Biologia molecolare

Biologia molecolare – Prof. Mattevi

La struttura del DNA

Il DNA è il depositario dell’informazione genetica. Storicamente ciò si è dimostrato con un esperimento di Avery. Lui era un microbiologo, studiava batteri che causano polmonite e aveva due ceppi, l’S (smooth) patogeno e l’R (rough) non patogeno. Osservò che ceppo R poteva essere trasformato e diventare patogeno quando era in contatto con ceppo S. Il ceppo S patogeno inattivato al calore (fa bollire i batteri, li scalda a più di 90 gradi), ovvero il ceppo Sh (heat, inattivato) manteneva la sua capacità di trasformare il ceppo R in ceppo S patogeno.

Prese ceppi S e considerò le diverse frazioni, lui estraeva (separava una molecola dalle altre), le frazionava facendo precipitare le diverse frazioni e guardava quale molecola fosse capace di trasformare il ceppo R in S e scoprì che era il DNA. Dimostrava che il DNA è la molecola che porta con sé l’informazione genetica.

Qui nasce la biologia molecolare, con la struttura del DNA.

Il DNA è un polimero di deossinucleotidi in cui 2 filamenti si dispongono a definire una struttura a doppia elica, con i due filamenti antiparalleli perché ciascun filamento ha una sua direzionalità, si legge dal 5’ al 3’. Due filamenti complementari non sono uguali, il filamento AAA è complementare al filamento TTT.

Basi azotate

Più in dettaglio, devo sapere le strutture delle basi azotate. Purine: adenina e guanina (doppio anello), pirimidine: citosina e timina (singolo anello).

I sostituenti che contraddistinguono adenina e guanina sono i sostituenti sull’azoto 1, il carbonio 2 e il carbonio 6. L’adenina ha un gruppo amminico in posizione 6, e l’azoto in posizione 1 ha un doppietto libero. L’azoto in posizione 1 della guanina è protonato e sul C in posizione 2 c’è un gruppo amminico. Sono queste le differenze tra adenina e guanina che determinano il fatto che una è complementare ad una base e una all’altra.

Per le pirimidine è importante l’azoto 1 che è legato al C 1’ del ribosio. Nella timina i due C in posizione 2 e 4 hanno un O carbonilico e l’azoto in posizione 3 della timina è protonato. La citosina in posizione 4 ha un gruppo aminico, la posizione 2 ha O carbonilico, l’azoto in posizione 3 ha un doppietto libero che accetta legame a idrogeno. La differenza sta nella capacità di formare legami a idrogeno. Un gruppo amminico primario, essendo protonato, dona legami a H, l’azoto con lone pair riceve legami a idrogeno, O carbonilico riceve legami a H.

Questo è importante anche stericamente perché queste basi azotate possono essere scritte in più forme di risonanza. Vedo sulle slide la forma tautomerica della timina. Watson e Crick abbinarono adenina e timina perché avevano capito quali gruppi ricevevano e quali donavano legami a idrogeno. Questa fu informazione decisiva per Watson e Crick per costruire il modello della doppia elica, sapevano che A stava con T e G con C dal lavoro di Chargaff.

Le posizioni chiave delle purine sono 1, 2, 6; sulle pirimidine la 2, 3 e 4.

Guardo i legami tra le varie cose nella doppia elica. Tre legami a idrogeno tra G e C, due tra A e T.

Negli abbinamenti di Watson e Crick il gruppo amminico in posizione 6 dell’adenina dona un legame H all’O in posizione 4 della timina, l’azoto protonato della timina dona un legame a H all’azoto in posizione 1 dell’adenina che è deprotonato quindi ha un doppietto libero. Quindi A-T due legami H.

Tra G e C si hanno un O carbonilico in posizione 6 della guanina che riceve un legame H dal gruppo amminico in posizione 4 della citosina. L’azoto in posizione 3 della citosina è deprotonato, ha un doppietto libero, e riceve un legame H dall’azoto in posizione 1 della guanina che invece è protonato. Inoltre, l’O carbonilico del C in posizione 2 della citosina riceve un legame H dal gruppo amminico in posizione 2 della guanina.

In questo tipo di geometria di Watson e Crick, i due carboni 1’ del deossiribosio legati a ciascuna base sono esattamente alla stessa distanza, 10,85 angstrom. Questo vuol dire che se posso costruire una struttura che indipendentemente dal fatto di avere A, T, G, C. Quindi posso costruire una struttura che indipendentemente dal fatto di avere una base o l’altra ha la stessa geometria perché i ribosi hanno i C in posizione 1 sempre alla stessa distanza, nella stessa posizione.

