Genetica - parte 2

Mutazioni

Una mutazione è un cambiamento ereditabile nella sequenza del DNA. All'interno del DNA sono però presenti molte differenze tra i vari individui, ma non tutte vengono definite mutazioni: una mutazione può essere definita tale se ha delle conseguenze sul fenotipo (differenza che si osservano tra un fenotipo normale e un fenotipo mutante). Le mutazioni non sempre hanno un effetto negativo sull'organismo, ma spesso possono portare dei vantaggi, ed è proprio questo che consente che avvenga l'evoluzione.

Tipi di mutazioni

• Geniche → riguardano singoli geni, cambiamento A→a oppure a→A
• Cromosomiche → interessano tratti di cromosomi
• Genomiche → interessano l'intero assetto cromosomico

Mutazioni geniche o puntiformi

Interessano un singolo gene e vengono dette puntiformi in quanto il cambiamento nella sequenza di basi è molto piccolo. Queste mutazioni vengono originate per:

• Cambiamenti chimici spontanei
  • Errori nella replicazione del DNA (appaiamenti non corretti, inserzioni o delezioni); possono insorgere molti errori ma le cellule hanno sviluppato dei sofisticati meccanismi in grado di identificare questi errori e ripararli, per questo la frequenza delle mutazioni è molto bassa.
  • Errori nella ricombinazione
  • Elementi trasponibili (sono sequenza di DNA mobili presenti nel genoma degli eucarioti)
• Indotta
  • Agenti mutageni chimici o fisici

Errori durante la replicazione del DNA – appaiamenti non corretti

Possono essere di tre tipi:

• Oscillazioni tautomeriche o cambiamenti di stato delle basi (sono dei cambiamenti spontanei)
• Deaminazione
• Depurinazione

Basi pirimidiniche → C T
Basi puriniche → G A
Cambiamenti di stato delle basi → la citosina nel suo stato normale (forma aminica) si appaia con la guanina. La timina nella sua forma normale (formale chetonica) forma un doppio legame con l'adenina. Le basi possono subire dei cambiamenti di stato. La citosina può assumere la forma iminica e può formare un doppio legame con la adenina, causando così un errore di appaiamento. La timina invece può passare nella forma enolica che può legarsi con triplo legame alla guanina. La stessa cosa per adenina e guanina.

L'adenina nella sua forma normale è nella forma aminica dove si appaia con la timina e la guanina nella forma chetonica si appaia con la citosina. Se c'è un cambiamento di stato l'adenina si trasforma nella sua forma iminica e si lega alla citosina, mentre la guanina si trasforma nella sua forma enolica e si appaia alla timina. Questi cambiamenti di stato possono essere riconosciuti e rimossi dai meccanismi di riparazione, ma se non intervengono si possono avere dei cambiamenti nel DNA e quindi delle mutazioni.

Sostituzione di base di due tipi

• Transizione: purina → purina; pirimidina → pirimidina
• Transversione: purina → pirimidina; pirimidina → purina

Come avviene la mutazione?

Se i cambiamenti avvengono durante la replicazione del DNA, gli appaiamenti errati possono generare delle mutazioni. Dalla prima divisione si ottiene una elica uguale al parentale e l'elica di biosintesi dove viene inserita la timina al posto della citosina. Il filamento con la coppia errata andrà incontro ad un nuovo ciclo di replicazione. Il filamento sopra con la G si appaia con C e ritorna nel suo stato normale, quindi si ottiene DNA selvatico uguale al parentale. Nel secondo filamento la T che si appaia correttamente con A: questa elica si definisce mutante perché la base G-C viene sostituita da A-T → si ha una mutazione puntiforme.

Questo tipo di mutazione di base si definisce transizione (la mutazione sostituisce la G con A che sono entrambe purine, e una C con T che sono entrambe pirimidine).

Deaminazione → è uno dei cambiamenti chimici spontanei più frequenti. Indica la perdita di un gruppo amminico NH₂ che avviene frequentemente nelle citosine. La citosina perde un gruppo NH₂ che viene sostituito da un doppio legame, e la citosina si trasforma in uracile.

