Laboratorio 1

Anno: 2022/2023 Laboratorio Biotecnologie I

Sommario

• Introduzione .......................................................................................................................................... 4
• Analisi chimica ............................................................................................................................................... 4
• Soluzione standard e campione reale ........................................................................................................... 5
• Step del metodo analitico ............................................................................................................................. 5
• Alcune definizioni .......................................................................................................................................... 6
• Concentrazione delle soluzioni ...................................................................................................................... 6
• Misurazione del volume ................................................................................................................................ 8
• Come effettuare una lettura corretta ......................................................................................................... 13
• Standard e soluzioni standard ..................................................................................................................... 14
• Preparazione di una soluzione .................................................................................................................... 14
• Diluizioni ...................................................................................................................................................... 14
• Validazione .......................................................................................................................................... 16
• Come si predispone un’analisi quantitativa? .............................................................................................. 16
• Precisione ed accuratezza ........................................................................................................................... 18
• Tipologia di errori ........................................................................................................................................ 18
• Stima dell’errore casuale ............................................................................................................................. 19
• Curva normalizzata ...................................................................................................................................... 19
• Cifre significative ......................................................................................................................................... 20
• Arrotondamento .......................................................................................................................................... 20
• Calibrazione ................................................................................................................................................. 21
• Coefficiente di correlazione r ...................................................................................................................... 21
• Coefficiente di determinazione (r²) ............................................................................................................. 22
• Rapporto segnale/disturbo (S/N) ................................................................................................................ 23
• Limite di rivelabilità (LOD) e limite di quantificazione (LOQ) ...................................................................... 23
• Calibrazione ................................................................................................................................................. 24
• Spettrofotometria ................................................................................................................................ 29
• Onde ............................................................................................................................................................ 29
• Proprietà delle onde .................................................................................................................................... 29
• Radiazione elettromagnetica ...................................................................................................................... 30
• Lunghezza d’onda ........................................................................................................................................ 31
• Proprietà quanto-meccaniche della radiazione elettromagnetica .............................................................. 31
• Funzionamento dell’occhio umano ............................................................................................................. 31
• Colori della luce visibile ............................................................................................................................... 32
• Anno: 2022/2023 Radiazione ultravioletta .................................................................................................. 33
• Angolo critico ............................................................................................................................................... 36
• Trasformazione dell’energia in un atomo, ione o molecola ........................................................................ 36
• Meccanismi di emissione nelle molecole: ................................................................................................... 38
• Numeri quantici ........................................................................................................................................... 39
• Spettro dell’idrogeno ................................................................................................................................... 39
• Trasformazione dell’energia all’interno di una molecola ............................................................................ 40
• Tecniche spettroscopiche ............................................................................................................................ 41
• Assorbimento molecolare: .......................................................................................................................... 41
• Assorbimento di composti inorganici .......................................................................................................... 42
• Spettrofotometria di assorbimento molecolare ......................................................................................... 42
• Legge di Lambert-Beer ................................................................................................................................ 45
• Fluorescenza ................................................................................................................................................ 45
• Preparazione del campione .................................................................................................................. 47
• Complessità dell’analisi chimica .................................................................................................................. 47
• Distribuzione nel tempo .............................................................................................................................. 47
• Sorgenti di errori ......................................................................................................................................... 48
• Campionamento .......................................................................................................................................... 48
• Preparazione del campione ......................................................................................................................... 49
• Selettività ................................................................................................................................................. 50
• Contaminazioni ........................................................................................................................................ 50
• Costi e prestazioni ................................................................................................................................... 51
• Recupero .................................................................................................................................................. 51
• Percentuale di recupero e arricchimento del campione (spiking) .......................................................... 51
• Estrazione .................................................................................................................................................... 53
• Solid Phase Micro-Extraction (SPME) ...................................................................................................... 57
• Analisi .......................................................................................................................................................... 58
• Tecniche di separazione ....................................................................................................................... 58
• Cromatografia .............................................................................................................................................. 58
• Spettrometro di massa ................................................................................................................................ 63
• Esercitazioni ......................................................................................................................................... 67
• Esercitazione 1: Misura del volume (utilizzo pipette graduate con propipetta, pipette automatiche e puntali) ........................................................................................................................................................ 67
• Esercitazione 2: Diluizioni seriali e parallele ............................................................................................ 68
• Esercitazione 3: Analisi spettrofotometrica di una soluzione di permanganato di potassio a concentrazione incognita mediante curva di calibrazione con standard esterno ....................................... 71
• Anno: 2022/2023 Esercitazione 4: Analisi spettrofotometrica di una soluzione di blu di metilene a concentrazione incognita mediante curva di calibrazione con aggiunte standard ....................................... 73
• Esercitazione 5: Estrazione della vitamina D dal plasma mediante SPE .................................................. 75
• Esercitazione 6: Estrazione e separazione cromatografica dei pigmenti contenuti nei vegetali ............ 76
• Esempi domande esame ....................................................................................................................... 78