Al ribosio, quindi non cambia nulla avere G, C, A o T. Questo è decisivo perché molto si basa su questo. La geometria del deossiribosio è costante, posso costruire quindi una struttura periodica, ripetuta. Nella struttura B del DNA si vedono solco maggiore e solco minore. Minore è più piccolo perché è dove spuntano i ribosi. La struttura del DNA è tale per cui le basi azotate, soprattutto sul solco maggiore, espongono i loro gruppi chimici caratterizzanti. Sul solco maggiore e minore vedo quindi cose diverse al cambiare della sequenza.

Il solco minore è minore perché c’è l’ingombro dei ribosi, quindi è più stretto. Non avrei distinzione tra minore e maggiore se i ribosi fossero sull’equatore. I C in posizione 1 sono sempre alla stessa distanza, ciò che cambia è la natura chimica dei gruppi esposti nei solchi.

Conformazioni DNA A, B e Z

DNA A, B e Z sono diverse conformazioni del DNA.

Il DNA B ha 10 coppie di basi per giro, ha una coppia di basi ogni 36 gradi. La separazione tra le basi è di 3,4 angstrom. Il tilt è praticamente zero, quindi vuol dire che le basi sono praticamente ortogonali all’asse dell’elica.

La doppia elica B è right-handed, ovvero si avvolge in senso orario, segue le lancette dell’orologio. La conformazione B è quella più frequente. Le altre conformazioni si formano quando cambiano la forza ionica (concentrazione di ioni) e l’umidità. La forma A è come se fosse la forma B schiacciata, ha un diametro maggiore, ci sono più basi per giro di elica, quasi 12. Il diametro diventa 26 angstrom contro i 20 angstrom di diametro della forma B. Come conseguenza nella A il solco maggiore è a malapena percepibile.

Lezione 11/10/2021

Differenza DNA A e DNA B: cambia la conformazione del deossiribosio. Anche se è un anello si può agire sugli angoli di torsione, la conformazione non è del tutto vincolata. Cambiare angolo di torsione significa ruotare attorno a un legame covalente.

Il ribosio può, quindi, esistere in più conformazioni. Le conformazioni più importanti per noi sono la C3’-endo (quella del DNA A) e la C2’-endo (quella del DNA B). Il ribosio, essendo anello, definisce un piano e C2’-endo vuol dire che il C 2’ esce dal piano sul piano dove si trova il C 5’. C3’-endo si distingue perché il C 3’ esce dal piano sul lato del piano dove si trova il C 5’.

Le due conformazioni impongono una diversa spaziatura tra i fosfati. Nel DNA il fosfato è legato all’O al 5’ del ribosio e andrà a legarsi all’O del 3’ del deossiribosio del nucleotide vicino. Il C2’-endo impone spaziatura tra i due fosfori di 7 angstrom, il C3’-endo di circa 6 angstrom. Infatti, il DNA B ha una spaziatura maggiore tra le basi rispetto al DNA A. Nel DNA B ci sono 10 basi per giro di elica con una spaziatura di 3,4 angstrom, nel DNA A la spaziatura tra le basi è di 2,9 angstrom, ci sono infatti 11,6 basi per giro di elica.

Quindi, il cambio di conformazione del ribosio fa sì che i nucleotidi siano diversamente separati, nel DNA A ho uno schiacciamento delle basi, questo comporta inoltre il fatto che le basi abbiano nel DNA A un tilt maggiore, di circa 20°, ovvero le basi sono inclinate di 20° rispetto al piano ortogonale all’asse dell’elica. Le basi del DNA B sono praticamente ortogonali all’asse dell’elica, il tilt vale 6°.

Per definizione il DNA ha struttura perfettamente periodica, questo è alla base di tanti processi biologico-molecolari come il riconoscimento di un danno sul DNA.

La struttura del DNA Z è stata scoperta più recentemente, all’inizio degli anni 80. Alcuni tratti di DNA sono nella conformazione Z e ci sono proteine che legano il DNA solo nella conformazione Z. Il DNA Z è sinistrorso (senso antiorario), ed è un DNA che tipicamente si ha quando si alternano una pirimidina e una purina (di solito quando si ha alternanza di A e T in sequenza). Si alternano anche le conformazioni del ribosio C2’-endo e C3’-endo. Cambia anche la conformazione delle basi.

Nel DNA A e B le basi hanno conformazione anti, perché la base è opposta rispetto al ribosio. Nel DNA Z si alterna conformazione anti della pirimidina con le conformazioni sin della purina. Posso avere due conformazioni perché posso ruotare l’anello agendo sul legame C1’ del ribosio e N9 della base azotata.