Esiste un sistema di riparazione efficiente che riconosce l'uracile, lo rimuove dal DNA e lo sostituisce con la base corretta. Se questo meccanismo di riparo non funziona, l'uracile permane e nel successivo ciclo di replicazione si appaia con l'adenina. Se la molecola di DNA con la coppia U-A va incontro a replicazione, l'uracile viene sostituito da T. Alla fine la cellula contiene la coppia T-A, mentre l'originale però era C-G. Questa mutazione si può definire transizione.

Punti caldi mutazionali → sono dei punti dove le frequenze di mutazione sono più elevate.

Errori durante la replicazione del DNA – inserzione e delezione

L'inserzione è l'aggiunta di una base, mentre la delezione è la perdita di una base. Questi errori avvengono durante la replicazione, ed è più probabile che avvengano nelle regioni con ripetizioni di basi.

Ad esempio in una zona del DNA dove sono presenti 5 adenine, una A scivola fuori dell'elica stampo → protrusione dell'elica stampo. L'adenina non viene “vista” nella sintesi della nuova elica quindi nessuna T viene appaiata: nella nuova elica ci saranno solo 4 T. In questo caso si parla di delezione.

La protrusione può riguardare anche la nuova elica, in questo modo una delle T non verrà vista e se ne aggiunge una in più. Si genera quindi l'inserzione di una nuova base, che verrà fissata al successivo ciclo di replicazione.

Mutazioni in un organismo

• Mutazione somatica
  • È avvenuta in una cellula somatica di un individuo
  • Gli effetti fenotipici si manifestano solo nell'individuo in cui è avvenuta la mutazione
• Mutazione germinale
  • Negli individui che si riproducono sessualmente, avviene nelle cellule della linea germinale
  • Può essere trasmessa alla generazione successiva

Esempio: tumore la mutazione ha un effetto fenotipico, ma la mutazione rimane confinata nell'individuo; se la mutazione avviene nelle cellule della linea germinale, se la variazione può far insorgere una forma tumorale questa avrà un effetto fenotipico nella progenie a cui viene trasmessa.

Mutazioni in una popolazione

• Frequenza di mutazione → è l'ampiezza della popolazione che sto guardando e non rispetto al tempo che cambia. Si riferisce ad una popolazione in questo momento (è come una fotografia).
• Numero eventi di una particolare mutazione/Popolazione di cellule o di individui
• Tasso di mutazione → Si riferisce ad un singolo gene. È il numero di mutazioni per quel gene rispetto al numero di generazioni, quindi viene riportato in funzione del tempo che è scandito dal numero di generazioni. Tasso di mutazione spontanea in geni singoli nell'uomo: da 10^-4 (nei punti caldi di mutazioni) a 4 x 10^-6. Numero di mutazioni per gene/Numero di generazione.

Dalla mutazione al fenotipo mutante

Cambiando la sequenza di DNA, cambia l'RNA, che si tradurrà in un cambiamento della sequenza degli amminoacidi nella proteina. Cambiare la proteina vuol dire cambiare la sua funzione e quindi avere delle conseguenze a livello del fenotipo.

I fenotipo mutante possono essere classificati:

• Visibili → morfologia o aspetto alterato
• Nutrizionali → alterata la capacità di un organismo di sintetizzare una molecola essenziale (riguardano vie biosintetiche)
• Di resistenza → insensibilità ad inibitori della crescita
• Condizionali → si manifestano in particolari condizioni ambientali (Esempio: T sensibili)

Tipi di mutazioni

• Silente → detta anche polimorfismo, c'è una mutazione che però non ha effetti sulla proteina e quindi dà fenotipo selvatico (non ha effetto sul prodotto genico). Questo perché nella tripletta una base viene scambiata con un'altra, ma la nuova tripletta codifica per lo stesso amminoacido.
• Neutra → c'è un cambiamento dell'amminoacido ma questo non è così importante da interferire con la funzione della proteina che sarà normale (o quasi) e il fenotipo sarà selvatico. Se ad esempio si sostituisce acido glutammico con acido aspartico, ci si accorge che questi hanno struttura simile e per questo motivo la mutazione viene definita neutra.
• Missenso → viene sostituito una base, la tripletta che si ottiene codifica per un amminoacido che rende la proteina diversa (difettosa). Si ottiene un fenotipo mutato.
• Nonsenso → una coppia di basi viene sostituita e si ottiene una tripletta di stop della traduzione quindi si ottiene una proteina tronca che non funziona e il fenotipo sarà mutato.
• Frameshift → dal punto di vista dell'effetto sul prodotto, le delezioni rientrano in questa categoria. Se c'è una delezione all'interno della sequenza codificante e una base viene persa. Visto che l'RNA durante la traduzione viene letto in triplette, e che una base di una tripletta è stata persa, da quel punto tutta la lettura viene alterata. Il peptide che si ottiene quindi sarà completamente diverso. Oltre allo slittamento si può anche avere l'introduzione di uno stop della traduzione prematuro.