Introduzione

Anno: 2022/2023

La chimica analitica è la scienza delle misure, studia come poter misurare correttamente l’ambiente che ci circonda. La spettromisura è fondamentale poiché se noi non possediamo la misura di quello che stiamo facendo, non abbiamo la percezione di quello che succede. Esistono tantissimi strumenti e tecniche che forniscono varie informazioni alla chimica analitica.

Le possibili applicazioni comuni di tale branca nel mondo moderno sono:

• Petrolchimica
• Analisi di superficie
• Scienze dei materiali
• Controllo della qualità dei prodotti
• Analisi dei processi industriali
• Scienze ambientali
• Agrochimica
• Scienze alimentari
• Biotecnologie
• Ricerca di base
• Scienze forensi
• Chimica clinica
• Chimica dei polimeri
• Scienze farmaceutiche

Analisi chimica

L’analisi chimica può essere divisa in:

1. Qualitativa (Cosa c’è): ci dice qual è la composizione di un determinato campione.
2. Quantitativa (Quanto ce n’è): indica la concentrazione dei componenti del campione.

Le due cose tra di loro possono anche essere isolate l’una all’altra oppure collegate. Per componenti della matrice del campione si intende quei componenti presenti in concentrazione maggiore all’interno della soluzione. Non è detto che questi componenti siano i più importanti, spesso quelli presenti in concentrazione minore (componenti in tracce) sono i più rilevanti perché solitamente non ci dovrebbero essere e quindi si sono formati in modo anomalo.

Distinguiamo i componenti in:

• Componente principale (1-100%).
• Componente minore (0,01-1%).
• Componente traccia (<0.01%, <100 ppm).
• Componenti ancora più bassi si dicono componenti ultratracce (< 1 ppm).

Alcune domande essenziali

• Qual è lo scopo dell’analisi?
• Quale campione?
• Stato fisico (solido, liquido e gas), composizione (sostanza complessa o semplice), deperibilità (se il campione può mutare la propria composizione dopo un certo lasso di tempo).
• Quale sostanza?
• Caratteristiche chimico/fisiche della stessa. Struttura chimica, polarità, deperibilità (si decompongono facilmente o sono conservabili). La polarità e la struttura chimica della sostanza sono quelle che vanno a determinare il metodo di analisi del campione.
• Che tipo di risultati analitici?
• Qualitativi (identificare le tipologie di sostanze), quantitativi (misurare la concentrazione della sostanza), entrambi.
• Anno: 2022/2023
• Quali risorse sono disponibili?
• Strumentazione, personale, $$$. Anche le metodologie utilizzate dovranno essere tarate per la strumentazione a disposizione e il denaro a disposizione.
• Quanti campioni da analizzare?
• Anche in questo caso più denaro si ha a disposizione e più campioni si possono analizzare.
• Aspetto green.
• Risorse più sostenibili e che non vadano a danneggiare l’ambiente. Ci sono anche dei metodi di calcolo della sostenibilità e quanto le tecniche di analisi del campione abbiano impatto sull’ambiente. Tecniche miniaturizzate (Che utilizzano poco materiale).
• L’analisi è stata già eseguita da altri?
• Letteratura, metodi ufficiali. Se la tecnica è stata eseguita da altri è possibile perfezionarla o prenderla come spunto per avere una ‘’ricetta’’ passo su come affrontare l’analisi del determinato campione.

