Biotecnologie vegetali

Genoma nucleare

Il genoma nucleare delle piante, a differenza di quello animale, è molto più vasto. In una grande percentuale, esso è formato da sequenze non codificabili e trasponibili. La componente dei trasposoni apporta ai genomi delle piante un forte grado di variabilità genetica. Una delle prime conseguenze della mobilizzazione dei trasposoni è l’aumento della taglia del genoma; infatti, quando un elemento si inserisce in una nuova posizione, essa non è precisa, completamente casuale, e nel caso in cui si vada ad aggiungere a un luogo in cui l’inserzione già è avvenuta, il gene potrebbe essere silenziato se la nuova copia si inserisce in una regione esonica. Il gene non viene distrutto solo se si inserisce nella sequenza esonica, ma anche se si inserisce nella sequenza promotrice.

Le sequenze che si trovano ai lati del retrotrasposone sono promotrici, in modo tale che si trovino box riconosciute da fattori trascrizionali specifici quali promotori che fungono da enhancer (ovvero aumentano l’espressione del gene in considerazione).

Retrotrasposone: è una sequenza genica a DNA capace di autotrascriversi a RNA per poi ritrascriversi a DNA per poi inserirsi in diverse posizioni nel genoma. Ci sono due possibili spiegazioni alternative in merito alla relazione evolutiva fra retrovirus e retrotrasposoni (Bennetzen, 1996):

• I retrotrasposoni sono stati i progenitori dei retrovirus, questa teoria può essere confermata dalla presenza dei retrotrasposoni negli eucarioti primitivi e dalla loro semplice costituzione genetica.
• I retrotrasposoni si sono evoluti dai retrovirus a seguito della perdita del gene env.

Un’importante conseguenza della mobilizzazione degli elementi mobili è dovuta all’inserzione di questi all’interno di sequenze geniche codificanti con la conseguente mancata espressione del gene corrispondente e assenza del prodotto proteico. L’inattivazione genica dovuta all’inserzione è dunque un fenomeno comune per quegli elementi che possiedono un basso numero di copie all’interno del genoma, i quali sono in grado cioè di “sfuggire” alla selezione naturale. Spesso rimangono silenti e inattivi, ma a volte trasponendosi possono generare sequenze codificanti, e alcuni elementi possono riarrangiare le sequenze dei promotori, creando nuovi profili di regolazione genica (Kloeckener-Gruissem and Freeling, 1995). Un trasposone può inserirsi nei siti di splicing rompendoli, formando un RNA diverso dal classico, ovvero una variante, fornendo quindi nuovi siti di splicing.

Nel genoma delle piante esiste una ridondanza genica: ovvero la presenza di molte sequenze geniche simili dove la maggior parte del genoma (70%) è rappresentato da segmenti duplicati. Alcune proteine, quando vengono espresse, formano un certo quantitativo di proteina X; in alcuni casi, l’espressione aumentata diventa deleteria per la cellula stessa. La cellula vegetale allora mette su un meccanismo che silenzia le copie aggiuntive, una delle copie aggiuntive può però accumulare una mutazione ed in tal caso la copia originaria acquista una nuova funzione.

Altre caratteristiche del genoma delle piante

Un ulteriore motivo per il quale il genoma è così grande è dovuto a due caratteristiche che fanno parte delle diverse specie quali la sintenia e la collinearità:

• Sintenia: fenomeno per il quale il repertorio o numero di geni restano conservati tra genomi di organismi diversi; si considera un due piante differenti di specie differenti, alcuni geni sono conservati, si parla di almeno il 60% siccome molti processi sono comuni in tutte le piante.
• Collinearità: è un tipo più specifico di sintenia per cui si ha la conservazione non solo del repertorio genico, ma anche dell’ordine dei geni lungo i cromosomi in specie differenti. In piante filogeneticamente vicine, l’ordine dei geni di una pianta è condiviso con quello dell’altra pianta messa a confronto.

L’aumento della taglia del genoma è quindi dovuto alla ridondanza genica, agli eventi trascrizionali e a un terzo meccanismo che è la formazione del proprio assetto da diploide a poliploide. Si forma un poliploide quando non avviene una corretta disgiunzione meiotica, quindi quando nella cellula somatica sono presenti più di due corredi cromosomici di base, con un unico evento si assiste ad un aumento considerevole della quantità di DNA contenuta nel nucleo.

