Elettroforesi

Elettroforesi

L'elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata, in un campo elettrico, di

molecole elettricamente cariche. Viene utilizzata soprattutto per analizzare proteine e acidi nucleici

e per veri care se una proteina è stata puri cata correttamente.

L'elettroforesi può essere analitica, quando serve a capire quali molecole sono presenti in un

campione e a valutarne il grado di purezza, oppure preparativa, quando permette di separare una

miscela e recuperare la molecola di interesse.

Le molecole di interesse biologico, come amminoacidi, peptidi, proteine e acidi nucleici,

possiedono gruppi ionizzabili e quindi possono assumere una carica positiva o negativa in funzione

del pH della soluzione. Quando viene applicato un campo elettrico, le molecole cariche migrano

verso l'elettrodo di carica opposta: gli anioni, cioè le molecole con carica negativa, migrano verso

l'anodo, mentre i cationi, con carica positiva, migrano verso il catodo.

Attualmente si utilizza l'elettroforesi su supporto, nella quale le proteine migrano all'interno di un

supporto solido, come acetato di cellulosa, agarosio o gel di poliacrilammide. In questo modo,

quando si interrompe la corrente elettrica, le molecole rimangono bloccate nella posizione

raggiunta, formando delle bande elettroforetiche.

L'apparecchiatura è costituita da un alimentatore, che genera corrente continua, da una cella

elettroforetica, verticale oppure orizzontale, contenente il tampone di corsa e il supporto imbevuto

dello stesso tampone. Il tampone ha due funzioni fondamentali: permette il passaggio della corrente

elettrica e mantiene costante lo stato di ionizzazione delle proteine. Generalmente si utilizza un pH

basico, in modo che le proteine assumano una carica negativa e migrino tutte verso l'anodo.

La velocità di migrazione dipende dall'equilibrio tra due forze. La prima è la forza trainante,

esercitata dal campo elettrico, che spinge la molecola verso l'elettrodo opposto. La seconda è la

forza frizionale, che si oppone al movimento della molecola nel mezzo. Quando queste due forze si

equivalgono si raggiunge una velocità costante, detta mobilità elettroforetica.

La mobilità elettroforetica dipende principalmente da due fattori: la carica della molecola e le sue

dimensioni. Più una molecola è carica, maggiore sarà la sua velocità di migrazione; al contrario,

più è grande, più lentamente si muoverà perché incontra una maggiore resistenza nel mezzo.

Esistono diversi tipi di supporto. La carta, oggi quasi non più utilizzata, era adatta alla separazione

di piccole molecole. L'acetato di cellulosa viene impiegato soprattutto per separare le proteine del

siero. L'agarosio è utilizzato principalmente per frammenti di DNA e proteine di grandi dimensioni.

Il gel di poliacrilammide, invece, è il supporto più utilizzato per separare proteine di piccole

dimensioni e frammenti di DNA.

L'elettroforesi su acetato di cellulosa è una tecnica analitica. La striscia di acetato di cellulosa

(struttura microporosa e omogenea che minimizza il fenomeno dell’adsorbimento) viene posta in

una cella elettroforetica contenente il tampone di corsa e collegata ai due elettrodi. Il tampone deve

mantenere le proteine in una determinata forma ionizzata. Una volta applicata la differenza di

potenziale, le proteine migrano (da negativo a positivo) con velocità diverse e, al termine della

corsa, si ottengono diverse bande.

Per visualizzare le proteine si possono utilizzare coloranti come il rosso Ponceau oppure il blu di

Coomassie. Dopo la colorazione, possiamo osservare le diverse bande proteiche. La striscia può

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anche essere sottoposta a una lettura densitometrica: ogni banda viene trasformata in un picco e

l’area del picco è proporzionale all’intensità della banda.

Il gel di poliacrilammide svolge anche un'importante funzione di setaccio molecolare. È formato

da una rete tridimensionale di pori ottenuta dalla polimerizzazione dell'acrilammide in presenza

della N,N'-metilen-bisacrilammide, che crea i legami crociati in presenza di: persolfato di

ammonio (iniziatore), TEMED (catalizzatore).

