Laboratorio di Biologia molecolare

Lez 1. 9/2 Introduzione

Per rispondere a una domanda scientifica si possono usare due approcci complementari con strumenti differenti:

• Approccio sperimentale (laboratorio): pipette, DNA, RNA, proteine, macchinari; qui si fanno esperimenti concreti per osservare e misurare i fenomeni biologici.
• Approccio computazionale: analisi delle sequenze, confronto dei dati, predizioni strutturali 3D; questo permette di studiare le strutture delle proteine o dei complessi proteici, fondamentali per capire i meccanismi molecolari.

I due approcci si completano e insieme danno una visione completa della biologia molecolare, non esiste una regola fissa che imponga di passare dall’esperimento alla parte computazionale o viceversa. Di solito il processo funziona come un ciclo, in cui i due approcci si completano a vicenda.

• Dal biologico al computazionale: si parte da un esperimento, poi i dati raccolti vengono analizzati o modellizzati al computer per capire meglio i risultati.
• Dal computazionale al biologico: si parte da simulazioni o modelli al computer, che generano previsioni, e poi queste vengono verificate tramite esperimenti.

Gli Archaea e IF5A

Gli Archaea sono organismi molto particolari e interessanti per la biologia molecolare. Molti di loro sono termofili, cioè vivono in ambienti estremamente caldi. Sono considerati un modello unico perché mostrano caratteristiche sia dei procarioti sia degli eucarioti: hanno un genoma semplice, simile a quello dei procarioti, ma possiedono macchinari molecolari complessi, tipici degli eucarioti. Questa combinazione li rende ideali per studiare processi fondamentali come la traduzione proteica.

Uno degli elementi chiave studiati negli Archaea è la proteina IF5A, un fattore di traduzione speciale; IF5A è unica perché contiene un aminoacido non canonico chiamato iposina. Questo aminoacido non è uno dei 20 standard, ma si forma grazie a modificazioni chimiche post-traduzionali. Un enzima chiamato deossiprosina sintetasi aggiunge un gruppo amminobutirico a una lisina nella proteina, utilizzando la spermidina come fonte producendo la deossiprosina. Un altro enzima, la diossiposina idrossilasi, aggiunge un gruppo ossidrile (OH), trasformando la diossiprosina in iposina.

Negli eucarioti IF5A aiuta i ribosomi a sintetizzare proteine quando incontrano sequenze di proline consecutive, un aminoacido rigido che può bloccare il ribosoma. Negli Archaea, inizialmente non era chiaro il ruolo di IF5A perché gli enzimi necessari per produrre iposina non erano sempre presenti. Studi recenti hanno dimostrato che anche negli Archaea IF5A si lega ai ribosomi e supporta la traduzione, ma con una funzione aggiuntiva: può degradare RNA, cosa che non accade negli eucarioti.

Lo studio di IF5A negli Archaea aiuta a capire come certe proteine essenziali per la traduzione si siano evolute. Mostra anche che una stessa proteina può avere ruoli leggermente diversi a seconda dell’organismo, pur mantenendo la funzione principale di supportare la sintesi proteica. Questo rende gli Archaea strumenti preziosi per comprendere i meccanismi fondamentali della biologia molecolare.

Deregolazione della sintesi proteica e malattie

C’è un fattore chiamato eIF4E che interagisce con alcune proteine chiave nella traduzione, e la sua deregolazione è associata a diverse malattie. In particolare, possiamo osservare due casi molto diversi tra loro:

• Cancro: in questo caso le cellule crescono in maniera incontrollata. La sintesi proteica è deregolata, quindi vengono prodotte troppe proteine, contribuendo alla proliferazione cellulare incontrollata tipica dei tumori.
• Sindrome dell’X fragile: la malattia deriva dalla mancanza di una proteina che lega eIF4E, e questo provoca un’eccessiva produzione di alcune proteine che dovrebbero invece aiutare alla formazione corretta delle spine dendritiche nei neuroni. Di conseguenza, le spine dendritiche rimangono immature, portando a sintomi dello spettro autistico e altre patologie neurologiche.

Queste malattie così diverse condividono un problema comune nella regolazione della sintesi proteica. Anche se gli effetti finali sono diversi - proliferazione cellulare nel cancro e difetti neurologici nell’X fragile - l’origine molecolare riguarda sempre un’alterazione nel controllo della traduzione delle proteine.

La storia della proteina CYFIP1

La proteina CYFIP1 è coinvolta nella regolazione della traduzione cap-dipendente e nella dinamica del citoscheletro nei neuroni, mostrando un comportamento multifunzionale.

