Ematologia - Appunti completi

Lezione 1: Introduzione al sangue e ai prelievi

Argomenti trattati nella lezione

• Composizione e funzioni del sangue
• Come si ottiene il sangue: il prelievo venoso
• Modalità di prelievo venoso
• Il prelievo arterioso
• Tipi di provette per il prelievo di materiale biologico
• I valori di riferimento e la variabilità per interpretare i risultati

Il sangue - composizione

Il sangue è un tessuto connettivo fluido ed è formato da elementi corpuscolati (cellule, globuli rossi e piastrine) e da una parte liquida ricca in proteine, elettroliti e sali minerali. Il sangue è costituito per il 90% da acqua, nella quale sono contenute un certo numero di proteine e altri elementi; un po' meno della metà presenta elementi corpuscolati che si distinguono in globuli rossi (per il 90%), globuli bianchi e piastrine (10%).

La parte liquida del sangue è denominata plasma (55% del volume) e contiene acqua, proteine, lipidi, glucosio, amminoacidi, ioni e sostanze di rifiuto. Le proteine, a loro volta, comprendono albumina, fibrinogeno, fattori della coagulazione e anticorpi (o immunoglobuline). Il plasma può essere liberato dai fattori della coagulazione: quindi il plasma privato dai fattori della coagulazione si chiama siero.

Il siero può assumere diverse caratteristiche a seconda delle condizioni cliniche del paziente. Il siero di per sé ha un colorito giallastro/trasparente. Si parla di siero emolitico quando vi è un’abbondante rottura di globuli rossi. Si parla di siero itterico quando vi è abbondante bilirubina in corso di epatopatie ad esempio. Si parla di siero lipemico quando è ricco di acidi grassi, come nelle ipercolesterolemie, ecc.

L’ematocrito, ovvero la parte corpuscolata del sangue, contiene gli eritrociti (globuli rossi) per il 44%. Infine, vi è il buffy coat (1%) che contiene globuli bianchi e piastrine. I globuli bianchi, a loro volta, comprendono neutrofili, eosinofili, basofili, monociti e linfociti. Il buffy coat, dopo centrifugazione del sangue, è visibile.

La parte corpuscolata del sangue è quella parte che comprende le cellule, i globuli rossi e le piastrine.

• Globuli rossi: rappresentano l’elemento figurato più abbondante nel sangue, si misurano in milioni per millimetro cubo, e hanno una forma biconcava.
• Piastrine: sono considerate frammenti cellulari, solitamente misurati in centinaia di migliaia per millimetro cubo.
• Leucociti (globuli bianchi): comprendono i granulociti neutrofili (i più abbondanti 50-60%), i granulociti eosinofili (2%) e i granulociti basofili (1.5%). I leucociti inoltre comprendono i linfociti (30-40%) e i monociti (5-10%). I monociti sono cellule vitali circolanti, ma possono anche penetrare nei tessuti divenendo macrofagi residenti. Questi ultimi vengono osservati soltanto quando sono “attivi”, ad esempio durante un’infiammazione acuta.

Globuli rossi, globuli bianchi e piastrine derivano da precursori. La fase di maturazione di questi precursori per i globuli bianchi avviene all’interno di un organo chiamato midollo osseo, e in particolare nelle ossa piatte (sterno, cranio, colonna vertebrale e bacino).

Le cellule del sangue originano da una cellula staminale (che è in grado di auto-rinnovarsi) e questo garantisce al midollo osseo di contenere una quota abbondante di cellule staminali totipotenti che si rinnovano costantemente, quindi l’organo si auto-mantiene. Ad ogni ciclo di auto-mantenimento, la cellula si dividerà in due: una cellula rimarrà staminale e una proseguirà per la differenziazione. Man mano che aumenta la differenziazione, va persa la capacità di autorinnovamento e la capacità di differenziare: in questo caso vi sarà un pool di cellule multipotenti, cioè in grado di continuare a differenziare lungo diverse vie.

I precursori oligopotenti possono essere già commissionati per una maturazione di tipo mieloide o linfoide, oppure commissionati per una maturazione di tipo megacariocitario eritroide o granulocita macrofagico, oppure commissionati in linea (quindi per i globuli rossi, per le piastrine, globuli bianchi e per la quota linfocitaria). Normalmente, questa maturazione è regolata da fattori trascrizionali che sono specifici per il compartimento staminale e specifici per la linea.

Nel sangue periferico compaiono solo le forme mature.