L’autopoliploidia è un fenomeno che prevede la moltiplicazione di corredi cromosomici appartenenti a una stessa specie dove in precedenza c’è stato un ritardo nella divisione mitotica che porta già al raddoppiamento dell’assetto aploide della pianta ed in seguito alla formazione di organismi diploidi. Una pianta poliploide è più forte e riesce a resistere meglio negli ambienti poco ospitali, con un maggior numero di frutti ed una composizione maggiormente vigorosa. L’allopoliploidia è un altro aspetto fondamentale delle piante per cui avviene l’ibridazione interspecifica tra organismi con due genomi differenti; l’ibrido formato è generalmente sterile per mancanza di cromosomi omologhi. Uno dei primi esperimenti condotti furono fatti cercando di incrociare piante di ravanello con piante di cavolo, avendo un patrimonio genico completamente diverso e distante; infatti, si vide che non si riuscì mai ad ottenere un ibrido siccome c’era l’incompatibilità genica.

Paradosso del valore C

Genoma plastidiale e mitocondriale

Gli altri due organelli che si trovano nella cellula vegetale e che presentano un proprio assetto cromosomico sono i mitocondri e i cloroplasti. È noto che questi due organelli sono stati originati da fenomeni di endosimbiosi per i quali il primo deriva da un’endosimbiosi dovuta ad un batterio filogeneticamente correlato alla classe degli α-proteobatteri, mentre il secondo deriva da un cianobatterio.

Mitocondrio: Il DNA mitocondriale ha una forma circolare a doppio filamento non associato a proteine. Il genoma mitocondriale e plastidiale, a differenza di quello nucleare, non seguono le leggi di Mendel perché assumono una linea uniparentale, dove in alcune specie è portata avanti la linea materna in altre la linea paterna. Il DNA mitocondriale è di dimensioni variabili, ma strutturalmente molto semplice. Ricco di sequenze ripetute, la cui presenza permette fenomeni di ricombinazione che possono portare a un cambiamento nell’ordine dei geni, presentando inoltre numerose sequenze introniche. Il mitocondrio, insieme al cloroplasto, è semiautonomo ovvero codifica da sé le proteine che necessita. Il codice genetico mitocondriale, inoltre, è diverso perché codifica come amminoacidi triplette che solitamente sono riconosciute come stop (ad esempio l’arginina).

Cloroplasto: Il DNA plastidiale contiene al suo interno porzioni della molecola con un orientamento invertito, queste sequenze dette ripetute invertite separano due regioni a singola copia che hanno dimensioni differenti. Molte delle sequenze presenti nel genoma plastidiale, sono state “rilasciate” nel genoma nucleare per evitare che geni essenziali vadano persi. I geni del plastidio codificano la maggior parte degli enzimi che lavorano per la fotosintesi e circa 45 geni che codificano per l’RNA transfer. Alcuni tipi di proteine più complesse con molte subunità, come la Rubisco, quelle più grandi sono codificate dal genoma plastidiale, le piccole dal nucleo, questo perché le proteine del cloroplasto hanno un meccanismo di riconoscimento che permette di far entrare nell’organello queste subunità sotto forma di struttura primaria grazie anche alle sequenze segnale che le marcano come polipeptidi di transito permettendo l’assemblaggio all’interno.

Quante molecole di DNA ci sono all’interno del mitocondrio? Si può arrivare ad avere anche 100 copie siccome i mitocondri tendono a fondersi tra di loro, dando vita così anche a una fusione del loro contenuto genico e a fenomeni di ricombinazione.

Colture in vitro

Durante il ciclo vitale, la crescita di una pianta ha caratteristica bipolare; all’inizio le cellule sono poco vacuolizzate e solo alcuni processi sono accesi come quelli coinvolti nella divisione cellulare. La maggior parte delle cellule coinvolte sono quelle meristematiche, parlando di ontogenesi ricorrente, siccome non differenziate, principalmente reperibili in apici del germoglio o gemme ascellari. Grazie a ciò, nel punto dei nodi, le cellule possono promuovere la formazione o della foglia o del fusto o delle radici. Si evidenzia, quindi, la non distinzione tra le cellule che daranno origine alla linea somatica e quelle che daranno origine alla linea germinale, infatti, durante il ciclo vitale della pianta, tali cellule sono in continua divisione e produrranno continuamente tessuti e organi. Alcune cellule, inoltre, depositano una seconda parete cellulare e non si riesce a farle resettare, per questo motivo è importante sceglierle non differenziate prediligendo le meristematiche largamente più facili da resettare.