Soluzione standard e campione reale

Per soluzione standard si intende una soluzione semplice, con pochi componenti, dov’è presente un solvente e uno o diversi soluti.

Mentre per campione reale si intende una soluzione formata da componenti della matrice, con moltissime altre sostanze a varia concentrazione, spesso superiore a quella ricercata che possono mascherarne la presenza.

In conclusione la presenza di una matrice può complicare il processo di analisi di questi campioni reali (es. latte). Quando si è in presenza di un campione complesso bisogna trasformare e preparare quest’ultimo in modo che sia adatto per l’analisi del metodo da utilizzare; per avere sia un’informazione quantitativa e qualitativa, per esempio, il campione deve essere anche pesato e per sapere il peso totale bisogna proporzionarlo al peso del campione intero. Quando la concentrazione del campione è molto bassa, delle volte non è sufficiente allontanare le sostanze interferenti (che in certi casi risulta essere necessario) e quindi bisogna preconcentrare il campione stesso, ovvero aumentare la concentrazione della sostanza di interesse.

Step del metodo analitico

1. Formulating the question: formulare la domanda. È la fase in cui si traducono le domande generiche in domande specifiche che possano trovare risposta mediante misurazioni chimiche.
2. Selecting analytical procedures: scegliere la procedura analitica. È la fase in cui si individuano le procedure più appropriate, o, se necessario, si ideano di nuove per effettuare le misurazioni richieste. Alcuni metodi possono causare una perdita di una determinata quantità di molecole quindi bisogna aggiungere la stessa quantità di molecole dette molecole di recupero, questo è chiamato fattore di correzione. È necessario fare prima delle prove per determinare il fattore di correzione.
3. Sampling: campionamento. Prelevare una determinata quantità del campione e porlo in luogo in cui non è sottoposto a condizioni ambientali. Se si sceglie il campione sbagliato o esso viene modificato nel momento in cui viene prelevato, i risultati automaticamente non saranno validi.
4. Storage: conservazione del campione nel modo giusto.
5. Sample preparation: preparazione del campione. È il processo mediante il quale un campione rappresentativo viene trasformato nella forma più opportuna per effettuare l’analisi chimica.
6. Analysis: analisi. Anno: 2022/2023. È la fase in cui si misura la concentrazione dell’analita e le aliquote (porzioni) identiche del campione. Bisogna eseguire repliche delle misurazioni per stabilire la variabilità, l’incertezza di una misurazione è importante poiché fornisce informazioni riguardo l’affidabilità della misurazione. Inoltre è necessario evitare eventuali errori che possono scaturire dall’analisi di una singola aliquota di campione. Spesso possono essere utilizzati vari metodi per analizzare lo stesso campione per assicurarsi che essi portino allo stesso risultato e si riduca la presenza di eventuali errori.
7. Reporting and interpretation = riportare e interpretare i dati. È la fase in cui vengono interpretati i risultati e fatto uno resoconto scritto dei dati ottenuti, sottolineando tutte le limitazioni che li accompagnano.
8. Drawing conclusions = trarre conclusioni.

Alcune definizioni

• Analisi → Insieme di procedure per identificare e quantificare analiti in una specifica matrice.
• Analita → Composto da identificare e/o quantificare. Sostanza/e di interesse nell’analisi.
• Matrice → Mezzo nel quale è disperso l’analita.
• Determinazione → Insieme di procedure per identificare e quantificare analiti specifici.
• Metodo (protocollo) → Rigida successione di azioni per ottenere il risultato voluto.
• Tecnica → Strumentazione utilizzata nel metodo.

Concentrazione delle soluzioni