Per quanto riguarda le mutazioni missenso se la mutazione avviene in un punto della proteina che è importante per la sua funzione, la mutazione avrà un effetto importante e la proteina non sarà funzionale. Se la proteina non è funzionale, vuol dire che il fenotipo è mutato e il gene di partenza è recessivo.

Ci sono però dei cambiamenti che portano all'acquisizione di una funzione diversa o una maggiore stabilità. Anche in questo caso il fenotipo è mutato ma non si ha una perdita di funzione, ma si ha una nuova funzione, quindi l'allele non sarà più recessivo ma dominante.

Anemia falciforme

È una malattia che porta ad un cambiamento nella forma del globulo rosso: in un individuo sano sono di forma tondeggiante, mentre in un individuo affetto da anemia falciforme sono di forma a falce. Questo cambiamento si accompagna in una riduzione nella capacità di trasportare l'ossigeno nel sangue e quindi circolazione sanguigna rallentata e scarsa ossigenazione.

Basi molecolari: la proteina coinvolta nella mutazione è una delle proteine che compongono l'emoglobina. L'emoglobina A è formata da 4 polipeptidi (tetramero), due di tipo α e due di tipo β. Nei pazienti con anemia falciforme l'alterazione riguarda la catena β, e l'emoglobina con la variante della catena β viene definita emoglobina S. La catena β alterata ha come sesto amminoacido la valina (invece dell'acido glutammico), in quanto si ha una singola sostituzione di base che riguarda la seconda base del codone. Questo causa un diverso ripiegamento della proteina e da questa cosa si originano diverse conseguenze che portano infine ad avere la forma a falce dei globuli rossi.

Base genetica: l'allele dominante indicato con la simbologia Hb^A (variante A del gene Hb per la proteina β), mentre l'allele recessivo Hb^S. Omozigoti per allele normale: Hb^A/Hb^A; omozigoti per la variante S: Hb^S/Hb^S → anemia falciforme; eterozigoti: Hb^A/Hb^S → forma del globulo rosso intermedia (sviluppano solo in parte i sintomi dell'anemia falciforme). La relazione tra i due alleli è quindi di dominanza incompleta.

Perché l'allele Hb^S si è mantenuto in alcune popolazioni? Questa malattia è diffusa ad esempio in zone dell'Africa, in Sardegna e in zone dell'area mediterranea, e sono state fornite delle ipotesi per rispondere a questa domanda. Oltre agli svantaggi che si hanno in presenza di questi alleli, ci sono anche dei vantaggi: gli individui eterozigoti sono degli “ospiti meno graditi” all'agente patogeno della malaria. Questo ha permesso loro di resistere a questa malattia nelle zone in cui la malaria è presente.

La conseguenza primaria della mutazione è quella di avere i globuli rossi falciformi. Ci sono però tutta una serie di effetti secondari: sono più stabili, hanno un'emivita minore e vengono distrutti più rapidamente; a causa della loro forma creano degli aggregati all'interno della circolazione sanguigna. La più rapida distruzione porta a sua volta ad avere un'anemia, mentre la formazione di aggregati causa scarsa irrorazione dei tessuti il che causa degli effetti successivi. La mutazione di un gene porta quindi ad un'ampia serie di effetti fenotipici: si parla di effetto pleiotropico.

Sindrome dell'X fragile

È una malattia rara dovuta a mutazione in un locus sul cromosoma X. Da un punto di vista citologico si mostra come la presenza di un sito fragile sui cromosomi X che determina frequenti rotture in vitro. Causa la forma più comune di ritardo mentale.

Il gene FMR1 (Fragile Mental Retardation 1) codifica per la proteina FMRP, una RNA-binding protein che lega l'RNA durante la traduzione. Questo gene è stato mappato ed è situato sul cromosoma X.