Le funzioni del sangue

• Trasporto: di sostanze nutritive, di gas respiratori, di sostanze di rifiuto e di ormoni.
• Regolazione: del pH, della pressione arteriosa, della pressione osmotica, dell’equilibrio idrico e salino, della temperatura corporea.
• Protezione: difesa immunitaria e emostasi.

Dal sangue si possono quindi ottenere informazioni sulla salute clinica dell’individuo:

• Es. il grado di ossigenazione (direttamente attraverso la stima della pressione di ossigeno o indirettamente attraverso la valutazione del suo trasportatore, l’emoglobina).
• Es. i livelli di zucchero presenti nell’organismo (glicemia, espressa attraverso la concentrazione di glucosio in grammi per decilitro di sangue).
• Es. il grado di capacità di un individuo di riparare una ferita (attraverso la conta assoluta delle piastrine, la concentrazione delle proteine della coagulazione e il calcolo dei tempi coagulativi).
• Es. l’entità delle difese immunitarie (attraverso la conta assoluta dei globuli bianchi e la concentrazione delle proteine anticorpali, anche dette immunoglobuline).
• Es. la funzionalità di organi chiave come il fegato (attraverso il dosaggio degli enzimi epatici (transaminasi, colinesterasi), della quantità di proteine totali, indirettamente del fibrinogeno e della funzionalità coagulativa) o il rene (attraverso il dosaggio di una proteina marcatore del filtro renale, la creatinina, dell’acido urico e dell’azoto ureico e degli elettroliti come potassio, sodio, calcio e cloro).
• Es. la presenza di un evento clinico acuto e drammatico (es. il dosaggio della troponina nell’infarto cardiaco).

Prelievo venoso

Molto spesso l’accesso venoso si trova nella vena cefalica o nelle diramazioni della vena basilica. Bisogna scegliere il calibro dell’ago in un prelievo venoso. Pur essendo assai diffuso l’utilizzo dei butterfly o “aghi a farfalla”, le evidenze scientifiche consigliano di preferire aghi di calibro pari a 20 o 21 G, riservando l’uso degli aghi a farfalla a situazioni particolari (vene difficilmente accessibili per sede o calibro o esplicita richiesta del paziente). Il prelievo venoso da ago cannula o da catetere venoso centrale è sconsigliato.

In ambito di emergenza/urgenza è diffuso l’uso di agocannule che però può causare emolisi nel campione e quindi la letteratura ne sconsiglia l’uso per il prelievo venoso. Identificare il paziente prima di eseguire un prelievo venoso. Secondo la International Joint Commission identificare con accuratezza il paziente significa identificarlo in quanto destinatario di una prestazione o trattamento e, in secondo luogo, verificare la corrispondenza tra quella prestazione o trattamento e quel singolo paziente. Perché ciò sia possibile è necessario utilizzare quantomeno due modalità di identificazione univoca del singolo paziente (ad es. nome/cognome e data di nascita, che devono corrispondere a quelle sulle etichette prestampate). Le etichette inoltre identificano il tipo di esame e il tipo di provetta che verrà utilizzata per il prelievo.

Modalità di prelievo venoso

Bisogna stringere l’elastico emostatico a monte in modo da mettere in rilievo la vena e disinfettare la zona del rilievo con un batuffolo di cotone e amuchina. Viene inserito l’ago circa 10 mm sino a raggiungere il lume della vena, con un’angolazione di 15-20° rispetto al piano cutaneo.

Prelievo arterioso

Evenienza frequente in reparti intensivi, in pneumologia e cardiologia ma anche nelle medicine interne. Ha la funzione di valutare con precisione i livelli di ossigeno e di anidride carbonica nel sangue nonché il pH del sangue. Utile nelle insufficienze respiratorie, nelle emergenze metaboliche (iperglicemia) e miste (shock settico).

Prima di procedere con il prelievo è essenziale trovare la pulsazione arteriosa (polso). Il prelievo arterioso viene preferito nell’arteria radiale. Viene utilizzata una siringa pre-calibrata sottovuoto ad aspirazione. Il più comune sistema di prelievo venoso è attraverso la tecnologia Vacutainer (sotto vuoto).

I campioni ematici prelevati in laboratorio sono ottenuti mediante puntura venosa con sistema di aspirazione sottovuoto che rappresenta attualmente lo stato dell’arte sia in termini di sicurezza (igiene) per il paziente e l’operatore, sia in termini di qualità del campione (eliminazione di vortici, spruzzi, aerosol, e conseguente emolisi, ecc). In talune, rare circostanze può rendersi necessario il prelievo in aspirazione (attraverso siringa con stantuffo), ad esempio per grandi quantità di sangue (i.e: studi di citogenetica).

