Biochimica - prima parte

Biochimica

Studio della chimica della vita, come le molecole prive di vita interagiscono tra loro per mantenere la vita della cellula e perpetua la vita (trasmettere le informazioni necessarie per tutte le attività necessarie alle cellule figlie) usando solo leggi chimiche e fisiche.

Le cellule sono le unità fondamentali della vita, utilizzano metaboliti contenenti carbonio per creare grandi macchine molecolari polimeriche (biomolecole, ad es: le proteine si costruiscono con gli amminoacidi, gli acidi nucleici sono costruiti con i nucleotidi).

Le cellule possono autoriprodursi e trasmettere alle due cellule figlie informazioni chimiche nel genoma. Il DNA è caratterizzato da proprietà autoriproduttive.

Sulle membrane del REL vengono sintetizzate le proteine che vengono secrete/escono dalla cellula.

Tra i batteri e gli eucarioti abbiamo gli archei, sono degli organismi che sono in grado di vivere in condizioni estreme.

Il nucleo (sede che contiene il DNA) è circondato dall’involucro nucleare costituito da due membrane concentriche: membrana nucleare interna e membrana nucleare esterna interrotta dai pori nucleari che permettono il passaggio delle proteine. Le molecole di DNA sono sotto forma di polimeri lunghissimi contenuti nel nucleo.

Eterocromatina sarebbe la cromatina più densa che caratterizza delle zone più scure.

La cromatina è materiale genetico e proteine istoniche che vengono sintetizzate sui ribosomi liberi del citosol e arrivano al nucleo attraversando in entrata i pori nucleari, in uscita invece l’RNA messaggero che esce dal nucleo e va a formare i ribosomi. La cromatina diventa visibile formando i ribosomi, infatti si vedono i ribosomi condensati, perché la cellula si sta avvicinando alla divisione mitotica.

I mitocondri sono capaci di sintetizzare delle proteine, con le creste mitocondriali che aumentano la superficie della membrana, c’è del DNA. Poche proteine vengono sintetizzate nel mitocondrio. Le proteine mitocondriali.

Reticolo endoplasmatico e organelli

Reticolo endoplasmatico costituito da strutture tubolari, il rugoso possiede i ribosomi adesi al reticolo endoplasmatico che sintetizzano proteine. Il REL non ha ribosomi, la sua funzione è la sintesi dei lipidi, fosfolipidi, colesterolo, steroli, ormoni steroidei. Oltre a questa funzione deve immagazzinare il calcio tramite le pompe del calcio. Funzione di detox da farmaci.

Il collagene nella matrice extracellulare lo sintetizzano sul RER perché è una proteina che deve essere secreta.

Apparato di Golgi: riceve vescicole dal RER (proteine) o REL (lipidi), quindi al Golgi arrivano sia lipidi che proteine e qui vengono modificati in glicoproteine e glicolipidi.

Lisosomi importanti per la digestione intracellulare, perossisomi servono per eliminare il perossido di idrogeno.

Configurazione delle molecole

La configurazione di una molecola dipende da:

• Presenza dei doppi legami attorno ai quali non vi è libertà di rotazione.
• Centri chirali intorno a cui i gruppi sostituenti sono disposti in una sequenza specifica.

Enantiomero.

Nella cellula generalmente è presente solo una delle diverse formule chirali possibili per ciascuna molecola (es. per amminoacidi solo isomeri L, il glucosio è presente solo nella forma D) questo perché si legano in maniera specifica.

Le proteine

Sono le macromolecole biologiche più abbondanti, sono presenti in tutte le cellule, l’informazione genetica si esprime mediante le proteine, le cellule costituiscono tantissime proteine. Le proteine sono delle macromolecole indispensabili per la vita e sono le molecole organiche più abbondanti nel nostro organismo. Sono molto versatili perché possono agire da:

• Catalizzatori perché la maggior parte degli enzimi è costituita da proteine.
• Trasportatori di molecole (come emoglobina) e protettori di molecole come la mioglobina.
• Forniscono supporto meccanico o funzionale come il citoscheletro.
• Svolgono un ruolo fondamentale nella difesa. In particolare, le proteine del complemento sono una serie di proteine collegate tra di loro che si attivano a cascata e l’ultima che si attiva determina la lisi del patogeno.
• Hanno attività di movimento es. flagello del batterio e dello spermatozoo.
• Funzione di comunicazione (es. insulina).