Base molecolare: è dovuto a dei cambiamenti nel numero di ripetizioni della tripletta CGG (ripetizioni in tandem) in una regione del gene FMR1 che è trascritta ma non tradotta. Se si osservano situazioni in cui la malattia è presente si trovano queste caratteristiche: gli individui normali portano quella tripletta con un numero di ripetizioni da 6 a 59 (allele più frequente 29 ripetizioni); negli individui con sintomi della malattia il numero di ripetizioni è molto più alto e va da 200 a 1300. Nei genitori degli individui affetti (i genitori non mostrano i sintomi) sono presenti un numero di ripetizioni da 50 a 200: si dice che questi antenati portano delle pre-mutazioni, cioè a partire da genitori con numero di ripetizioni alto si ottengono figli con numero ancora più alto, cioè sono alleli si espandono facilmente. Si parla di mutazione dinamica in quanto le mutazioni tendono ad aumentare.

In presenza di un elevato numero di mutazioni dà un segnale che favorisce la modificazioni di queste sequenze: si ha l'aggiunta di gruppi metilici (metilazione). Le mutazioni sono spontanee cioè dovute ad errori che avvengono durante la replicazione del DNA. Il meccanismo proposto per l'insorgenza di queste ripetizioni è lo slittamento dei filamenti durante la replicazione. Quando si hanno le ripetizioni si può avere, nel filamento figlio, una protrusione di molte delle triplette che sono ripetute. Il filamento figlio ritorna nel punto adiacente all'inizio della protrusione e aggiunge le triplette che sono a valle: il numero delle ripetizioni in questo modo risulta ampliato.

Il gene FMR1 è un gene eucariotico con una regione codificante con 17 esoni. Le ripetizioni della tripletta CGG si trova a monte del sito di inizio della trascrizione. Qual è l'effetto sul prodotto genico? Nella premutazione, cioè nei genitori, la trascrizione avviene in modo normale e il polipeptide viene tradotto. Nella mutazione completa le sequenze ripetute vengono metilate e la metilazione delle citosine blocca la trascrizione, quindi anche la quantità di prodotto genico sarà molto ridotta.

Reversione

La mutazione ha creato un allele a e questo subisce di nuovo una mutazione che lo riporta alla sua forma originale A. Le reversioni possono essere di due tipi:

• Mutazione per reversione o reversione
  • Reversione vera e propria
  • Parziale reversione o reversione di sito
• Mutazione soppressore

Reversione vera e propria

Ad esempio il gene della triptofansintetasi di E. coli. All'interno del gene c'è la tripletta GGA che specifica per la glicina, ma è stato trovato un mutante che ha la tripletta GAA che traduce per l'acido glutammico e che porta ad un prodotto genico non funzionale (mutazione missenso). La vera reversione è una mutazione che avviene a livello del gene mutato, che riporta la tripletta nella sua forma originale, cioè GGA che codifica per glicina. Queste mutazioni avvengono spontaneamente.

Reversione di sito

Nelle reversioni di sito la tripletta originale non viene ripristinata, ma si inserisce una nuova tripletta. Ad esempio la tripletta mutante era GAA e con la reversione di sito si ottiene GCA o AAA, la prima specifica per alanina e la seconda per lisina. In entrambi i casi al posto della glicina viene inserito un amminoacido diverso che però ha delle proprietà biochimiche tali per cui la proteina funziona lo stesso.

Mutazione soppressore

In questo caso un A diventa a. La mutazione soppressore è sempre una reversione che riporta il fenotipo da a a A, ma la sua azione può essere sul gene stesso ma in un altro punto o su un gene diverso. Quindi questa mutazione maschera gli effetti della prima mutazione. A seconda di come agisce si può parlare di soppressore:

• Intragenico, presuppone un meccanismo molecolare all'interno dello stesso gene ma in un sito diverso;
• Intergenico, avviene nello stesso genoma ma a carico di un altro gene. Si parla di geni soppressori, che mutano e, grazie a questa mutazione, riescono a sopprimere il fenotipo mutante. L'azione di questi geni può essere anche indipendente da quello del gene mutato.

Se ad esempio si ha una delezione di una base e si ha una mutazione frameshift, la sua reversione consiste in una inserzione di basi a valle e non troppo lontano da dove è avvenuta la prima mutazione (soppressore intragenico). Visto che il prodotto genico non sarà immutato (la reversione non avviene nel punto esatto in cui è avvenuta la mutazione originale), si ottiene un effetto soppressore sulla mutazione originaria.