Biotecnologie Vegetali

Biotecnologie vegetali

Libro: biologia cellulare e biotecnologie vegetali, Gabriella Pasqua. Biotecnologie e genomica delle piante, Gnocchi.

Coltura in vitro di tessuti e cellule vegetali

Cosa si intende con coltura in vitro?

Insieme delle tecniche che permettono di coltivare, crescere delle parti di vegetali (espianti) su un mezzo di coltura in condizioni adatte, in condizioni di sterilità ed ambiente controllato, al fine di ottenere cloni della pianta. Murashige è stato uno dei maggiori ricercatori in questo campo.

In cosa consiste una coltura in vitro?

Bisogna per prima cosa prelevare un tessuto da una pianta donatrice, quindi prendere un espianto. Tutti i tessuti della pianta possono essere messi in coltura (foglia, fusto, radice). All’interno di una pianta ci sono dei tessuti particolari che sono i meristemi.

Cosa sono? (Differenza tra cellule meristematiche e somatiche) Le cellule meristematiche sono indifferenziate. Quali sono le cellule che si duplicano? Quelle meristematiche. Mentre gli animali arrestano la loro crescita raggiunta una certa dimensione o età (crescita determinata), le piante continuano a crescere durante tutto il loro ciclo vitale (crescita indeterminata). I meristemi generano continuamente nuove cellule.

Ciò fornisce alle piante un modo semplice di risolvere il problema dell’invecchiamento: quando un organo è vecchio viene sostituito da uno nuovo (abscissione fogliare). L’accrescimento delle piante è a carico delle cellule meristematiche che si duplicano. Dalla divisione si ha una parte che rimane indifferenziata e una parte che si differenzia.

Quanti meristemi ci sono? Un meristema è nella parte apicale (localizzato all’estremità delle radici e delle gemme dei fusti permettono l’allungamento -> crescita primaria), un altro meristema è nelle radici che crescono e hanno lo scopo di andare ad esplorare il terreno; questi sono meristemi primari. Meristemi laterali: ispessimento dei fusti e delle radici -> crescita secondaria. Ci sono poi i tessuti differenziati: foglie, fiori, etc.

L’espianto può essere preso sia da meristemi che da tessuti differenziati. SAM, meristema apicale del germoglio: le cellule meristematiche sono molto piccole, molto dense, con nucleo molto grosso, poco citoplasma, cellule il cui scopo è quello di differenziarsi. All’apice del germoglio una piccola massa di cellule in continua divisione. Sono le progenitrici di tutte le cellule del germoglio.

Inoltre formano nuovi meristemi che daranno luogo alle gemme ascellari, quiescenti fino all’arrivo dello stimolo ormonale. SAM ha la funzione di produrre la parte aerea del corpo vegetativo della pianta (fusto e foglie) ma per effetto di stimoli ambientali e/o ormonali il SAM può convertirsi nel meristema fiorale che produrrà i primordi fiorali e poi la struttura riproduttiva matura (fiore) con i vari organi (sepali, petali, stami, carpelli).

Stimoli ambientali, in primo luogo luce e temperatura regolano l’attività del SAM, attraverso la variazione dei livelli di alcuni ormoni. Questi ultimi attivano cascate geniche che controllano nel meristema la velocità di divisione cellulare, la dimensione del meristema, l’esatta posizione in cui si formano gli organi (primordio fogliare) e la velocità di crescita dell’organo.

RAM, meristema radice: è presente all’apice di ogni radice appena al di sotto della cuffia, la struttura che protegge il meristema quando la radice cresce nel suolo. La radice stessa si origina da poche cellule iniziali (da 3 a 6).

Caratteristiche delle cellule meristematiche

• Cellule piccole (circa 10 μm) senza spazi intercellulari
• Elevato rapporto nucleo/citoplasma
• Citoplasma denso ricco di organuli
• Provacuoli o piccoli vacuoli
• Proplastidi
• Mitocondri piccoli con poche creste in divisione
• Parete cellulare sottile che viene riformata dopo la divisione

Cellule vegetali

Il primo passaggio delle colture è il prelievo della parte apicale, si parla di micron, lavoro fatto sotto il microscopio. Questo meristema si mette in coltura, cosa vuol dire? Metterlo in una situazione in cui possa attrarre nutrimento necessario per la sopravvivenza delle cellule. Le cellule poi crescono e si moltiplicano e si può avere proprio una piantina, sotto opportuni stimoli ormonali posso indurla a mettere radice.

