Metodi microbiologici rapidi e microbiologia predittiva

Identificazione dei microrganismi e caratterizzazione intraspecifica

Da microrganismi contati e isolati estrarre DNA e tecniche molecolari finalizzate a identificare microrganismi.

Identificare = definire la specie microbica a cui appartiene (la specie include il genere).

Applicare il concetto di individuare le specie e altre tecniche per identificare il ceppo. (caratterizzazione intraspecifica)

Ceppo = individui all’interno della stessa specie; microrganismi che hanno caratteristiche simili (stessa specie), ma caratteristiche diverse individualmente (caratterizzazione intraspecifica, sotto al livello di specie), es. stessa specie uomo, ceppo uomo-donna.

Molto importante nel settore alimentare: molte caratteristiche sono ceppo-specifiche (importante distinguere un ceppo dall’altro).

Microrganismi = popolazioni microbiche; interesse è di studiare quello che accade negli alimenti andando a considerare le popolazioni microbiche, ovvero l’insieme di diverse specie presenti nella matrice.

M2 – Introduzione

Applicazione metodi microbiologici rapidi nel settore alimentare: conoscenza in tempi brevi permette ad OSA di valutare sicurezza e qualità microbiologica e di intervenire qualora vengano registrati parametri non conformi a normativa vigente.

Questa sicurezza si applica a tutto il processo produttivo, assicurare e verificare questi aspetti in tutto il processo, partendo dalle materie prime, durante il processo di produzione fino ad arrivare all’alimento finito, pronto per il consumo. Alimento finito può rimanere a disposizione del consumatore per un certo periodo di tempo (shelf life).

Acquisizione di queste conoscenze importante per garantire sicurezza a partire da materie prime fino a prodotto finito, lungo tutto il processo produttivo.

Ricerca continua di nuove metodiche rapide!

Alimento: definizione

Qualsiasi sostanza ingerita che serve per ottenere energia (definizione più generica), definizione giuridica 2002: qualunque sostanza o prodotto trasformato o non (parzialmente trasformato o non trasformato) destinato ad essere ingerito o che si prevede ragionevolmente che possa essere ingerito da essere umani. Comprese bevande, gomme da masticare e qualsiasi sostanza, compresa acqua, intenzionalmente incorporata negli alimenti nel corso della loro produzione, preparazione o trattamento.

Importante per la salute del consumatore è avere una dieta bilanciata (alimentazione corretta), comportamenti alimentari corretti, ma la cosa più importante è di avere alimenti sicuri. O esiste corretta alimentazione senza alimenti sicuri.

Alimenti sicuri: non nuociono alla salute del consumatore; garanzia che non abbia effetti negativi e/o non siano pericolosi per la salute del consumatore.

In inglese sicurezza alimentare è food safety (non confondere con food security = sicurezza degli approvvigionamenti), inteso come assenza di patogeni o garanzia che comunque alimento non abbia effetto su salute consumatore. Sicurezza microbiologica indica assenza o presenza in limiti di legge di m.o. patogeni o metaboliti tossici, inclusi microrganismi ma anche loro prodotti del metabolismo.

Intossicazione: dovuta a tossine prodotte da metabolismo microbico (infezione invece deriva da proliferare di microrganismi all’interno del corpo umano).

Necessità di metodi per verificare assenza microrganismi patogeni e metaboliti tossici.

L’unico patogeno per il quale è ammesso in alimento concentrazione numerica (anziché assenza) è Listeria monocytogenes, tutti gli altri devono essere assenti in 25 g alimento solido.

EFSA e sicurezza alimentare

EFSA: organismo deputato a garantire sicurezza alimenti, sede a Parma.

Agenzia europea istituita nel 2002 dal Parlamento UE e del consiglio ma svolge il suo compito indipendentemente dalla commissione UE. Compito in maniera autonoma, finalità di esprimere pareri basati su articoli scientifici e report per assumere decisioni rapide e tempestive qualora si verifichino situazioni a rischio per salute consumatori; periodicamente gruppi di lavoro che si occupano di problematiche specifiche (patogeni emergenti, OGM, pesticidi, ecc.; tanti aspetti, ogni gruppo prende in considerazione articoli scientifici e raccolte dati per fotografia in tempo reale sulla sicurezza alimentare; in situazioni a rischio interviene) realtà molto utile e dinamica che prima non era previsto.

Sfera di competenza dell’EFSA a 360°: sicurezza alimenti e mangimi ma anche benessere animale e salute piante (tutto ciò che può diventare alimento).