Traduzione CAP-dipendente

La traduzione negli eucarioti avviene principalmente tramite il meccanismo CAP-dipendente, in cui la fase di inizio è il punto critico di regolazione. L’inizio della traduzione richiede la formazione del complesso eIF4F, costituito da:

• eIF4E, che lega il CAP situato all’estremità 5’ dell’mRNA;
• eIF4G, una proteina scaffold che collega eIF4E a eIF4A e alla coda poli-A tramite le poli-A binding protein;
• eIF4A, una elicasi che srotola le strutture secondarie dell’mRNA.

Questo complesso serve a reclutare il ribosoma e avviare la sintesi proteica.

La proteina eIF4E è regolata da proteine chiamate 4E-binding proteins (4EBP). Queste competono con eIF4G per il legame a eIF4E: quando sono legate, bloccano l’inizio della traduzione; quando vengono fosforilate da chinasi come mTOR, si distaccano e permettono a eIF4E di associarsi a eIF4G, avviando la traduzione.

CYFIP1: da complesso WAVE a regolazione della traduzione

Storicamente, CYFIP1 era nota per far parte del WAVE regulatory complex, che regola la polimerizzazione e depolimerizzazione dell’actina nei neuroni. Questo complesso, comprendente anche proteine come WAVE, NCKAP1 e ABI, è essenziale per la formazione del citoscheletro, la morfologia cellulare e la migrazione delle spine dendritiche.

Parallelamente, CYFIP1 interagisce con FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein), una RNA-binding protein che lega specifici mRNA nei neuroni e reprime la loro traduzione. Il complesso CYFIP1-FMRP-eIF4E blocca la sintesi proteica neurospecifica, regolando la maturazione delle spine dendritiche.

La mancanza di FMRP porta alla sindrome dell’X fragile, caratterizzata da spine dendritiche lunghe e immature.

La domanda chiave che ha guidato la ricerca è stata: come può la stessa proteina CYFIP1 partecipare sia alla dinamica del citoscheletro sia alla regolazione della traduzione?

Un lavoro pubblicato nel 2008 ha mostrato, tramite allineamenti in silico, che CYFIP1 possiede un motivo non canonico di legame a eIF4E, simile a quello delle altre 4E-binding proteins, anche se leggermente degenerato. Questo motivo mantiene le caratteristiche chimico-fisiche necessarie per l’interazione con eIF4E. Questi esperimenti hanno confermato che CYFIP1 si lega specificamente a eIF4E e che alcuni residui amminoacidici sono essenziali per questa interazione.

CYFIP1 è una proteina multifunzionale: nei neuroni può associarsi al WAVE complex o al complesso trimerico con FMRP-eIF4E. Studi computazionali e simulazioni molecolari suggerirono che la proteina adotta conformazioni diverse:

• Conformazione planare → legame con il WAVE complex;
• Conformazione ripiegata → legame con eIF4E-FMRP.

Questo movimento è stato definito “butterfly-like motion” e confermato sperimentalmente tramite FRET, dimostrando il passaggio dinamico tra i due complessi.

Approfondimenti strutturali

Le strutture cristallografiche di CYFIP1 sono parziali a causa di regioni intrinsecamente disordinate e della difficoltà di risolvere complessi multiproteici. Per superare questi limiti, sono stati utilizzati modelli predittivi come AlphaFold, che hanno permesso di identificare possibili siti di legame con eIF4E. Successivamente è stata applicata la mutagenesi mirata, una tecnica che permette di sostituire specifici residui amminoacidici della proteina per studiarne il ruolo funzionale. Questi esperimenti hanno mostrato che alcuni residui sono essenziali per l’interazione con eIF4E e che mutazioni estese possono alterare il ripiegamento e la stabilità di CYFIP1.

Tecniche sperimentali utilizzate

Le principali tecniche usate per studiare CYFIP1 combinano esperimenti e analisi computazionali. La Co-immunoprecipitazione e il Western blot servono a verificare le interazioni tra proteine, la mutagenesi mirata permette di modificare residui specifici per capire il loro ruolo, e l’espressione ricombinante produce proteine per gli esperimenti. Gli strumenti bioinformatici come allineamenti, BLAST, docking molecolare e AlphaFold aiutano a prevedere funzioni, siti di interazione e strutture tridimensionali.

