Biologia molecolare - Appunti completi

Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

Introduzione alla biologia molecolare

La biologia molecolare è una materia simile alla biochimica e studia i fenomeni biologici a livello molecolare.

Questa definizione tuttavia non permette di distinguere la biologia molecolare alla biochimica perché di fatto anche

quest’ultima studia i fenomeni biologici a livello molecolare.

• La definizione è stata allora più ristretta, per cui la biologia molecolare studia la struttura e la funzione dei geni

a livello molecolare, quindi, si occupa soprattutto di quello che riguarda il DNA mentre la biochimica si occupa

del metabolismo di tutte le altre macromolecole che compongono le cellule.

Un gene è una parte di DNA che codifica per una catena polipeptidica.

Nell’accezione classica di questo termine, il gene codifica una parte di proteina, ma questa definizione non è

completamente corretta perché quando parliamo di proteine parliamo di strutture amminoacidiche alle quali è

associata una funzione e, come ben sappiamo, ci sono proteine costituite da una singola catena polipeptidica e proteine

costituite da più catene polipeptidiche diverse.

Quindi nel caso di una proteina costituita da più catene polipeptidiche il gene che codifica per quella proteina non può

essere uno solo, ma ci sarà un gene per ogni catena polipeptidica diversa.

• Quindi i geni sono quei tratti di DNA che codificano per una catena polipeptidica che può essere una proteina

o una subunità funzionante.

La storia dei geni risale al 1800 in particolare al 1865 quando Mendel definì che i tratti somatici che venivano trasmessi

dai genitori ai figli venivano trasmessi sotto forma di unità/particelle genetiche.

Queste unità sappiamo ora essere i geni.

Scoperta degli acidi nucleici e dogma centrale della biologia molecolare

La caratteristica principale degli acidi nucleici è la loro capacità di autoreplicarsi.

Questa capacità ha permesso la comparsa delle prime forme di vita nella Terra primordiale.

Infatti, tra i componenti dell’atmosfera primordiale c’era acido cianidrico.

Dalla condensazione di più molecole di HCN si può formare l’adenina, che è una base azotata, che può poi associarsi ad

uno zucchero costituendo il nucleo di base dei nucleotidi, i quali a loro volta possono formare gli acidi nucleici.

La storia degli acidi nucleici risale solamente alla seconda metà dell’800 quando Friedrich Miescher scoprì che trattando

con una soluzione alcalina i nuclei purificati da leucociti si aveva un precipitato che oltre a C, H e O, conteneva molto

azoto (14%) e fosforo (3%).

Questa sostanza non era né una proteina né uno zucchero e venne chiamata nucleina, che in pratica è la sostanza con

cui sono fatti i nuclei.

Grazie a delle tecniche di microscopia, si è visto che questa nucleina era organizzata in strutture più complesse, ovvero

i cromosomi.

Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

I cromosomi sono costituiti a loro volta da due componenti fondamentali, che sono la nucleina vera e propria e le

proteine.

Il primo problema che si pose ai ricercatori, che studiavano il coinvolgimento dei cromosomi nella divisione cellulare fu

proprio quello di decidere a quale di queste due sostanze fosse da attribuire il ruolo di conservazione dell’informazione

genetica.

Furono i lavori di Watson e Crick, pubblicati a partire dal 1953, che stabilirono il ruolo cruciale degli acidi nucleici nella

conservazione e nella trasmissione dell’informazione genetica.

• Il DNA e gli acidi nucleici sono responsabili del trasferimento delle informazioni all’interno delle cellule quindi

diciamo che il DNA contiene l’informazione genetica.

• Il DNA si trova nel nucleo delle cellule eucariotiche e contiene le informazioni per la sintesi di tutti i componenti

cellulari ma queste informazioni, per poter dar origine ai componenti cellulari, devono essere trascritte su una

molecola di RNA.

• L’informazione codificata in una molecola di DNA è trascritta mediante la sintesi di una molecola di RNA, l’RNA

messaggero.

• La sequenza di RNA viene letta da particolari strutture responsabili della sintesi delle proteine, i ribosomi, che

traducono il messaggio contenuto nella molecola di RNA nella sequenza amminoacidica di una proteina.

Questo è il dogma centrale della biologia molecolare:

• L’informazione all’interno di una cellula passa dal DNA all’RNA messaggero. L’mRNA a sua volta diventa il

substrato per la sintesi proteica (DNA a RNA a proteine).