Sono costituiti dai monomeri (amminoacidi) legati tra di loro, la cellula utilizza 20 amminoacidi per formare tutte le proteine. Un amminoacido è costituito da un carbonio centrale detto alfa legato a 4 gruppi diversi: gruppo amminico, carbossilico, idrogeno e gruppo R. In tutti gli amminoacidi le prime tre parti sono sempre uguali, cambia solo il gruppo R (il gruppo R differenzia un amminoacido da un altro, influenza anche la solubilità e la conformazione della proteina), quindi il C alfa sarà un centro chirale, quindi è possibile individuare uno stereoisomero, tranne la glicina (che ha 2 H) tutti gli altri hanno tutti i sostituenti diversi.

Stereoisomeri hanno diversa stereochimica. Una molecola può avere 2ⁿ stereoisomeri dove n è il numero dei carboni chirali. R nell’alanina è rappresentato dal gruppo metilico.

La configurazione assoluta degli zuccheri ed amminoacidi D ed L si basa sulla configurazione della gliceraldeide (Fischer). Quindi quando il gruppo amminico è a sinistra la configurazione è L, quando è a destra è D.

Solo gli L-aa entrano a far parte delle proteine dei mammiferi, generalmente sono più solubili in acqua, più stabili e più termodinamicamente favoriti.

I gruppi R possono essere: carichi (solubilità), polari non carichi, apolari (non interagiscono con l’acqua), aromatici. Tutti questi fattori influenzano la configurazione dell’aa.

Cisteina, glicina e istidina non hanno caratteristiche nette.

Gruppi R apolari

• Idrofobi (importante per la configurazione della prot).
• Stabilizzano la struttura proteica con interazioni idrofobiche.
• La glicina è l’unico aa a non avere il carbonio asimmetrico ed è molto piccolo, quindi non interagisce tanto.
• L’alanina la ricordiamo perché ha CH3 come R.
• La prolina ha una struttura molto rigida perché forma una struttura ciclica con la catena R, ciò riduce la flessibilità strutturale delle regioni polipeptidiche in cui è presente.
• Metionina insieme alla cisteina sono gli unici aa ad avere lo zolfo.

Sono amminoacidi prevalentemente situati nella parte interna della proteina in quanto essa è situata all’interno del citosol, in questo modo non stanno a contatto con l’acqua.

Gruppi R aromatici

• Relativamente non polari.
• Possono contribuire a interazioni idrofobiche.
• Il gruppo OH della tirosina può formare legami H, gruppo funzionale in alcuni enzimi (fosforilazione).
• Polarità della tirosina e del triptofano > della fenilalanina.

In corrispondenza della tirosina avviene la fosforilazione.

Assorbono luce ultravioletta a 280 nanometri e questo permette di quantizzare il campione, ovvero capire quanta proteina c’è.

Gruppi R polari non carichi

Gruppi R polari, non carichi (solubili in acqua).

Gruppi solubili in acqua perché hanno gruppi che formano legame H con l’acqua (tranne la cisteina ma in laboratorio si scioglie lo stesso).

Asparagina e glutammina sono le ammidi di altri due aa che sono: l’aspartato e il glutammato.

La cisteina è ossidabile, forma un legame covalente, il ponte disolfuro (legami covalenti forti, gli altri sono molto deboli) che lega due residui di cisteina formando la cistina. La cisteina è molto importante (SH).

Gruppi R carichi

Gruppi R carichi (+ -> basici) (- -> acidi).

L’istidina è l’unico aa ad avere una catena laterale ionizzabile, responsabile dell’effetto tampone delle proteine. A pH 7.0 può essere carica positiva o priva di carica. Si trova spesso nel sito attivo degli enzimi. 7 amminoacidi su 20 sono ionizzabili, quindi partecipano a reazioni acido-base, sono altamente reattivi e partecipano a una grande varietà di reazioni biologiche. La pKa del gruppo carbossilico è intorno a 2. (valore per il quale forma acida e basica sono in ugual quantità).

Nelle curve di titolazioni, abbiamo due zone di potere tamponante: una all’inizio e una alla fine. Inoltre, possiamo osservare il punto isoelettrico dove la carica netta è zero, l’amminoacido è in forma dipolare. Per la glicina è il valore aritmetico della media dei due valori di pKa.

Amminoacidi e folding proteico

Amminoacidi apolari e polari nel folding proteico. Un fattore importante per il ripiegamento della proteina è la distribuzione degli amminoacidi polari e non polari, tutte le catene laterali non polari sono concentrate in una tasca dentro, formando un nucleo idrofobico lontano dall’acqua, invece verso l’ambiente acquoso, verso l’esterno sono rivolte tutte le catene polari con i legami ad H con l’acqua e con altre molecole polari, in questo modo la proteina ha assunto una conformazione.