Interventi che EFSA porta avanti vengono pubblicati su EFSA Journal, in cui vengono riportati i vari studi effettuati, ad esempio qui vediamo cosa è successo nel 2013 in cui sono stati riportati casi di intossicazione alimentare legati a prodotti di origine animale e non animale: dal 2007 al 2001: incremento consistente in prodotti di origine non animale: analisi dettagliata: aumentato anche numero di ospedalizzazioni: nel 2001 infatti c’è stato caso partito da Germania legato a consumo di semi germogliati contaminati da ceppi di E. coli.

Listeriosi = patologia legata a presenza di Listeria monocytogenes (patogeno per il quale è ammessa una concentrazione).

Microrganismo che non determina frequentemente patologie ma quando le determina può arrivare a effetti letali, specialmente in alcune categorie di persone (donne incinta o persone che presentano immunodeficienza).

Hamburger: problemi legati alla presenza di E. coli O157:H7 singolo ceppo che ha caratteristica di produrre tossine. All’interno della specie E. coli ci sono ceppi monitorati negli ultimi anni di particolare attenzione perché producono tossine importanti che possono determinare anche effetti letali soprattutto nei bambini. Importanza di distinguere il singolo ceppo. E. coli è microrganismo che normalmente è associato all’intestino (2 ceppi dannosi).

Richiamo di alcune caramelle gommose dovuto alla presenza di Salmonella. A differenza degli altri qui c’è scritto solo Salmonella: in questo caso si parla solo di genere, sono tutte pericolose. Qualunque specie di salmonella è pericolosa! (Salmonella spp.) infatti deve essere assente in 25 g di prodotto.

Salmonella non solo in matrici di origine animale: 2014 richiamo origano spezie! Hanno superficie molto esposta, possono essere molto contaminato.

Botulismo (possibile caso di botulismo).

Listeria monocytogenes tipica degli alimenti ready to eat.

Altro richiamo per Listeria grazie ai controlli routinari.

Migliorare la cultura della sicurezza alimentare: istruire OSA: sapere quali sono i problemi sulla sicurezza alimentare (rischi associati al consumo) per produrre e fornire alimenti sicuri.

Lavoro scientifico su conoscenza dell’igiene alimentare: 56% risposte corrette con elevata % di risposte errate su controllo della temperatura e fonti di contaminazione.

Sicurezza e qualità degli alimenti

Sicurezza: presenza entro certi limiti o assenza di determinati microrganismi.

Qualità degli alimenti: aggettivo che include anche assenza o presenza in limiti di legge microrganismi che determinano alterazione degli alimenti e quindi che alterano la qualità dell’alimento. Questi microrganismi o devono essere assenti o devono rientrare nei limiti determinati dalla normativa. Oppure direttamente legata alla presenza di determinati microrganismi, microrganismi coinvolti nel processo produttivo (es. vino, yogurt, crauti, prodotti fermentati principalmente in cui m.o. hanno ruolo fondamentale).

Qualità microbiologica: comprende anche caratteristiche nutrizionali.

Qualità influenza tutto il periodo di conservazione di un alimento (shelf life).

Classificazione dei microrganismi in base al ruolo

Microrganismi classificati in base al loro ruolo:

• Virtuosi: ruolo importante nel determinare caratteristiche negli alimenti, produzione di alimenti, grazie a loro caratteristiche metaboliche.
• Patogeni: determinano danni alla salute del consumatore, legati al m.o. stesso o alla produzione di un metabolita (tossina), infezioni, intossicazioni e tossinfezioni (presenza sia m.o. che metabolita).
• Alteranti: effetti negativi su caratteristiche organolettiche.

In tutte e 3 le categorie di m.o. può essere interessante arrivare anche al ceppo, non solo alla specie.

Principale scopo per cui m.o. si trovano in alimento è moltiplicazione cellulare: capire sempre qual è ambiente in cui m.o. si trova: cosa può fare in questa matrice alimentare? Quali caratteristiche possono interessare al m.o.?

Bisogna innanzitutto conoscere l’alimento, caratterizzare matrice alimentare in cui andiamo a cercare i m.o. per capire cosa può accadere ai m.o. e se la matrice permette il loro sviluppo e quindi la loro moltiplicazione cellulare.

Ricordarsi che in alimento il m.o. tende a distribuirsi in maniera disomogenea, specie in alimenti solidi.

Matrice solida: campionamento è importantissimo. (non posso analizzare tutto il lotto! Il risultato che ottengo deve potersi estendere a tutto il lotto) Rappresentativo.