Quando si ha una struttura di questo tipo si può prelevare e mettere in terra. Questo dice che si possono ottenere delle piante (anche parecchie) da delle cellule meristematiche, non da cellula uovo fecondata. Da un meristema si possono ottenere svariate piante. Come saranno queste piante rispetto a quella donatrice? Sono dei cloni! Dal seme non si ottengono cloni della pianta madre, sono geneticamente diversi.

Tessuto differenziato

È possibile prendere un tessuto (ad esempio dalla foglia) e metterlo in coltura, soluzione che dà nutrienti fondamentali per la sopravvivenza. A noi interessa che anche da un pezzetto di foglia nasca una pianta clone della pianta madre. Anche da tessuto completamente differenziato, incapace in natura di differenziarsi, se messo in opportune condizioni è capace di rigenerare: morfogenesi diretta o indiretta.

Morfogenesi diretta

Dagli espianti si generano nuovi organi (radici, foglie), si parla di organogenesi diretta. Per organogenesi diretta si intende la formazione di organi, germogli o radici, direttamente da tessuto somatico in coltura. La capacità di dare origine a germogli direttamente è propria di un numero ristretto di specie e può essere limitata da alcuni tessuti o organi.

Tessuti organizzati come foglie, radici, fusti, perdono la loro struttura specializzata e sono in grado di riconvertire il loro programma fisiologico. Alcune cellule dell’espianto sono in grado di generare delle foglioline. A questo punto cosa succede? Si può staccare la parte che si è formata (poche foglioline), metterla in un mezzo di coltura che induce la formazione di radice e poi avere la pianta da mettere in terra.

Tessuto somatico perché deriva dal soma, dal corpo della pianta. Cosa c’è dietro processo? Alcune cellule perdono la “memoria” della loro differenziazione, recuperano la capacità di cellule meristematiche e sono capaci di produrre delle nuove strutture. Processo che comporta due fasi:

1. Induzione: cellule perdono la memoria e riacquistano la capacità di dividersi, in questa fase però non si vede ancora nulla.
2. Determinazione: queste cellule riescono a formare delle strutture (apici radicali/apicali) e questa capacità di rigenerare è specie-specifica, dipende molto dalla specie vegetale con cui si lavora. Alcune specie ad esempio il tabacco, petunia rigenerano molto facilmente; altre rigenerano con molta più fatica o alcune non rigenerano affatto. Ciò che c’è sotto questa diversa risposta è che molto probabilmente non si conoscono le condizioni ottimali per tutte le specie.

Ogni specie necessita di un determinato apporto di sostanze specifiche e concentrazioni ottimali di ormoni. La stabilità genetica è discreta.

Come si propagano le piante? Riproduzione sessuale, ma anche in modo asessuale. Alcune cellule di strutture differenziate acquistano la capacità meristematica, ad esempio di creare germogli.

Embriogenesi somatica diretta

L’embriogenesi somatica diretta consiste nella produzione di embrioni da cellule somatiche o non germinanti. Tali embrioni sono capaci di percorrere la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione dell’embrione zigotico. Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare che evolve in un embrione cotiledonare.

In questo caso le cellule dell’espianto non buttano subito fuori radice e foglie, ma formano delle strutture che ricordano l’embrione e seguono tutti i passaggi tipici dello sviluppo dell’embrione zigotico. Si formano dei veri e propri embrioni zigotici da cellule somatiche e sono in grado di ripercorrere gli steps tipici dello sviluppo dell’embrione.

Da zigote -> struttura globulare -> struttura a cuore (differenziazione SAM e RAM) -> struttura cotiledone -> maturazione, essiccazione, dormienza -> crescita, germinazione. A partire dallo stadio globulare è possibile osservare la progressione della polarità attraverso uno stadio a cuore, a torpedo fino alla formazione dei cotiledoni e la completa differenziazione della plantula.

Da espianto -> cellula va incontro a differenziamento e dà origine a delle strutture -> identiche a quelle dello zigote -> direttamente piantina. Seme immaturo -> induzione degli embrioni somatici -> proliferano e si sviluppano -> si staccano e germinano -> coltivazione in vaso.

Stadio di embriogenesi

Un embrione è caratterizzato dalla sua origine, morfologia e sua evoluzione nel tempo.