Per la sintesi di nuove proteine le cellule utilizzano amminoacidi attingendo da un pool di amminoacidi liberi che provengono da:

• Sintesi (di aa non essenziali) (la cellula è in grado di sintetizzarli da sola).
• Processi di assorbimento (dieta).
• Dalla demolizione di proteine (riciclaggio) (lisosomi e proteasomi).

Gli amminoacidi essenziali sono quelli che non possono essere sintetizzati dalla cellula quindi devono essere introdotti con dieta. Altri aa hanno bisogno di condizioni particolari e possono scarseggiare; quando si è in crescita, sotto stress, in seguito ad un trauma. Quindi bisogna reintegrarli con la dieta.

Amminoacidi non comuni

• 4-idrossiprolina (derivato dalla prolina) (collagene).
• Gamma-carbossi glutammato: nella protombina (proteina che interviene nella coagulazione del sangue) e in proteine che legano il calcio per svolgere la loro funzione.
• Desmosina (4 residui di resina di lisina) elastina (proteina fibrosa nella parete dei vasi sanguigni).

Questi 3 amminoacidi si formano per modifica chimica di aa già incorporati in una proteina.

• Selenocisteina: contiene selenio al posto dello zolfo nella cisteina, deriva della serina.
• Pirrolisina: in un unico batterio che produce metano.

Questi 2 aa vengono introdotti durante la sintesi della proteina.

• Ornitina e citrullina.
• Aa transitoriamente modificati per cambiare la funzione della proteina (fosforilazione).

Gli aa a pH neutro sono ioni dipolari o zwitterioni (dipolari). Quindi il gruppo carbossilico è deprotonato invece il gruppo amminico è protonato; quindi, abbiamo delle cariche, ciò permette una buona solubilità. Questi zwitterioni sono anfoteri quindi si comportano sia da base che da acidi.

A pH 7 = pH fisiologico il gruppo COOH perde il protone per primo e predomina la forma zwitterionica. In soluzione acida i gruppi amminici sono protonati e i COOH sono indissociati, in soluzione basica i gruppi amminici perdono il protone.

L’HIS è l’unico aa delle proteine ad avere una catena laterale ionizzabile con una pKa vicino alla neutralità. A pH 7 l’HIS può essere carica positivamente o priva di carica. In molte reazioni catalizzate da un enzima i residui di HIS facilitano la reazione comportandosi da donatore o accettore di protoni.

La struttura delle proteine

Le proteine hanno uno scheletro formato da residui amminoacidici (building blocks) legati covalentemente da centinaia di legami. La struttura delle proteine è caratterizzata da 4 tipologie di strutture:

• La struttura primaria dipende dalla sequenza degli amminoacidi, uniti tra loro da legami peptidici.
• La secondaria è determinata dalla tridimensionalità della molecola. (Alfa elica).
• Terziaria; il modo in cui è ripiegata in maniera tridimensionale per formare una struttura compatta.
• Quaternaria, le varie catene polipeptidiche si uniscono per formare una struttura complessa. (Emoglobina; proteine multimeriche ossia costituite da più filamenti polipeptidici che si combinano tra di loro).

La disposizione spaziale di una porzione di proteina è detta conformazione e corrisponde alle possibili strutture che la proteina può assumere senza la rottura di legami covalenti (es. variazioni conformazionali per rotazione attorno a legami singoli). Una proteina può assumere più conformazioni stabili (termodinamicamente) per legare altre molecole o, nel caso degli enzimi, per legarsi ad un substrato al fine di catalizzare la reazione. Nei loro stati conformazionali funzionali le proteine si dicono “native” (ovvero la conformazione nella quale la proteina può esplicare la sua funzione). È molto importante anche la sequenza degli amminoacidi che influenza la sua conformazione e quindi la sua attività biologica. Se una proteina perde la sua conformazione perde quindi la sua attività biologica. La stabilità della struttura della proteina è la tendenza a mantenere una conformazione nativa.

Es. Se il gruppo OH è legato al fosfato il fosfato cambia la sua conformazione, l’enzima passa dalla sua conformazione inattiva allo stato attivo; quindi, l’enzima può avere due conformazioni entrambe importanti, perché l’enzima deve essere sia attivo che inattivo all’interno della cellula. (Ovviamente solo una funzionerà da catalizzatore ma l’altra serve lo stesso).