Una cellula non differenziata è conducibile in laboratorio alla formazione di varie parti della pianta, sfruttando una caratteristica che è chiamata totipotenza: se posta in condizioni di avere tutti i nutrienti possibili, attraverso l’aggiunta di fitormoni (quali auxine, citochinine, acido abscissico, etile e gibberelline) si promuove la scissione cellulare e la formazione della pianta da una parte di pianta madre. Per potersi differenziare, la cellula vegetale deve uscire dal ciclo cellulare e deve rimanere in una fase G quiescente, resettare tutto e rientrare nel ciclo cellulare. Per poter applicare questo meccanismo, avviene un fenomeno che è chiamato rigenerazione.

Tipologie di espianto

Il tipo di espianto utilizzato è per scegliere la diversa tecnica scelta per avere formazioni di piante poliploidi o eccezioni di tecniche scelte per avere formazioni di piante aploidi. Le varie tipologie sono:

• Tessuto meristematico: la tecnica scelta è detta di micropropagazione, in cui per tempi brevissimi vengono prodotte molte piantine identiche tra loro (cloni).
• Ovario o embrione: il processo prende il nome di embriogenesi.
• Cellule aploidi: il cui processo prende il nome di androgenesi se la cellula coinvolta è maschile, ginogenesi se femminile. Ricordando sempre che le piante aploidi non riusciranno a produrre gameti funzionali siccome sono deboli e non riescono ad affrontare gli stress ambientali a cui sono sottoposte.
• Protoplasto: parliamo di una cellula vegetale modificata privata della parete cellulare e la lamella mediana, andando incontro ad una trasformazione genica.
• Organo: processo detto organogenesi.
• Callo: descrivibile come un ammasso di cellule impilate le une sulle altre in maniera disorganizzata che danno origine o a linee resistenti o a piante che presentano delle varianti somaclonali (all’interno della cellula somatica si è accumulata una mutazione che si verifica durante la maturazione).
• Cellula a assetto diploide quindi somatica: processo detto embriogenesi.

Solo alcune delle tecniche esposte possono essere utilizzate in maniera comune, l’organogenesi, ad esempio, non è una di queste perché dipende dal genotipo della pianta, ricordando che anche all’interno della stessa specie possiamo trovare genotipi diversi. La micropropagazione è un termine che si riferisce a una tecnica di propagazione vegetativa che consiste nella moltiplicazione di piante attraverso la coltura dei loro impianti. Le cellule e i tessuti interessati sono di natura meristematica, facendo crescere piante durante stagioni sfavorevoli, creando cloni (quindi identici genotipicamente) per avere specie vegetali resistenti ad un determinato parassita, che sviluppino frutti buoni o resistenti ad estremi di temperatura.

Per poter attuare tale tecnica, però, bisogna porre alcuni accorgimenti:

• Asepsi: non devono essere presenti batteri o funghi, perché se si pensa alla rapidità con cui si divide una cellula vegetale in un mezzo di coltura, questa è minore rispetto alla velocità di crescita dei batteri e nel momento in cui si andrà a far sviluppare l’espianto essi prenderanno il sopravvento, sottraendo ad esso sia nutrimento che ossigeno (generando fenomeni di anossia).
• Il terreno di coltura deve avere tutti i nutrimenti essenziali che sono acqua che è al 95% e deve essere distillata, sali minerali, vitamine, zuccheri, fitoregolatori ed agenti solidificanti. Riveste questa notevole importanza siccome fornisce sostanze nutritive e composti ad azione regolatrice che sono essenziali nello sviluppo e nella rigenerazione delle cellule.
• L’ambiente in cui la pianta cresce deve essere controllato con condizioni stabili di temperatura, intensità luminosa, ore di luce e ore di buio, umidità perché assicura l’idratazione dei tessuti utilizzando strutture come le celle (fitodrone).
• PH della soluzione che deve essere intorno ai 5.2 e i 6.5 in base alla specie vegetale e i nutrienti di cui necessita.