Lez 2. 16/2 Espressione genica

L’espressione genica di un gene coinvolge diverse fasi: accesso alle sequenze regolatorie, inizio della trascrizione, sintesi e maturazione dell’mRNA, inizio della traduzione, sintesi e maturazione della proteina, corretto folding, eventuale degradazione, sia dell’mRNA sia della proteina stessa. Aspetti come la cinetica, il numero di copie prodotte e le modifiche post-traduzionali (PTM) sono fondamentali per comprendere il controllo dell’espressione genica.

Tuttavia, la complessità degli eucarioti superiori non può essere spiegata solo dal numero di geni o dalle variazioni nella loro espressione. I risultati del progetto ENCODE hanno mostrato che il genoma umano, pur contenendo meno di 20.000 geni codificanti proteine, genera oltre 80.000 trascritti e fino a 250.000-1.000.000 di proteine diverse, dimostrando che la regolazione dell’espressione genica comprende non solo la quantità di prodotto, ma anche la produzione di trascritti e proteine diversi a partire dallo stesso gene.

Il progetto ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) ha utilizzato approcci sperimentali e computazionali ad alta capacità per caratterizzare gli elementi funzionali del genoma umano. Un elemento funzionale è definito come un segmento discreto di DNA che codifica un prodotto funzionale (proteina o RNA non codificante) e possiede caratteristiche biochimiche riproducibili, come regioni di legame per proteine o particolari strutture della cromatina.

Grazie a ENCODE, la definizione di gene è stata aggiornata: un gene è una sequenza genomica, di DNA o RNA, che codifica direttamente molecole funzionali (proteine o RNA non codificanti). A volte, dallo stesso gene si possono ottenere diversi prodotti grazie a meccanismi come lo splicing alternativo, che taglia e ricuce l’RNA in modi diversi. Quando più prodotti condividono regioni sovrapposte, il gene è considerato come l’unione coerente di tutte le sequenze genomiche che li codificano, senza richiedere una sottosequenza comune a tutti i prodotti.

Es. In una regione genomica possono essere trascritti 3 RNA primari; dopo lo splicing alternativo, 2 di questi trascritti codificano 5 prodotti proteici diversi, mentre il terzo produce un RNA non codificante. I prodotti proteici derivano da gruppi di segmenti di DNA condivisi tra più prodotti, mentre l’RNA non codificante può condividere sequenze genomiche senza essere considerato parte dei geni proteici. In una stessa regione, si possono identificare più geni distinti, ognuno costituito dai segmenti di sequenza specifici che codificano un insieme coerente di prodotti funzionali.

Regolazione dell’espressione genica

La regolazione dell’espressione genica è il processo attraverso il quale la cellula controlla quando, dove e in quale quantità un gene viene espresso. Tutte le cellule di un organismo possiedono lo stesso patrimonio genetico, ma esprimono geni differenti in base alla loro funzione e al contesto fisiologico. La regolazione è ciò che permette la specializzazione cellulare e l’adattamento ai cambiamenti ambientali.

Si distinguono una regolazione quantitativa e una regolazione qualitativa dell’espressione genica:

• La regolazione quantitativa riguarda la quantità di prodotto genico sintetizzato, cioè quanto RNA o quanta proteina viene prodotta.
• La regolazione qualitativa riguarda la possibilità di ottenere prodotti diversi a partire da uno stesso gene.

Regolazione quantitativa

Per comprendere la regolazione quantitativa è importante considerare che la quantità finale di proteina presente in una cellula non dipende semplicemente dal numero di copie di un gene, ma da una serie di processi integrati.

Innanzitutto, è fondamentale il tasso di trascrizione: non conta solo quante copie del gene sono presenti, ma quante molecole di mRNA vengono prodotte da ciascuna copia. Questo dipende dalla velocità con cui l’RNA polimerasi trascrive il gene e dal numero di RNA polimerasi impegnate contemporaneamente su quel gene. Tuttavia, l’mRNA è una molecola instabile e possiede una propria emivita (half-life): dopo un certo tempo viene degradato. Il numero totale di molecole di mRNA presenti in un determinato momento dipende dall’equilibrio tra produzione (trascrizione) e degradazione.

A sua volta, la quantità di mRNA disponibile e il tasso di traduzione - cioè quanti ribosomi lo traducono e con quale velocità - determinano quante proteine vengono effettivamente sintetizzate. Anche le proteine non sono molecole permanenti: possiedono una loro emivita e vengono degradate attraverso sistemi specifici. Di conseguenza, la quantità finale di proteina in una cellula è il risultato dell’integrazione di più livelli di controllo: trascrizione, stabilità dell’RNA, efficienza della traduzione, stabilità proteica e modificazioni post-traduzionali. È proprio questa complessa regolazione multilivello che spiega come, a partire da un numero relativamente limitato di geni, si possa ottenere una grande varietà e modulazione di proteine.