• Origine: un embrione zigotico è il risultato della fusione di cellule gametiche. Per la formazione dell’embrione somatico non è necessaria questa fusione.
• Morfologia: un embrione completo è un asse bipolare con un meristema apicale e uno radicale. È inoltre caratterizzato da cotiledoni.
• Evoluzione: lo sviluppo dell’embrione è caratterizzato da una successione di stadi morfologici tipici -> globulare, a forma di cuore e torpedo o cometa.

Cosa induce la morfogenesi diretta e l’embriogenesi somatica diretta? Dipende dalle specie: alcune solo organogenesi, altre solo embriogenesi, altre possono fare entrambe.

Morfogenesi indiretta

La morfogenesi indiretta consiste in un passaggio di sdifferenziazione prima della formazione di nuove strutture organizzate. In questo caso tessuti organizzati come foglie, radici, fusti perdono la loro struttura specializzata per accrescersi sotto forma di un ammasso di cellule disorganizzate che prendono il nome di callo.

Il tessuto differenziato può sì differenziare per morfogenesi diretta, ma anche per quella indiretta. In quella indiretta non si ha la formazione di radici, foglie o embrione direttamente dalle cellule dell’espianto, ma c’è un passaggio in più in quanto si forma una struttura che si chiama callo. Dal tessuto differenziato, come ad esempio una foglia, si formano degli ammassi molto visibili di tessuto indifferenziato, formato da cellule che hanno una morfologia molto diversa.

In alcuni casi è bianco, in altri è verde, in alcuni casi è estremamente colorato perché assumono dei pigmenti fotosintetici. Quindi il callo è specie-specifico. Nel tabacco ha un aspetto più spugnoso ed è bianco, mentre il callo dell’Arabidopsis è sempre bianco, ma sembra più duro, sembra corallo.

Le cellule del callo hanno un vacuolo molto piccolo, nucleo molto grande e molto evidente. Simili alle cellule meristematiche. Il callo è inoltre capace di proliferare indefinitivamente: le cellule del callo sono potenzialmente immortali. Le cellule del callo sono anche in grado di differenziarsi e rigenerare delle piante sotto una serie di condizioni, un gran numero di variabili:

• Genotipo, parametro importante nel determinare il successo del passaggio a callo. Per esempio, le monocotiledoni sono più recalcitranti a formare il callo delle dicotiledoni. Varietà di riso japonica formano callo da molti tessuti.
• Dimensione ed età espianto.
• Condizioni di coltura, ogni specie necessita di un determinato apporto di sostanze specifiche e di particolari condizioni ambientali, quali quantità, intensità radiazione luminosa e fotoperiodo.

Intorno alla ferita la pianta deposita del nuovo materiale cellulare, per evitare infezioni da patogeni e questo si ha tramite induzione. Il tessuto che si forma è un tessuto che è molto vicino a quello che è stato chiamato callo in coltura in vitro perché non è un tessuto differenziato, tessuto che è cresciuto rapidamente.

Rigenerazione del callo

Può ridifferenziare a dare un’intera piantina e può differenziare per organogenesi o embriogenesi somatica -> possono derivare o degli organi o degli embrioni. In questo caso si dice organogenesi indiretta o embriogenesi somatica indiretta per indicare un ulteriore passaggio, ovvero la formazione del callo.

Cosa fa imboccare una strada o un’altra? È sempre un discorso specie-specifico. Nel caso della vite vanno bene vari tipi di espianti (foglie, fiori o embrioni somatici) questi formano un callo embriogenico che può dare origine ai vari embrioni somatici.

Tecniche di coltura in vitro

Si basano su due caratteristiche delle cellule vegetali: plasticità e totipotenza.

Plasticità: capacità di adattamento dei tessuti vegetali al variare delle condizioni ambientali. Totipotenza: capacità della cellula vegetale anche completamente differenziata di esprimere tutta la potenzialità genetica di una cellula meristematica.

Le piante sono immobili, quindi devono far fronte al circondario che cambia in situ. Che cambia cosa vuole dire? Escursioni termiche non opportune, raggi UV, attacchi patogeni. Riescono a riadattarsi metabolicamente in modo molto veloce, crescita e sviluppo in funzione dell’ambiente che cambia. Una delle strategie ad esempio è quello di arrestare la crescita.

Per quanto riguarda la totipotenza: cellule totalmente differenziate presentano silenziamento genetico che è reversibile. A differenza delle cellule animali che possono rigenerare altri organismi solo a partire da cellule della linea germinale, nelle piante qualunque tessuto può dar origine ad un nuovo individuo.