Possibilità di avere zone in cui m.o. crescono meglio (microhabitat).

Principalmente ricerchiamo batteri, lieviti e muffe ma ci sono altri microrganismi come alghe, parassiti e virus.

Fonti di contaminazione dei microrganismi negli alimenti

• Contaminazione primaria: microrganismi già presenti nell’alimento (es. frutta e verdura presentano già m.o. sulla superficie, alimenti di origine animale contaminati da m.o. su pelle peli piume che contaminano macellazione).
• Contaminazione secondaria: microrganismi presenti nell’ambiente e arrivano all’alimento durante la lavorazione diverse fonti: acqua, aria, suolo, operatore, macchine, contaminazioni crociate (es. contaminazione di alimento cotto da microrganismi presenti in alimento crudo, es. coltello usato per pollo crudo, non lavato e usato per verdure).
• Contaminazione terziaria: si verifica durante la conservazione.
• Contaminazione quaternaria: in prodotti già pronti durante la fase di consumo (rilevanti quelli nella ristorazione collettiva).

Indipendentemente dal tipo di contaminazione il numero e la tipologia dei microrganismi può variare molto.

Tante fonti di contaminazione:

• Suolo: E. coli ed enterobatteri.
• Acqua: non usata solo in alimento, ma anche in impianti per lavaggio macchine ecc., garantire sempre qualità microbiologica dell’acqua, specialmente se deriva da pozzi e non proviene dall’acquedotto.
• Aria: analisi dell’aria; muffe e batteri gram positivi.
• Uomo: addetti del processo produttivo, contaminazione alimenti con mani (frequente presenza di m.o. che si trovano nel tratto gastrointestinale o cavità orale, scarsa igiene dell’operatore in questione).
• Macchine/utensili/superfici: tutto ciò che è utilizzato durante il processo produttivo può essere fonte di contaminazione.
• Contaminazioni crociate derivanti dall’utilizzo di utensili usati tra prodotti crudi e cotti.

Temperatura di conservazione è fattore importante.

Attenzione: indagine su superfici frigoriferi domestici: rilevati m.o. perché la temperatura dei frigoriferi domestici è > di 4° (7-8° normalmente) attenzione a sviluppo di microrganismi resistenti alle temperature e a prodotti ready to eat.

Controllo di tutto il processo produttivo, lungo tutta la filiera per certificare la sicurezza.

Microrganismi virtuosi e QPS

Microrganismi virtuosi: utilizzati nel processo produttivo (es. starter: servono per indurre fermentazioni, microrganismi selezionati introdotti volontariamente per indurre fermentazioni in un prodotto) questi microrganismi devono essere sicuri.

EFSA: QPS: presunzione qualificata di sicurezza, valutare la sicurezza degli agenti biologici (ogni anno lista microrganismi considerati sicuri).

2013: escluse muffe e funghi filamentosi (per possibile produzione di tossine) problema delle micotossine sono pericolose (limiti molto bassi) perché riconosciute come sostanze cancerogene (a differenza di amine biogene, es. istamina in prodotti ittici per cui esiste un limite, ma per le altre non ci sono limiti di legge).

2016: abstract dell’ultimo report dell’EFSA: microrganismi QPS utilizzati negli alimenti (es. batteri lattici).

Primo passo per QPS è identificazione! Importante trovare un linguaggio comune per tutta la comunità scientifica…

QPS in America è GRAS (Generally Recognized As Safe).

2012: articolo che mette in evidenza tutti m.o. impiegati nelle fermentazioni dei prodotti alimenti (sia animali che vegetali).

EFSA per definire sicuro un microrganismo:

1. Capire chi sono questi microrganismi.
2. La presenza di questi microrganismi determinano una funzione nutrizionale dell’alimento.

Nutrition and health claims (qualunque indicazione che affermi, suggerisca o sottintenda che un alimento abbia particolari proprietà nutrizionali e effetti sulla salute).

Es. fermenti vivi nello yogurt o nel latte fermentato migliorano la digestione del lattosio purché l’alimento contenga almeno 10 all’8 di microrganismi vivi per grammo (il claim è fattibile solo se si verifica questa condizione), mentre no relazione causa effetto tra uso probiotici e difesa contro m.o. patogeni gastrointestinali (claim che invece veniva largamente utilizzato).