Regolazione qualitativa

La regolazione qualitativa riguarda la produzione di prodotti diversi da un singolo gene. Negli eucarioti complessi non vale più il principio semplice “un gene = una proteina”. Uno stesso gene può dare origine a molteplici trascritti e quindi a diverse proteine; questa diversificazione avviene già a partire dalla trascrizione e continua nelle fasi successive.

Tra i principali meccanismi si trova l’uso di inizi alternativi della trascrizione, che portano alla sintesi di mRNA con estremità 5’ differenti. Un ruolo centrale è svolto dallo splicing alternativo, che permette di combinare in modo diverso gli esoni di uno stesso trascritto primario, generando proteine differenti. Anche la poliadenilazione alternativa contribuisce alla variabilità modificando l’estremità 3’ dell’mRNA e influenzandone stabilità e traduzione. Inoltre, possono verificarsi fenomeni di RNA editing, che modificano la sequenza dell’RNA dopo la sua sintesi, oppure il cosiddetto readthrough del codone di stop, in cui il ribosoma supera il segnale di terminazione producendo una proteina più lunga.

Esistenza di molte categorie di RNA non codificante

Questa maggiore complessità del genoma è stata chiarita dal progetto ENCODE, nato dopo l’Human Genome Project. Se il Progetto Genoma Umano ha determinato la sequenza del DNA, ENCODE ha avuto l’obiettivo di comprenderne la funzione. È emerso che solo una parte del DNA codifica per proteine, mentre una grande frazione viene trascritta in RNA con funzione regolatoria; in particolare, è stata evidenziata l’esistenza di numerose categorie di RNA non codificanti.

L’RNA non è solo un intermediario tra DNA e proteine, come l’mRNA, né soltanto una componente strutturale come rRNA e tRNA. Molti RNA non codificanti svolgono un ruolo attivo nella regolazione dell’espressione genica, nel controllo dell’organizzazione della cromatina e nella modulazione dell’attività di altri geni. Questi RNA regolatori agiscono spesso come fattori “trans-acting”, cioè molecole capaci di influenzare l’espressione di geni diversi da quello da cui sono stati trascritti.

La regolazione dell’espressione genica è un processo estremamente articolato che opera a diversi livelli: può modulare la quantità di proteina prodotta oppure generare prodotti differenti a partire dallo stesso gene. La complessità biologica non dipende tanto dal numero di geni, quanto dalla sofisticazione dei meccanismi regolatori che ne controllano l’espressione.

Regolazione della trascrizione nei procarioti

Passando alla regolazione della trascrizione nei procarioti, il meccanismo è più semplice rispetto agli eucarioti. Nei batteri esiste una sola RNA polimerasi, mentre negli eucarioti ce ne sono tre (I, II e III). Nei procarioti l’RNA polimerasi riconosce il promotore grazie alla subunità σ, la più comune è σ 70, che si lega a sequenze conservate chiamate -35 e -10, a monte del sito di inizio della trascrizione (+1).

Più queste sequenze sono simili al consenso, più il promotore è forte e quindi più il gene viene trascritto. Alcuni promotori possono avere elementi aggiuntivi, come l’elemento UP, che aumentano l’affinità per la polimerasi.

Controllo tramite repressori e attivatori

La trascrizione basale avviene spontaneamente quando la polimerasi si lega e passa dal complesso chiuso al complesso aperto (isomerizzazione), ma nella maggior parte dei casi è regolata da proteine specifiche:

• Il repressore si lega a una sequenza chiamata operatore, spesso sovrapposta al promotore, impedendo fisicamente il legame della polimerasi.
• L’attivatore può funzionare per reclutamento, facilitando il legame della polimerasi al promotore, oppure per allosteria, inducendo un cambiamento conformazionale che favorisce l’apertura del complesso. In alcuni casi il DNA stesso si ripiega formando un’ansa, avvicinando attivatore e polimerasi anche se sono distanti lungo la sequenza.

L’operone lac

L’operone lac è uno dei modelli classici di regolazione genica nei batteri; in assenza di lattosio il repressore LacI si lega alla regione operatore e impedisce all’RNA polimerasi di trascrivere i geni strutturali. Quando invece è presente il