Interazioni che stabilizzano la conformazione nativa

Le interazioni chimiche che stabilizzano la conformazione nativa sono:

• Ponti di solfuro (lega due cisteine) sono interazioni covalenti molto forti, anche se alcune proteine non riescono ad instaurarle, perché l’ambiente intracellulare è altamente riducente contenendo grandi quantità di glutatione (riducente), quindi la maggior parte dei gruppi sulfidrilici rimane nello stato ridotto e non crea ponti di solfuro. All’esterno della cellula (nel RER) l’ambiente è più ossidante, quindi sono presenti più ponti di solfuro.; Es: l’insulina nel sangue (ambiente extracellulare) è unita da ponti intercatena di solfuro. I ponti di solfuro sono poco comuni anche nelle proteine batteriche, ma molto diffusi nei batteri termofili e negli archei in generale per permettere alle proteine di resistere ad alte temperature.
• Legami a idrogeno.
• Interazioni idrofobiche.
• Interazioni ioniche.
• I legami covalenti sono più forti delle singole interazioni deboli. Ma queste sono molto più numerose quindi più importanti nello stabilizzare la struttura delle proteine.

Essendo tanto numerosi questo fa sì che l’interazione diventi forte.

Le strutture secondarie e terziarie (e quaternarie) invece sono date dalle interazioni deboli che sono molto numerose e la loro somma porta ad ottenere una interazione in generale forte che stabilizza le proteine. La formazione proteica con minor energia libera quindi più stabile è quella con maggior interazioni deboli. Per ogni legame idrogeno che si forma all’interno di una proteina durante il suo avvolgimento, un altro legame idrogeno (o un legame energeticamente equivalente) deve essere rotto tra lo stesso gruppo e l'acqua. Perciò il contributo che ciascun legame idrogeno dà alla stabilità globale, cioè la differenza in energia libera tra gli stati avvolto e non avvolto, è vicino allo zero.

Interazioni idrofobiche

Perché la formazione nativa è quella favorita?

Le interazioni idrofobiche sono determinanti per la stabilità delle proteine. Una qualunque molecola in acqua viene solvatata secondo una disposizione ordinata -> strato di solvatazione. Questo aumento di ordine dovuto allo stato di solvatazione crea una diminuzione dell’entropia che è quindi sfavorevole come condizione, però qualora noi aggiungessimo delle molecole idrofobiche tutti i gruppi non polari (apolari) si riunirebbero e lo strato di solvatazione si ridurrebbe (in quanto ciascun gruppo non presenta più l’intera superficie rivolta verso l’acqua), provocando quindi un aumento favorevole di entropia. Analogamente, le catene idrofobiche degli amminoacidi tendono a disporsi all’interno delle proteine, lontano dall’acqua.

I gruppi polari possono formare legami a idrogeno con l’acqua e per questo sono idrosolubili. Il numero di legami a idrogeno per unità di massa è generalmente più elevato nell’acqua pura, rispetto a qualsiasi altro liquido o soluzione; quindi, vi sono limiti alla solubilità anche delle molecole più polari.

In generale nelle proteine troviamo un elevato contenuto di catene laterali di amminoacidi idrofobici (Leu, Ile, Val, Phe e Trp) che, quando la proteina ha completato il suo ripiegamento, si raggruppano all'interno della struttura della proteina formando il nucleo idrofobico della proteina.

Legame peptidico e glutatione

Come leghiamo due amminoacidi tra di loro?

Attraverso il legame peptidico che avviene nel ribosoma, il legame che si forma interessa il gruppo carbossilico e il gruppo amminico, si ha la perdita di una molecola di acqua (reazione di condensazione).

In ogni struttura avremo due estremità: l’estremità amminoterminale, e il gruppo carbossilico libero chiamato estremità carbossiterminale.

Il glutatione (tripeptide: quindi formato da tre aa: glutammato, cisteina e glicina) viene sintetizzato a partire dal glutammato e cisteina uniti da un legame peptidico atipico (perché non viene utilizzato il carbonio carbossilico alfa ma quello gamma) per formare il gammaglutammilcisteina, che si lega con una glicina formando così il glutatione.

Il glutatione è importante perché è un antiossidante non enzimatico presente nella cellula e questo grazie al gruppo tiolico che si può ossidare; quindi, può creare un ponte di solfuro che si forma tra i due residui di cisteina tra i due peptidi. (Importante per i processi di detox all’interno della cellula). Lo troviamo principalmente in forma ridotta.

Le proteine possono definirsi: (in base alla loro lunghezza che può essere molto variabile)

• Oligopeptide: s