Sempre parlando di probiotici, esempio: non è stata provata relazione causa effetto tra consumo probiotici e supporto alle difese immunitarie, ministero della salute ha chiarito che funzione positiva dei probiotici è di favorire l’equilibrio della flora batterica intestinale (almeno un miliardo di cellule vive al giorno).

Microrganismi virtuosi, requisiti:

• Devono essere QPS.
• Devono avere l’indicazione della quantità necessaria per avere l’effetto benefico.
• Deve essere riportato in etichetta.

Claim: importanza di metodi per quantificare microrganismi presenti in alimenti, applicare il più possibile delle tecniche rapide (maggiore velocità analisi, più tempestivo è intervento).

M3 – Regolamenti CE e piani di campionamento

In base a cosa posso dire se prodotto o fase del processo è conforme o meno? Normativa che stabilisce criteri microbiologici.

Normativa vigente: disponibile come file pdf e consultabile nel materiale.

Regolamento principale, punto di riferimento per valutare la conformità di alimento è regolamento 2073/2005, entrato in vigore in Italia dal 2006.

La più grande novità è che regolamento prevede adeguamento in continuo alle nuove informazioni che si ottengono con studi scientifici e nuove conoscenze.

Negli ultimi 10 anni infatti il regolamento ha subito modifiche, 2 importanti: 1 indicata nel 2007 recepita a gennaio 2008 e l’altra fatta nel 2013 e recepita a luglio 2013, con riferimento ai casi (germogli) che si sono manifestati e che hanno evidenziato criticità che prima non si erano manifestate.

Regolamento 2073/2005: criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari: microrganismi o metaboliti (tossine) in quantità tali da rappresentare un rischio per il consumatore va a definire m.o. da tenere in considerazione, quali sono tossine da tenere in considerazione e quali sono i limiti.

Anche quali sono alimenti a cui si applicano questi criteri: elenco, ma presenti tutti praticamente.

• Prima attenzione ad alimenti pronti per lattanti e alimenti pronti a fini medici speciali (particolari categorie) attenzione particolare a questa classe di consumatori perché hanno un sistema immunitario non completamente sviluppato e sono quindi più soggetti ad eventuali patologie.
• Alimenti pronti diversi dal punto 1 che possono essere (o meno) terreno favorevole alla Listeria monocytogenes.
• Carni e prodotti a base carne.
• Latte e prodotti lattiero-caseari.
• Prodotti a base uova.
• Prodotti della pesca (prodotti ittici).
• Ortaggi e frutta e prodotti derivati.
• Semi germogliati.
• Gelatina e collagene.

Criterio microbiologico = criterio che definisce accettabilità dell’alimento o di una fase del processo produttivo (assicurare assenza rischi non solo in prodotto finito ma anche in fasi processo produttivo), in base all’assenza, alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla quantità delle relative tossine/metaboliti per unità di massa/volume/area/partita.

Se alimento è liquido si esprime concentrazione m.o. in base a volume, se alimento è solido o semisolido si definisce su g; sia per determinazione della concentrazione sia per eventuale presenza o assenza riferimento a stato fisico dell’alimento.

Si parla di area perché non solo si analizza l’alimento nelle sue fasi di trasformazione ma anche superfici di lavoro, attrezzature di lavoro e area stessa come edificio.

Analisi campione: in base a giudizio su campione si va ad estrapolare giudizio su intero lotto o partita:

• Lotto: quantità identificabile di alimento prodotta e manipolata sotto condizioni uniformi in un periodo limitato di tempo (es. nel corso di un turno lavorativo).
• Partita: gruppo o serie di lotti ottenuti mediante determinato processo in circostanze praticamente identiche e prodotti in un determinato luogo entro un periodo più lungo (ma comunque definito), più lotti costituiscono una partita.

2 categorie: [criterio microbiologico: indicazione che riguarda o concentrazione microrganismi da ricercare o assenza di determinati microrganismi e/o loro metaboliti + come procedere, metodiche analitiche da seguire per il risultato e come effettuare campionamento concetto ampio].

• Criteri di sicurezza alimentare applicati al prodotto finito, immesso sul mercato (prodotto o partita); prodotto finito, analizzato per criteri di sicurezza prodotto finito è accettabile o no.
• Criteri di igiene di processo valutare se le fasi del processo produttivo sono idonee o meno, vedere se tutto il processo produttivo è accettabile prima che il prodotto venga immesso sul mercato e distribuito (a monte della catena di produzione).

Questi criteri sono utili per andare a definire eventuali misure correttive che devono essere messe in atto per raggiungere un’accettabilità del prodotto finito.

In entrambi