Con tecniche di micropropagazione in vitro, utilizzando degli espianti, si può indurre la perdita del programma differenziativo. I calli sono colture di tessuti indifferenziati che possono essere mantenute per lungo tempo in coltura, da cui possono essere rigenerate piante intere o fertili.

Micropropagazione: crescita in vitro.

Pulizia mezzo di coltura -> preparazione nutrienti del terreno -> selezione e sterilizzazione dell’espianto -> morfogenesi diretta o indiretta.

Espianto

Può essere prelevato da ogni parte della pianta! Più un tessuto è giovane più dà garanzie di rispondere meglio in vitro. Partendo da foglie di solito si fanno dei quadratini perché è meglio avere in coltura strutture con le medesime dimensioni, né troppo piccole né troppo grandi.

Bisogna lavorare con bisturi o altri strumenti e può portare ad un danno delle cellule, bisogna essere delicati. Più piccolo è l’espianto minori sono i rischi di fitopatie. I tessuti più interni sono meno contaminati. Lo stadio giovanile dell’espianto influisce sul successo della coltura. Le condizioni della pianta influiscono sul successo della coltura, se la pianta è sana, vigorosa e giovane ho più garanzie di successo.

Sterilizzazione – condizione di asepsi

Caratteristica peculiare di tutti i tipi di coltura in vitro è la necessità di operare e mantenere condizioni di asepsi rese necessarie dalla presenza nel substrato nutritivo di zuccheri e di altri composti organici che favorirebbero lo sviluppo di microrganismi inquinanti.

Sterilizzazione superficiale del materiale di partenza, sterilizzazione degli strumenti e dei materiali utilizzati e infine sterilizzazione dei substrati nutritivi. La buona sterilizzazione del materiale vegetale prevede che: i microrganismi contaminanti vengano completamente eliminati e che il tessuto non venga danneggiato -> tempi di impiego e concentrazione degli agenti sterilizzanti vanno messi a punto a seconda della sensibilità dei tessuti e della difficoltà di sterilizzazione.

Ad esempio le foglie vanno sterilizzate perché su di esse ci possono essere dei patogeni perché messe in un terreno di coltura prolifererebbero i microrganismi presenti sull’espianto che si moltiplicano più rapidamente della cellula vegetale. Bisogna sterilizzare il materiale di partenza (espianto), anche tutto il materiale che viene in contatto con la coltura in vitro: mezzo di coltura, strumenti da laboratorio (pinzette ad esempio).

I tempi di impiego e la concentrazione degli agenti sterilizzanti vanno messi a punto a seconda della sensibilità di tessuti e della difficoltà di sterilizzazione. Bisogna assicurarsi che i detergenti sterilizzanti non vadano ad intaccare, a danneggiare l’espianto, le cellule dell’espianto.

Protocollo

• Tagliare il materiale vegetale in porzioni di grandezza appropriata.
• Sciacquare il materiale vegetale sotto acqua corrente.
• Agitare in alcool per pochi minuti (alcool al 70% è più efficace per denaturare le proteine).
• HgCl₂ (0.1-1%) + 2 gocce/100 mL di TWEEN 20 per 3-5 minuti (attività basata sull’azione del Cl e metalli pesanti che denaturano le proteine).
• Risciacquare in acqua distillata sterile.
• Ipoclorito di sodio (NaOCl, varichina commerciale) 7-15% + 2 gocce/100 mL di TWEEN20 per 10-30 minuti.
• Risciacquare diverse volte in acqua sterile distillata.

Il TWEEN è un detergente che serve per abbassare la tensione superficiale, questo comporta la formazione minore di microbolle sulla superficie, serve per aumentare l’efficienza della sterilizzazione. Ci sono dei materiali che sono molto ostici da sterilizzare, ad esempio: foglie di eucalipto, è difficile arrivare a sterilizzare sotto la cera; anche le foglie di salvia sono difficili da sterilizzare.

Le cappe che vengono utilizzate sono quelle a flusso laminare. La formazione di microbolle sulla superficie dell’espianto potrebbe proteggere microbi e funghi dal contatto con il solvente di sterilizzazione. L’aggiunta di detergenti riduce la tensione superficiale sulla foglia.

Ambiente di coltura

Si può utilizzare una piastra Petri, in vasi di vetro, in tubi, piastre Magenta (alta per permettere la crescita de