Il DNA può subire due processi fondamentali:

• Duplicazione/replicazione

Si verifica quando le cellule si duplicano perché di fatto

bisogna assicurare un corredo di DNA esattamente identico a

quello della cellula originale.

E’ quindi un processo che permette di duplicare il materiale

genetico.

• Trascrizione

Il messaggio contenuto nella molecola di DNA viene trascritto

sulla molecola di RNA messaggero e l’mRNA così prodotto

serve per la sintesi delle proteine. Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

Nucleotidi

Struttura dei nucleotidi

I nucleotidi sono le unità di base degli acidi nucleici.

Ci sono cinque diversi nucleotidi che formano le basi azotate:

• Le basi azotate dei nucleotidi comprendono due tipi di purine e tre tipi di pirimidine.

Per ogni acido nucleico abbiamo quattro nucleotidi:

• Il DNA contiene i deossiribonucleotidi adenina, guanina, citosina e timina.

• L’RNA contiene i ribonucleotidi adenina, guanina, citosina e uracile.

Gli acidi nucleici sono di due tipi e sono il DNA e l’RNA.

La differenza fondamentale tra queste due molecole sta in uno dei componenti dei nucleotidi, che è lo zucchero.

• Lo zucchero può essere un ribosio come nell’RNA o un deossiribosio come

nel DNA. I ribonucleotidi possono

contenere A, G, C e U mentre i deossiribonucleotidi A, G, C e T.

I nucleotidi sono costituiti da tre componenti:

• Zucchero pentoso (a 5 C)

Lo zucchero è a 5 atomi di C e può essere o il ribosio (per l’RNA) oppure il deossiribosio (per il DNA).

La differenza tra i due zuccheri è la mancanza del gruppo -OH sul C2 del deossiribosio.

• Base azotata

Lo zucchero poi si lega tramite un legame glicosidico ad una base azotata, che può essere purinica o

pirimidinica.

- Le pirimidine hanno come base l’anello pirimidinico (eterociclo in cui ci sono 2 N in posizione 1-3)

- Le purine hanno come base l’anello purinico (struttura aromatica biciclica costituita da un anello

pirimidinico e un anello imidazolico).

Le basi azotate sono normalmente legate sul C1 del ribosio o del deossiribosio.

• Residuo fosforico

Il terzo componente è l’acido fosforico, o meglio il gruppo fosfato che si lega al C5 o al C3 di entrambe le

molecole di zucchero.

Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

Le basi azotate

Le basi azotate sono cinque in tutto e si dividono in pirimidine e purine.

• Le pirimidine hanno come nucleo centrale l’anello pirimidinico e sono tre: la citosina C, la timina T e l’uracile

U.

• Le purine invece sono due e il nucleo di base è l’anello purinico (che deriva dalla condensazione di due

eterocicli, pirimidina e imidazolo): sono l’adenina A e la guanina G.

Come possiamo vedere da queste immagini, nelle molecole sono presenti delle funzioni carboniliche che sono in

equilibrio con le forme enoliche.

Infatti, le basi azotate possono sottostare ad una tautomeria cheto-enolica (tranne l’adenina). La forma chetonica è più

stabile rispetto a quella enolica, quindi, queste molecole stanno in un tempo maggiore nella forma chetonica (vedi

“chimica organica II”).

Il fatto però che ci siano le forme enoliche sarà molto importante durante il metabolismo degli acidi nucleici.

Il fatto che le basi azotate possano modificarsi da una forma chetonica a una enolica e viceversa permetterà al processo

di biosintesi degli acidi nucleici di non riuscire a distinguere le diverse basi e quindi potrà essere motivo di inserimento

di basi sbagliati all’interno della molecola di DNA.

A pH fisiologico il tautomero chetonico è favorito rispetto a quello enolico.

Anche la tautomeria lattame-lattime (favorita la forma lattame per guanina, citosina, timina e uracile) e la tautomeria

ammina-immina (favorita la forma ammina per la guanina e l’adenina) è presente.

In seguito, le forme tautomeriche delle pirimidine: Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

In seguito, le forme tautomeriche della guanina:

Sono basi e quindi hanno un comportamento basico.

Possiamo riconoscere diversi pK acidi per le diverse strutture. L’immagine sotto mostra le pKa delle basi libere:

Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

La tabella mostra le diverse pK dei nucleotidi monofosfato in prima e seconda ionizzazione confrontati con quelli delle

a

basi libere:

Gli zuccheri pentosi dei nucleotidi

Gli zuccheri sono dei pentosi:

• Nell’RNA abbiamo il D-ribosio mentre nel DNA 2-deossi-D-ribosio.