L’asepsi è garantita dalla sterilizzazione delle superfici di lavoro e degli strumenti da utilizzare - generalmente si utilizza l’autoclave a pressione con temperatura di 121°C per 15-20 minuti nella realtà circa due ore e mezza. Le sostanze che si ritrovano nel mezzo di coltura si dividono in macronutrienti - quali azoto, ossigeno, calcio e carbonio sottoforma di saccarosio, fruttosio o mannitolo - e micronutrienti - come il ferro che nella soluzione tende a precipitare con cloro e calcio. Il terreno può essere solido formato da sostanze naturali che non devono interferire con i processi fisiologici della pianta come, ad esempio, l’agar o i sali di alginati usati per le colture di protoplasti; oppure può essere liquido che è quello con più vantaggi siccome sottoposto ad agitazione e a cui può essere data aria. All’interno del terreno di coltura solido possono presentarsi delle zone in cui c’è mancanza di nutrienti, pertanto, si creano varie subculture. Come detto in precedenza, ad un certo punto dello sviluppo della coltura devono essere dati alla pianta i fitormoni per poter farla sviluppare interamente o in parte.

Fitormoni principali

• Auxina: la più importante è l’IAA (l’acido 3-indolacetico), normalmente venduto, può essere naturalmente estratto dalla cellula vegetale nonostante sia più costoso date le piccole quantità presenti, oppure prodotto di sintesi. Quest’ultime sono particolari siccome dipendono dall’organismo indotto alla produzione, molte volte può capitare che i ripiegamenti proteici sono diversi e potrebbero non funzionare correttamente, nonostante promuovano la sintesi cellulare possono scatenare effetti mutageni. Il ruolo principale è quello di aumentare la distensione cellulare (infatti è prodotto principalmente negli apici dei germogli e migra verso il basso) inducendo una divisione cellulare che va a stimolare la produzione di radici.
• Citochinine: antagoniste delle auxine perché possiedono la capacità di inibire la radicazione, inducono la formazione dei germogli. Anche in questo caso abbiamo un utilizzo di derivati naturali o di sintesi con probabile formazione di mutazioni successive.
• Gibberelline: raramente utilizzate, aiutano ad aumentare l’altezza del fusto.

Organogenesi: si parte dal pezzettino d’organo della pianta. Embriogenesi: l’embrione utilizzato è somatico (e non zigotico) perché deve essere uguale alla pianta madre. La crescita delle cellule è detta esodiametriche, la serie di sostanze coinvolte servono successivamente alla divisione cellulare. Una volta divise la cellula deve resettare il proprio macchinario enzimatico, il tutto avviene all’interno dell’aggregato che si è formato sotto forma di macchie polarizzate. Il terzo stadio che viene fuori dall’embriogenesi porta alla formazione di due livelli: “a cuore” e “a torpedo”.

Sia l’embriogenesi che l’organogenesi possono essere dirette o indirette, ovvero, possono prendere avvio direttamente dall’espianto o da un passaggio intermedio che è definito callo.

Quattro fasi sono utilizzate per la formazione e la crescita della specie vegetale scelta, esse prevedono anzitutto il trattamento fitosanitario per eliminare la presenza di batteri o altro; successivamente i pezzettini vengono trasferiti nella vetreria che prevede un coperchio non del tutto sigillato come garze o membrane. La terza fase prevede l’aggiunta di fitormoni in sequenza, i primi ad essere aggiunti sono le citochinine fin quando la pianta non raggiunge una determinata altezza per far spuntare le radici, a questo punto viene aggiunta l’auxina.

Se i due fitormoni sono messi nella stessa concentrazione, le cellule non hanno chiari segnali su come ed in cosa dividersi così impazziscono formando un prodotto chiamato callo. Esso è un groviglio di cellule disorganizzate ed unite le une con le altre perché non riescono a mantenere un corretto orientamento, la sua formazione viene promossa in laboratorio e può risultare utile nel momento in cui si necessita la conservazione di un tessuto per un lungo periodo di tempo dato che non si può ricorrere al congelamento del campione. Per riutilizzarlo, esso viene scelto e separato come friabile e compatto, successivamente viene posto nel terreno di coltura liquido in modo tale da sgretolarlo per agitazione. Tale tecnica è poi largamente utilizzata anche per effettuare una scelta tra le cellule in sospensione di una particolare linea cellulare che risulta maggiormente resistente a determinati agenti.