivestono un ruolo fondamentale per il mantenimento fisiologico della cellula e della sua integrità strutturale.

• Parete cellulare

  La parete cellulare è differente nei Gram+ e nei Gram-, infatti nei Gram+ lo strato dei peptidoglicani è spesso e si trova dopo la membrana ed è legato ad altri polimeri (come gli acidi teicoici); nei Gram- dopo la membrana vi è uno spazio detto periplasma dentro il quale vi è un sottile strato di peptidoglicani, esternamente si trova una la membrana esterna che fornisce ulteriore protezione.

  Il peptidoglicano è l’unità strutturale della parete, è composto da due lunghe catene di 2 amminozuccheri: l’N-acetilglucosammina (NAG) e l’acido N-acetilmuramico (NAM), unite tra loro da legami 1-4 beta-glicosidici. Gli amminoacidi legati al NAM sono:

  • L-alanina
  • Acido D-glutammico
  • L-lisina (nei Gram+) o acido mesodiaminopimelico DAP (nei Gram-).
  • D-alanina
  • D-alanina

  Nel caso della L-lisina o DAP, devono sempre possedere due gruppi amminici per potersi legare con il gruppo carbossilico della D-alanina. La sintesi del peptidoglicano avviene in diverse fasi:

  1. L’amminoacido glutammina dona un gruppo amminico allo zucchero fruttosio-6-fosfato, trasformandolo in glucosamina-6-fosfato. L'acetil-Coenzima A trasferisce un gruppo acetile consentendo la formazione della N-acetilglucosamina-6-fosfato, che a sua volta, viene isomerizzata a N-acetilglucosamina-1-fosfato. La N-acetilglucosamina-1-fosfato (NAG) si unisce all'uridintrifosfato (UTP) con perdita di un pirofosfato e conseguente formazione di NAG-UDP.
  2. Il complesso NAG-UDP viene trasformato dal fosfoenolpiruvato (PEP) e dall'NADPH nel cosiddetto Nucleotide di Park, composto da UDP e acido N-acetilmuramico (NAM).
  3. Al gruppo carbossilico del NAM vengono aggiunti gli amminoacidi L-alanina, acido D-glutammico e L-lisina, che nei Gram- è sostituita dall'acido mesodiaminopimelico (DAP). Infine vengono attaccate al tripeptide due D-alanine, formate a partire dalla L-alanina tramite la D-alanin-racemasi. Si forma così una molecola di UDP-NAM-pentapeptide.
  4. Questo complesso viene trasferito sul bactoprenolo fosfato, un trasportatore lipidico presente nella membrana citoplasmatica. Il legame con questo trasportatore porta al rilascio di UMP e alla formazione del complesso NAM-pentapeptide-bactoprenolo-P-P che è detto "lipide I".
  5. Successivamente anche il UDP-NAG viene legato al bactoprenolo: in questa fase si forma il legame β-1,4 glicosidico tra i due zuccheri e si ha rilascio di UDP. Il complesso NAG-NAM-pentapeptide-bactoprenolo-P-P è detto "lipide II" e contiene l'unità fondamentale del peptidoglicano.
  6. Una volta trasportato sul versante periplasmatico della membrana cellulare, il NAG-NAM-pentapetide andrà ad aggiungersi alle altre unità strutturali della mureina, grazie all'enzima transglicosilasi, che porterà alla formazione di legami β-1,4 glucosidici NAM-NAG-NAM-NAG. L'enzima transpeptidasi è invece responsabile dei legami crociati tra la quarta D-alanina e il terzo amminoacido adiacente. Poiché al di fuori del citoplasma non vi è ATP, la reazione dovrà trarre energia dal distacco della quinta D-alanina dal pentapeptide. Nei batteri Gram- la D-alanina si lega direttamente al DAP mentre nei Gram-positivi il legame con la L-lisina avviene con l'interposizione degli amminoacidi specifici.

  Gli enzimi coinvolti sono:

  • PBP (Penicillin Binding Proteins) e sono enzimi a doppia testa.
  • Transpeptidasi: effettua il legame crociato tra tetrapeptidi
  • Transglicosilasi: effettua il legame glicosidico tra i dimeri di zuccheri
  • Carbossipeptidasi: libera la D-alanina terminale da un pentapeptide
  • Endopeptidasi: scinde il legame crociato (terminale tetrapeptidico libero)
  • Autolisine, in grado di degradare la vecchia parete.

  La parete cellulare svolge moltissime funzioni:

  • Protezione meccanica e chimica
  • Conferimento della forma
  • Trasporto di sostanze, attraverso le porine nei Gram- e attraverso le maglie del peptidoglicano nei Gram+
  • Funzione immunitaria, poiché sono presenti sulla superficie molecole di riconoscimento specifico da parte dell’ospite
  • Funzione di virulenza
  • Funzione di ancoraggio per alcune strutture cellulari (flagelli) o di adesioni a superfici (pili e fimbrie)
  • Metaboliche
  • Responsabile della colorazione di Gram che consente la colorazione dei Gram+ e Gram-.