Tipi di provette per il prelievo di materiale biologico

Le provette sottovuoto ad aspirazione pre-calibrata, sono pre-etichettate e sterili internamente. Esistono provette con e senza additivi, solitamente in struttura polimera (PET), più raramente in vetro. La chiusura di sicurezza riduce drasticamente l’esposizione al rischio biologico sia nel momento del prelievo, sia durante il trattamento dei campioni ematici, consentendo agli operatori sanitari di operare nella massima sicurezza.

Tappo viola: è una delle provette più importanti da memorizzare. Contiene EtilenDiaminTetraAcetato (EDTA), un chelante del calcio che funziona da anticoagulante, facendo sì che il sangue rimanga liquido. È utilizzata principalmente per EMOCROMO, Velocità di Eritro-Sedimentazione (VES) (volume più piccolo, 4 mL) o per la determinazione del GRUPPO SANGUIGNO, delle PROVE CROCIATE DI COMPATIBILITÀ SANGUIGNA (volume grande 7mL) e per la determinazione della carica virale. L’EDTA è l’anticoagulante preferibile per la maggior parte dei test di biologia molecolare, che prevedono l’estrazione di acidi nucleici. Gli eritrociti, i leucociti e le piastrine in un campione di sangue anticoagulato con EDTA sono stabili fino a 24 ore. Lo striscio di sangue dovrebbe essere effettuato entro 3 ore dal prelievo per evitare artefatti.

Tappo ruggine: da memorizzare. Questa provetta è detta anche provetta del siero, e con questa è possibile completare la quasi totalità dei dosaggi biochimici (funzionalità epatica e renale, elettroliti). Ha la particolarità di avere all’interno e sulle pareti un gel in grado di innescare la coagulazione del sangue e rendere analizzabile il solo siero (la parte liquida del sangue senza le proteine della coagulazione).

In generale, tutte le provette che contengono gel servono a studiare il SIERO (plasma senza fattori della coagulazione) indipendentemente dal colore del tappo. Le provette per siero hanno adeso all’interno microparticelle di silice che attivano la coagulazione quando le provette vengono invertite delicatamente dopo il prelievo. Le provette per siero con separatore integrato contengono un gel che è presente nella parte inferiore della provetta. Durante la centrifugazione il gel si muove verso l’alto formando una barriera stabile che separa il siero dalle cellule.

Tappo azzurro: da memorizzare. Questa provetta deve essere sempre riempita sino a che non termina l’aspirazione, mai interrompere prima il prelievo! Ha la particolarità di avere all’interno un liquido (Sodio Citrato) che funziona da anticoagulante senza interagire con il calcio plasmatico e permettendo la stima dei tempi di attivazione e completamento della COAGULAZIONE.

Esistono poi anche provette con anticoagulante alternativo (EPARINA, tappo verde) o completamente prive di additivo (tappo bianco). La provetta tappo bianco viene utilizzata solitamente per liquidi biologici diversi dal sangue, non contenenti proteine della coagulazione (es. versamenti sierosi, liquor cefalorachidiano).

Una volta raccolto il campione, bisogna capovolgere le provette almeno 4 volte, senza scuoterle. Le provette con i campioni devono essere contrassegnate in modo da poter essere attribuite univocamente al paziente. I valori di riferimento sono i valori riscontrati in un campione di persone con caratteristiche omogenee alla popolazione normalmente servita dal laboratorio e nel particolare all’individuo in esame. La popolazione di riferimento contribuisce a trasformare il risultato (concentrazione di un analita) in un’informazione clinica. Questa informazione clinica fa riferimento ad una distribuzione normale, in un valore medio di una distribuzione gaussiana. In medicina, è comune assumere come LIMITI DI NORMALITÀ il 2.5 e il 97.5 percentile della distribuzione dei dati di una popolazione sana.

Per deviazione standard si intende la radice quadrata della sommatoria degli scarti dalla media, elevata al quadrato, diviso il numero totale della popolazione (o del campione).

Lezione 2: Emocromo e formula leucocitaria

Argomenti trattati nella lezione

• Emocromo e formula leucocitaria
• La parte corpuscolata del sangue
• Globuli rossi
• Gruppi sanguigni e significato

Nel referto emocromocitometrico Neutrofili, Linfociti, Monociti, Eosinofili e Basofili sono riportati in base alla loro quantità nel sangue, e vengono riportati sia in valore assoluto che in valore percentuale. Il valore percentuale rende un’idea più immediata dei globuli bianchi, e prende il nome di conta differenziale leucocitaria o di formula leucocitaria.