Grazie a questa struttura, oltre alla carica viene considerata anche la dimensione delle molecole: le

proteine più piccole attraversano facilmente i pori del gel e migrano più velocemente, mentre quelle

più grandi incontrano maggiore resistenza e migrano più lentamente. Questo rende la separazione

molto più ef cace rispetto all'elettroforesi su acetato di cellulosa. Reazione chimica: si tratta di una

tipica polimerizzazione radicalica, radicali liberi sono molecole con elettrone spaiato, quindi sono

molecole altamente reattive.

Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con formazione del radicale libero

SO4-•:

S2O82- +1e- SO4- • + SO4-•

→

Il radicale libero SO4-• trasferisce l’elettrone spaiato all’acrilammide che funge essa stessa da

radicale libero e innesca il processo di polimerizzazione e quindi si uniscono per formare il gel, la

cui porosità varia in funzione della quantità di NNmb e acrilammide presente. A seconda

dimensione proteine si usa gel con %T diversa.

La consistenza del gel dipende dalla concentrazione di acrilammide e di bisacrilammide:

aumentando la concentrazione si ottengono pori più piccoli, adatti alla separazione di proteine di

piccole dimensioni; diminuendola si ottengono pori più grandi, utilizzati per proteine di dimensioni

maggiori.

L’elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS (SDS-PAGE) è una tecnica in cui

l’SDS, ovvero il sodio dodecil solfato, agisce come surfattante eliminando il fattore carica. L’SDS

ha una coda idrofobica a 12 atomi di carbonio e una testa polare carica negativamente. Esso

denatura le proteine disponendo le sue code idrofobiche a contatto con gli amminoacidi interni del

core proteico, mentre la testa polare carica negativamente resta rivolta verso l’ambiente acquoso. In

questo modo le proteine acquisiscono circa la stessa densità di carica negativa (con un rapporto di

circa 1,4 grammi di SDS per grammo di proteina) e migrano verso l’anodo separandosi

esclusivamente in base al loro peso molecolare.

Il campione viene preparato sciogliendolo in un tampone Tris-HCl a pH 6,7 in presenza di SDS, del

riducente DTT per rompere i ponti disolfuro, di saccarosio o glicerolo per aumentare la densità, e

del blu di bromofenolo come indicatore di corsa, una molecola molto piccola che forma una banda

al fondo del gel indicando la ne del processo elettroforetico.

La SDS-PAGE viene eseguita in una cella elettroforetica verticale. Il polo negativo, cioè il catodo,

si trova nella parte superiore, mentre il polo positivo, cioè l'anodo, si trova inferiormente. Poiché le

proteine rivestite di SDS sono negative, migrano dall'alto verso il basso, quindi dal catodo verso

l'anodo.

Il sistema utilizza due gel diversi, posti uno sopra l'altro: il gel di impaccamento, chiamato anche

stacking gel, e il gel di separazione, chiamato running gel.

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Il gel di impaccamento si trova nella parte superiore e ha un pH di circa 6,7 e una concentrazione

di acrilammide relativamente bassa, circa 3-5%. Di conseguenza presenta maglie molto larghe e

non serve a separare le proteine in base alla dimensione. La sua funzione è quella di concentrare

tutte le proteine in una banda molto sottile, in modo che entrino contemporaneamente nel gel di

separazione. Come prepararlo: Tampone Tris-HCl, pH 6,7 Soluzione Acrilammide-Bis, SDS,

TEMED, APS, H2O.

Il gel di separazione, invece, si trova nella parte inferiore, ha un pH di 8,9 e una concentrazione di

acrilammide tra il 6 e il 20%, in base alle dimensioni delle proteine da separare, che è proprio la sua

funzione. Si prepara con tampone Tris-HCl pH 8,9, acrilammide-bis, SDS, TEMED, APS e acqua.

Procedura sperimentale

Si utilizzano due lastre rettangolari di vetro poste verticalmente una di fronte all'altra e separate da

uno spaziatore. Lo spazio tra i due vetri permette di versare il gel e generalmente ha uno spessore di

circa 0,75-1 mm. E si pongono all’interno di un opportuno supporto che viene chiuso per

immobilizzare le lastrine. Il supporto viene inserito in un’opportuna impalcatura di plastica in modo

che sia a contatto con la parte inferiore con una striscia di gomma.

All’interno dello spazio delimitato fra le due lastrine viene versato il gel di separazione. Prima

della