Il DNA Z non ha solco maggiore, gli spigoli delle basi sono completamente esposti.

Replicazione del DNA

Quando Watson e Crick scoprono struttura del DNA intuiscono il possibile meccanismo di replicazione (da frase articolo). Il DNA si replica secondo il modello semiconservativo, ogni filamento funge da stampo per un filamento di neosintesi che non è uguale ma complementare.

Il fatto che la replicazione sia semiconservativa è stato dimostrato da Meselson e Stahl. Essi usavano batteri che facevano crescere in presenza di azoto 15 (isotopo pesante dell’azoto). Man mano che i batteri si replicavano incorporavano l’isotopo pesante nel DNA, e quindi Meselson e Stahl potevano monitorare le replicazioni perché con la centrifugazione potevano separare DNA con isotopo 15 da DNA con isotopo 14 (pesi diversi).

Isolavano il DNA e alla generazione 0 trovavano in ultracentrifugazione un'unica banda perché la replicazione semiconservativa faceva sì che i due filamenti di DNA guidassero la produzione di filamenti di neosintesi arricchiti con N15. Quindi generazione 0 aveva un filamento con isotopo leggero e uno con isotopo pesante.

Terminato il primo giro di divisione i due mettevano a disposizione delle cellule azoto 14, non più pesante. Le cellule continuavano a replicarsi e osservavano che il DNA cominciava a separarsi in due forme: una contenente solo N14 e uno contenente sia il 15 che il 14. Questo dimostrava che la duplicazione era semiconservativa.

Organizzazione del DNA in eucarioti e procarioti

Il modo in cui viene organizzato il DNA in eucarioti e procarioti è totalmente diverso. Negli eucarioti c’è la cromatina, ovvero il DNA è organizzato attraverso una impalcatura proteica che definisce la cromatina. Questa impalcatura nei procarioti è assente, il DNA è sì associato a proteine ma non come negli eucarioti. Gli eucarioti sono inoltre per la maggior parte a cromosomi multipli.

Negli eucarioti si hanno più cromosomi che sono visibili come unità distinte solo durante la mitosi, altrimenti essi non sono affatto unità distinte, ma si ha cromatina. Il nucleo delle cellule eucariotiche è in continuo rimodellamento durante il ciclo cellulare.

Come il DNA si organizza negli eucarioti?

La doppia elica è il primo livello di organizzazione del DNA, quando si parla di replicazione degli eucarioti non si parla solo di replicazione DNA ma anche della cromatina.

Specie sempre più complesse hanno accumulato nel corso dell’evoluzione una quantità enorme di DNA apparentemente non codificante e senza funzione. Lievito ha quasi tutti geni e ha poco DNA non codificante, gli umani di più. Il mais anche ha una quantità enorme di DNA non codificante che però viene comunque replicato. La sua funzione non è stata ancora del tutto chiarita. La concentrazione dei geni è molto variabile, quando ci si muove verso organismi pluricellulari con maggior grado di differenziamento pure all’aumentare alla quantità di DNA (umani hanno molto più DNA di lievito ad esempio) la concentrazione di geni diminuisce.

Esempio uomo e lievito hanno circa lo stesso numero di geni ma uomo ha molto più DNA. Quello che aumenta è il DNA non codificante. Anche all’interno di un gene molte sequenze sono non codificanti, sono introni.

Di solito si dice che il gene è l’unità funzionale del DNA, ma molte regioni non codificanti codificano, non per una proteina ma vengono trascritti dando vita a non coding RNAs, ovvero RNA con funzioni biologiche. Il 50% del nostro DNA è costituito da DNA non codificante il cui ruolo è ancora sconosciuto.

Nucleosomi e impaccamento del DNA

Come si impacca il DNA nel nucleo degli eucarioti? Il primo livello di impaccamento del DNA nelle cellule eucariotiche coinvolge i nucleosomi. Essi sono stati scoperti con esperimenti di digestione, si estrae la cromatina e si tratta con delle nucleasi e così si vedeva che il pattern di digestione seguiva un andamento preciso, questa digestione blanda dava vita a frammenti di DNA di circa 160 coppie di basi che sono protette dalla digestione, altri tratti invece vengono facilmente digeriti dalle nucleasi.

Questo ha portato alla scoperta dei nucleosomi, il primo livello di organizzazione del DNA. Il DNA di tutti gli eucarioti (tranne negli spermatozoi) è avvolto in nucleosomi.