L’emoglobina è lo specchio di ossigenazione di riserva energetica dell’individuo. Il terzo parametro controllato nel referto è il numero delle piastrine, che indica il grado di capacità dell’individuo di andare incontro ad un’emostasi primaria. Va controllato poi il numero dei globuli rossi, che ci indica la massa eritrocitaria, che va correlato al valore ematocrito HCT. Un altro valore è MCV (valore corpuscolare medio). Il valore RDW indica l’ampiezza di distribuzione dei globuli rossi, e ha un valore in percentuale. Questo valore può essere indicativo di un’alterazione nella distribuzione del volume dei globuli rossi.

Si parla di anemia quando il valore di emoglobina si trova al di sotto del valore di riferimento. Si parla di leucopenia quando vi è un basso numero di globuli bianchi. Se il valore di MCV è basso si parlerà di anemia microcitica. Si parla di inversione di conta differenziale quando le percentuali di Neutrofili, Linfociti, Monociti, Eosinofili e Basofili sono alterate o invertite.

Le cellule del sangue - sviluppo e funzione

L’emopoiesi individua un’emopoiesi primitiva che avviene precocemente, quando nell’embrione non abbiamo ancora il midollo osseo ma il sacco vitellino, per poi seguire un’emopoiesi definitiva che ha luogo nel fegato per poi “trasferirsi” nel midollo osseo con lo sviluppo embrionale. Le due grandi linee differenziative sono la linea mieloide, che differenzierà in Mast cell, Eritrociti, Piastrine, Eosinofili, Neutrofili e Monociti; e la linea linfoide, che differenzierà in Linfociti T e Linfociti B. Gli elementi maturi li ritroviamo nel sangue periferico.

Le cellule staminali necessitano dell’attivazione di fattori trascrizionali ben precisi, i più importanti sono GATA2, MLL, ETV6. Ci sono altri fattori che servono per indirizzare la cellula verso la linea linfoide: per esempio, per la linfogenesi B è importante che ci sia l’attivazione di IKAROS, E2A, EBF e PAX5. Per l’attivazione dei linfociti T, invece, è importante l’attivazione di NOTCH.

Globuli rossi

Lo sviluppo dei globuli rossi prende il nome di eritropoiesi. La curva di differenziazione parte da elementi immaturi per poi arrivare a elementi maturi nel sangue periferico. Il globulo rosso maturo non ha nucleo. Lo stadio iniziale (o precoce) si chiama Pronormoblasto, a seguire vi sono Eritroblasto basofilo, Eritroblasto policromatofilo, Eritroblasto ortocromatico e infine globulo rosso.

Le forme immature si distinguono molto bene dalle forme mature perché agli inizi vi è una cromatina più lassa e di dimensioni maggiori, con un’attività sintetica e trascrittiva maggiore. Inizialmente anche il citoplasma è abbondante, poi diminuendo la dimensione della cellula si assiste alla formazione del globulo rosso.

Per quanto riguarda la colorazione, il citoplasma delle strutture immature è basofilo (blu intenso) per poi diventare sempre meno basofilo nelle forme mature: questa reattività si chiama basofilia e si ha quando il colorante interagisce con strutture acide. Man mano che l’RNA viene tradotto in proteine, va persa la basofilia e si acquista un’acidofilia (o eosinofilia) in cui il citoplasma diventa più rosa.

Man mano diminuisce il volume della cellula e la trascrizione, aumenta la quantità di proteine all’interno della cellula eritroide. La nuova cellula quindi adatta le sue caratteristiche morfologiche, con l’espulsione del nucleo e con la creazione di una particella di membrana cellulare di circa 8 micron di diametro piena di emoglobina, ovvero globulo rosso.

L’eritroblasto ortocromatico e il globulo rosso sono le forme presenti nel sangue periferico, mentre gli stadi a monte hanno vita nel midollo osseo. I globuli rossi possiedono una forma particolare che riflette la loro funzione:

• Disco biconcavo, appiattito (sezione a “pavesino”): favorisce l’estensione della superficie di membrana (per gli scambi gassosi);
• Non ha nucleo né organelli (per lasciare il massimo spazio all’emoglobina).

Nell’organismo adulto sono prodotti esclusivamente dal midollo osseo.