La differenza sta nella mancanza del gruppo OH sul C2 nel deossiribosio.

• Questa differenza è molto importante perché modifica la struttura secondaria e la stabilità degli acidi

polinucleotidici.

La numerazione degli atomi di C è quella classica per cui il C1 è quello anomerico e tutti gli altri sono poi numerati di

conseguenza.

Per distinguere gli atomi dello zucchero da quelli della base azotata, nella numerazione si indicano i numeri degli atomi

dello zucchero con una sorta di apostrofo vicino (ex. 2’) e quelli della base azotata senza (ex. 2).

Come si legano le basi azotate con lo zucchero?

• Si legano con un legame glicosidico, in particolare con uno N-

glicosidico perché la base azotata utilizza l’azoto a differenza

dell’ossigeno (come invece abbiamo normalmente nei legami

glicosidici) per legarsi al C1 del pentoso.

Questo legame può presentarsi in due conformazioni: conformazione sin o anti.

Ciò che differenzia le due conformazioni è che nella sin la base azotata si trova direttamente

sopra l’anello dello zucchero mentre in quella anti si trova dalla parte opposta.

• La conformazione anti è quella preferita nella formazione dei nucleotidi perché

semplicemente in quella sin abbiamo l’N molto vicino all’ossigeno, generando una

repulsione tra i due atomi.

Quindi la conformazione sin è meno dominante rispetto a quella anti.

Abbiamo detto che il legame è di tipo N-glicosidico e si forma tra il C anomerico dello zucchero

(C1) e l’N 9 delle purine oppure l’N1 delle pirimidine.

Lo zucchero ha diversi gruppi polari e sono abbastanza solubili in acqua.

In realtà le basi azotate sono piuttosto idrofobiche e vedremo che l’idrofobicità delle basi sarà la caratteristica

fondamentale per la struttura finale degli acidi nucleici. Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

Nucleosidi

Le strutture costituite solo dallo zucchero e dalla base azotata prende il nome di nucleoside.

L’anello del ribosio non è completamente planare e può avere due diverse conformazioni.

Il C-2’ o il C-3’ dell’anello furanosico possono stare sopra o sotto il

piano definito dalla posizione degli altri 3 atomi (C-1’; O-4’ e C-4’)

(può essere un C2’ eso o C2’ endo e lo stesso vale anche per il C3’).

• Per convenzione la posizione del C-2’ o C-3’ viene definita

“sopra” il piano quando questi carboni sono dalla stessa

parte del C-5’ e della base azotata. Se il C2’ o il C3’ sono

posti sopra il piano la conformazione è definita endo (C-2’

endo e C-3’ endo).

• Se si trovano sotto il piano allora le conformazioni

corrispondenti vengono indicate come eso (C-2’ exo e C-3’

exo).

La conformazione preferita dipende dalla molecola quindi a seconda della presenza o meno di altri sostituenti sull’anello

e sulle basi.

Le conformazioni C2’ endo e C3’ endo sono in rapido equilibrio fra di loro. La presenza di sostituenti elettronegativi sul

C2’ favorisce la conformazione C3’ endo.

• Normalmente nell’RNA è preferita la conformazione C3’ endo mentre nel DNA quella C2’ endo.

Le basi azotate sono cinque, ma altri tipi di basi, in particolare nell’RNA transfer.

Ci sono infatti diversi tipi di RNA (non vale lo stesso per il DNA). Ci sono infatti:

• L’RNA messaggero che trasferisce l’informazione genetica dal DNA ai ribosomi per la sintesi delle proteine

(codifica il messaggio). A loro volta i ribosomi sono delle strutture che sono costituite da RNA ribosomiale e

dalle proteine.

• Vi è poi l’RNA ribosomiale (che si trova nei ribosomi insieme a delle proteine) e ha la funzione di fornire un

meccanismo che permette di decodificare l’RNA messaggero in sequenze amminoacidiche.

• Per la sintesi delle proteine è necessario anche un altro tipo di RNA, che è l’RNA transfer.

E’ l’RNA traduttore cioè è quello in grado di tradurre il messaggio portato dall’RNA messaggero e trasformarlo

nella catena polipeptidica.

Quindi il tRNA è in grado di associare al messaggio contenuto negli acidi nucleici l’amminoacido corrispondente.

Il tRNA contiene molte basi azotate inusuali non tipiche degli acidi nucleici, come per esempio la metilcitidina

(in generale sono delle modificazioni delle basi già presenti dovute per esempio a metilazioni).

Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

Nucleotidi

Distinguiamo quindi:

• Nucleoside = base azotata + zucchero pentoso.

Quando a questa struttura aggiungiamo anche il gruppo fosfato

otteniamo i nucleotidi.

• Nucleotidi = base azotata + zucchero + fosfato

(nucleoside + fosfato).

I nucleotidi sono esteri fosforici dei nucleosidi.

• Il fosfato può legarsi sia alla posizione 5’ del ribosio che alla posizione 3’ tramite un legame estere.

Per quanto riguarda soprattutto la posizione 5’ possiamo avere la presenza di un solo gruppo fosforico oppure

una catena polifosforica costituita da due o da tre residui fosforici.

Possiamo quindi avere dei nucleotidi mono- (NMP), di- (NDP) e tri-fosfati (NTP).

Ovviamente se abbiamo dei nucleotidi di/tri-fosfato, cioè aumentiamo il numero di gruppi fosforici legati alla funzione

alcolica, il primo fosfato che è legato allo zucchero presenta un legame estere, mentre gli altri gruppi sono legati

direttamente tra di loro tramite un legame anidridico, che, come sappiamo è ad alta energia.

Anche l’ATP è un nucleotide e che possiamo ritrovare sotto forma di ribonucleotide nell’RNA e di deossiribonucleotide

nel DNA. Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

Adesso vediamo la strutture dei nucleosidi e nucleotidi che troviamo nell’RNA:

Se si lega l’adenina al ribosio otteniamo un nucleoside chiamato adenosina, se poi leghiamo anche il gruppo fosforico

in posizione 5’ otteniamo l’adenosina 5’-monofosfato (AMP).

Se abbiamo la guanina otteniamo la guanosina e il nucleotide corrispondente è il GMP, ovvero la guanosina 5’-

monofosfato, e via dicendo per gli altri.

Il nome del nucleoside viene fatto utilizzando il nome della base con desinenza -sina o -idina.

I nucleotidi hanno diverse funzioni:

• Sono le unità strutturali degli acidi nucleici

• Costituiscono un deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato (ATP/GTP).

Quando i nucleosidi sono di o trifosfati i legami anidridici che si formano sono altamente energetici per cui i

nucleotidi risultano essere un deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato (come abbiamo visto

molte volte).

• Sono mediatori di processi cellulari (cAMP). I nucleotidi possono essere dei secondi messaggeri nei

processi cellulari, in particolare ricordiamo l’AMP ciclico o cAMP.

• Possono far parte di coenzimi (NADH, FAD, CoA).

• Intermedi di reazioni biosintetiche (S-Adenosilmetionina).

Biochimica e biologia molecolare: Nucleotidi

Tra i nucleotidi i più noti sono l’ADP e l’ATP:

• L’ATP come vediamo non è altro che un nucleoside trifosfato e in particolare un’adenosina trifosfato.

• L’ADP invece è sempre un’adenosina, ma difosfato. Ciò che differenzia le due strutture è la presenza o meno di

un residuo fosforico.

Il legame tra lo zucchero e il primo gruppo fosfato è un legame estere, quindi non è ad

alta energia.

I legami tra i fosfati α-β o β-γ sono invece dei legami altamente energetici.

Sia dall’ATP che dall’ADP può derivare l’AMP, cioè l’adenosina monofosfato.

Può derivare anche la sua forma ciclica, che è la più comune ed è l’adenosina

monofosfato ciclico o cAMP.

• Il cAMP è prodotto dall’adenilato ciclasi e praticamente è un secondo

messaggero per la trasduzione del segnale che passa dalla superficie cellulare

all’interno della cellula, attraverso quindi le membrane cellulari.

• L’AMP ciclico, essendo un secondo messaggero, come già visto va ad attivare

delle proteine chinasi a livello intracellulare.

• Un secondo messaggero analogo è cGMP ovvero la forma ciclica della guanosina monofosfato: la via di

segnalazione del cGMP è analoga a quella del cAMP ma ciò che cambia tra i due nucleotidi è di fatto la funzione.

Analoghi sintetici dei nucleotidi

Altre strutture nucleotidiche da menzionare sono gli analoghi sintetici dei nucleotidi.

Sono delle molecole che assomigliano ai nucleotidi che

abbiamo appena visto però sono sintetizzati chimicamente

e, non essendo dei veri e propri nucleotidi, possono essere

utilizzati per bloccare l’attività degli acidi nucleici, quindi

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