Ciascun nucleosoma è un cilindro costituito da otto proteine istoniche (core istonico). Gli 8 istoni sono a coppie, H2A, H2B, H3 e H4. Gli 8 istoni si organizzano in dimeri, un dimero H3-H4, uno di H2A e uno di H2B.

Attorno al core si superavvolge il DNA, definendo un giro e tre quarti di superelica. La superelica è sinistrorsa, il superavvolgimento va contro le lancette dell’orologio. L’entry point e l’exit point del DNA sul nucleosoma sono sullo stesso spigolo del disco.

Il DNA è avvolto a segmenti rigidi sul core istonico, è come se formasse un “poligono” avvolgendosi. Dove ci sono i kink (pieghe tipo metro da muratore) spesso ci sono A e T perché ci sono solo due legami a H tra le due basi e di conseguenza in quelle zone il DNA è più deformabile.

Gli istoni possono legarsi a qualsiasi sequenza di DNA, ci sono sequenze che si legano meglio ma gli istoni legano molto bene il DNA perché la loro superficie, soprattutto il lato del cilindro, è ricco di arginina, è popolato di cariche positive. Il DNA è quindi legato molto bene, se voglio dissociare il nucleosoma devo aumentare molto la forza ionica.

Le sequenze delle proteine istoniche sono quasi identiche in tutti gli eucarioti, sono tra le proteine più conservate in assoluto. Questo non stupisce perché essi organizzano tutto il DNA, nel corso dell’evoluzione non sono state tollerate mutazioni sugli istoni, essi sono quindi per questo proteine altamente conservate. Gli istoni sono evoluti da un istone ancestrale e poi nel corso dell’evoluzione si sono differenziati diversi istoni, noi ne abbiamo vari, anche alcuni fattori di trascrizione hanno struttura istonica.

Dal punto di vista strutturale hanno tutti la stessa struttura, histone fold. Quando si parla di fold si parla di una certa disposizione di strutture secondarie che contraddistingue una certa famiglia di proteine, ad esempio tutti gli istoni hanno una alfa elica centrale “decorata” da due alfa eliche più corte ai lati, questo è detto histone fold. Tutte le proteine istoniche tendono inoltre a dimerizzare formando il tipico dimero degli istoni perché le due alfa eliche più lunghe si dispongono a X.

Le proteine istoniche hanno altro elemento in aggiunta all’histone fold, hanno una parte N-terminale (code istoniche) che non ha una conformazione ben definita, si può considerare flessibile, e a seconda di chi la lega può assumere conformazione diversa.

Gli istoni costituiranno barriera per replicazione e trascrizione, rendono il DNA meno accessibile, ma sono anche un meccanismo di controllo intrinseco, questo perché un tratto di DNA potrà essere deprivato del core istonico o meno e la sua accessibilità cambierà. Quindi il posizionamento degli istoni è già un meccanismo di controllo. Infatti, la quantità di istoni delle cellule eucariotiche è finemente regolata. Alterazioni a livello degli istoni ha conseguenze catastrofiche.

Rimodellamento della cromatina

Esistono sistemi di rimodellamento della cromatina, perché gli istoni e i nucleosomi non stanno sempre dove sono, ma vengono continuamente tolti e spostati. A fare questo lavoro sono i complessi di rimodellamento della cromatina (quasi sempre ATP dipendenti), i quali possono addirittura far scivolare l’ottamero istonico lungo il DNA.

Il rimodellamento della cromatina viene fatto anche continuamente assemblando e disassemblando i nucleosomi. Ci sono sistemi disassemblano i nucleosomi e altri che li riassembleranno. Questo complesso molte volte coinvolge le chaperonine, le chaperons sono dei sistemi che favoriscono l’avvolgimento delle proteine o proteggono delle proteine da interazioni che non devono accadere.

Gli istoni per loro caratteristica strutturale hanno una fortissima propensione ad associarsi, a formare dimeri e poi eterotetrameri, quando disassemblo il nucleosoma devo garantire che gli istoni non si riassocino subito magari anche in forma non controllata. Quindi l’istone libero o più frequentemente i dimeri, tetrameri o ottameri istonici sono “curati” dalle chaperonine istoniche che impediscono queste associazioni.

I complessi di rimodellamento possono, quindi, far scorrere i cori sul DNA, possono far sì che vengano scambiati gli istoni, si possono denudare tratti di DNA dagli istoni ecc., il concetto chiave è che i nucleosomi non sono fissi, le sequenze di DNA vengono continuamente rimodellati.

Il fatto che i nucleosomi vengano continuamente rimodellati va a pari con il ruolo che i nucleosomi hanno nel compa