  Per eseguire questo esame di laboratorio servono: cristal violetto (è un colorante antimicotico), Lugol (è un colorante per marcare alcune strutture cellulari, a soluzione iodata a base di alcol e acetone) e Safranina (è un colorante basico). Prima di procedere alla colorazione di un materiale nel quale si vuole evidenziare la presenza di batteri, è necessario deporre una piccola parte di questo materiale su un vetrino e fissarlo con il calore. Il procedimento è:

  1. Sul vetrino si mette una goccia d’acqua, poi con l’ansa si preleva la colonia dal terreno di cultura e viene stemperata sul vetrino (sospensione batterica su vetrino)
  2. Si fissa il vetrino su fiamma per inattivare gli enzimi
  3. Si aggiunge il cristal violetto e si lascia agire per un minuto, poi si lava il vetrino. Tutte le cellule si coloreranno di viola
  4. Si aggiunge il Lugol e si lascia agire per un minuto e mezzo, poi si lava il vetrino. Le cellule rimangono viola
  5. Si aggiunge il decolorante e si lascia agire per circa 20 secondi. Le cellule Gram+ rimarranno viola, le cellule Gram- perdono il colore viola e saranno, quindi, incolore.
  6. Si aggiunge la safranina e si lascia agire per 1/2 minuti, si effettua un ultimo lavaggio. Le cellule Gram+ rimarranno viola, mentre le cellule Gram- avranno una tonalità da rosa a rosso.

  Il lugol è importante perché è un composto che si lega con le molecole del cristal violetto e forma con esso un complesso che viene trattenuto dalla parete dei Gram+ anche dopo aver effettuato il trattamento con il decolorante. Invece questo complesso non viene trattenuto nella parete dei Gram- perché nella loro parete cellulare si trovano minori quantità di legami crociati del peptidoglicano, rispetto alla parete cellulare dei Gram+ che ne possiede di più; in questo modo, i Gram- non trattenendo il complesso formato dal cristal-violetto con il lugol, quando viene aggiunta la safranina i Gram- si colorano di rosso.

• Acidi tecoici

  Presenti solo nella parete cellulare dei Gram+. Sono polisaccaridi di acidi costituiti da unità ripetute di glicerolo-fosfato o di ribitolo-fosfato, legati covalentemente al peptidoglicano fino a costituire in alcuni casi il 50% della parete, ma non sono indispensabili ai fini della rigidità; servono probabilmente anche a stabilizzare strutturalmente il peptidoglicano. Talvolta sono acidi lipoteicoici, la cui componente lipidica è inserita nella membrana citoplasmatica, fungendo quindi da legame tra la parete cellulare e la membrana citoplasmatica. Rappresentano i principali antigeni di superficie dei batteri Gram+ e, inoltre, influiscono sul passaggio di ioni attraverso la parete per la presenza di numerose cariche elettriche, regolarmente orientate.

• Membrana esterna

  Essa è presente solo nei batteri Gram-, dove è ancorata stabilmente al peptidoglicano, il cui spessore è di molto inferiore a quello dei Gram+, ed è immerso in un piccolo spazio periplasmatico. È una struttura bilaminare asimmetrica composta, nello strato più interno, da fosfolipidi e, nello strato più esterno, da un glicolipide complesso, chiamato Lipopolisaccaride (LPS). Inoltre, è presente una lipoproteina che svolge un’importante funzione di collegamento tra ME e tra amminoacidi terminali della proteina con l’acido peptidoglicano, mediante legami covalenti mesodiaminopimelico del peptidoglicano. Il LPS rappresenta l’antigene somatico gruppo-specifico nell’ambito di una specie (antigene O) e contiene una porzione tossica, il lipide A, che svolge funzione di endotossina e pertanto svolge una funzione importante nella patogenicità dei Gram-. In particolare:

  • L’antigene O- (nella parte più esterna) è un polisaccaride costituito da zuccheri semplici disposti in sequenze ripetute a formare delle molecole con caratteristiche peculiari per ogni specie batterica.
  • Il core (in posizione intermedia) che rappresenta una struttura meno variabile e importante rispetto all’antigene O.
  • Il lipide A (nella parte più interna, inglobato nella membrana), costituito da acidi grassi legati a un dimero di glucosamina. Il lipide A viene liberato in seguito alla lisi della cellula e a quel punto esplica la sua funzione antigenica, attivando il processo infiammatorio.

  La liberazione del LPS attiva il rilascio di citochine che hanno lo scopo di aumentare la risposta infiammatoria acuta locale e potenziare l’eliminazione dell’infezione. Con livelli molto alti di LPS in circolo (nel caso di infezioni gravi) e il conseguente aumento della cascata di citochine, si manifestano gli effetti tossici tipici del LPS che comprendono febbre, danno endoteliale con attivazione della coagulazione che culmina con la CID, emorragie interne, ipotensione, shock e morte. Il test del Limulus viene attuato per identificare le endotossine, sfruttando gli amebociti che si trovano nel Limulus polyphemus, questi in presenza delle endotossine coagulano e la formazione di un gel stabile indica la presenza di endotossine nel campione esaminato.

  All’interno della membrana esterna vi sono anche le porine, cioè complessi proteici che funzionano come canali preferenziali per il passaggio di porzioni molecolari.