Biochimica applicata

Biochimica applicata

L’indagine biochimica e biomolecolare ha lo scopo di indagare la natura e le interazioni che si stabiliscono tra le molecole biologiche in modo da comprendere i fenomeni biologici a livello molecolare.

I risultati delle indagini biochimiche e biomolecolari trovano applicazione in vari campi, dalla diagnostica alla terapia di patologie, a vari settori dell’industria. Essi permettono per esempio di:

• Determinare struttura e funzione di proteine coinvolte in processi fisiologici e patologici
• Identificare nuovi marcatori molecolari da impiegare nella diagnostica molecolare
• Disegnare farmaci sempre più efficaci e specifici per il bersaglio molecolare di interesse
• Comprendere la causa di malattie genetiche e metaboliche

Estrazione e purificazione delle proteine

Purificare una proteina vuol dire estrarla dalla matrice biologica in cui si trova e ottenere una preparazione in cui è presente solo una specie proteica che deve essere stabile e omogenea.

Perché purificare una proteina?

• Per studiare la proteina e comprenderne le funzione biologica
• Per studiare le sue interazioni con ligandi
• Per studiare proteine patologiche
• Per applicazioni biocatalitiche degli enzimi
• Per produrre proteine con attività terapeutica, insulina
• Per progettare un farmaco efficace

Definire la fonte

La prima cosa da fare quando si vuole purificare una proteina è definire da dove viene estratta la proteina, che nella maggiormente le proteine si trovano all’interno della cellula, e quindi la fonte sono i tessuti o coltura di cellule.

La fonte va scelta in modo che la fonte sia disponibile e che sia una fonte in cui la proteina di interesse è presente in una certa quantità.

Se la fonte naturale è difficile da reperire o è in concentrazioni basse, si può produrre delle proteine ricombinate sotto forma di proteine.

Si utilizzano delle tecniche di biologia molecolare in modo tale da inserire il gene della proteina di interesse in una cellula ospite. Questa cellula ospite deve essere in grado di sovrascrivere la proteina di interesse, si usano molto spesso colture batteriche.

Si deve anche capire la quantità di proteina che si vuole ottenere.

È importante anche il grado di purezza.

Ad esempio se si vuole capire la struttura tridimensionale della proteina bisogna avere un elevato grado di purezza.

Invece se bisogna purificare un enzima per valutare la sua attività catalitica ci si può anche avere una purezza anche inferiore.

Quindi il grado di purezza varia in base a ciò che bisogna fare.

Nella maggior parte dei casi si purifica la proteina nella sua struttura nativa.

Tappe per estrarre e purificare una proteina

Questo processo di estrazione e purificazione della proteina non è facile e veloce.

Infatti c’è bisogno di più passaggi:

1. La prima tappa è estrarre le proteine dalla loro matrice biologica
2. Poi si identifica un sotto insieme in cui è contenuta la proteina di interesse
3. Poi si continua a tappe

Più tappe si fa e più la proteina sarà più purificata.

Per ogni proteina deve essere messo a punto uno schema di purificazione preciso.

Non c’è uno schema generale, perché nelle cellule ci sono tantissime proteine eterogenee.

Sono diverse per dimensione, composizione amminoacidica e sequenza, la localizzazione cellulare, citoplasmatiche e di membrana.

• Lisi cellulare
• Separazione solido/liquido, eliminazione di cellule, detriti e particolati: centrifugazione
• Purificazione preliminare, isolare e concentrare: precipitazione con sali, ultrafiltrazione
• Purificazione ad elevata efficienza:
• Cromatografia a bassa risoluzione
• Cromatografia ad alta risoluzione
• Concentrazione

Procedure preliminari per la purificazione delle proteine

La prima cosa da fare è quello di preparare una soluzione di estrazione, cioè una soluzione dove le proteine sono trasferite dalla matrice biologica alla soluzione di estrazione.

Questa soluzione deve essere preparata accuratamente perché deve accogliere le proteine che passano in un ambiente che non è più fisiologico.

Infatti il comportamento cellulare viene tutto rotto.

Dopo l’estrazione dall’ambiente cellulare, le proteine diventano instabili e possono andare incontro a:

• Denaturazione = perdita di struttura e attività
• Proteolisi = perché gli enzimi proteolitici vengono liberati dai lisosomi e sono liberi di agire
• Ossidazione

Per mantenere la funzione e struttura delle proteine bisogna lavorare a temperatura controllata, di circa 4°C, così da diminuire il rischio la denaturazione e l’attività degli enzimi proteolitici.

Bisogna anche mantenere il pH fisiologico, perché a pH acido le proteine potrebbero denaturarsi.

Per mantenere il pH si sfruttano i sistemi tampone.

Però il potere tampone è funzionante solo in un certo range di pH.

Inoltre il potere tamponante è maggiore quanto più il valore di pH è vicino a quello di pKa.

Le proteine sono funzionanti a pH neutro.

I sistemi tamponi utilizzati sono il tampone fosfato, tampone acido carbonico e bicarbonato, tampone di proteine e proteinatie.

Quando si lavora in laboratorio si devono utilizzare dei sistemi tampone che hanno un potere tamponante attorno a 7 pH.

Si utilizza il tampone TRIS quando non si può utilizzare il tampone fosfato.

Bisogna anche tenere conto della forza ionica della soluzione ionica in cui si lavora.

Quindi si utilizzano delle soluzioni tampone saline, con una forma ionica che va dagli 0,05 ai 0,01 molare.

La forza ionica viene mantenuta con l’aggiunta di NaCl.

Tutto ciò viene fatta per mantenere le proteine in soluzione.

Può essere aggiunto anche il saccarosio è utile per mantenere una osmolarità fisiologica, che serve per mantenere integri gli organelli cellulari, e mantiene solubile le proteine che sono abbastanza idrofobiche e quindi in ambiente acquoso sono difficile da mantenere in soluzione.

Ci devono essere anche inibitori di proteasi.

In ogni soluzione si aggiunge un cocktail di inibitori, perché ogni inibitore di proteasi riesce a inibire una specifica classe, quindi ce ne servono di vari tipi nella soluzione.

EDTA e EGTA = sono inibitori che sono degli agenti chelanti, quindi sequestrano gli ioni bivalenti che possono andare a legarsi ai tioli liberi delle proteine e provocare una alterazione.

Si utilizzano agenti riducenti.

Perché le proteine possono andare incontro a ossidazione quando si spostano del ambiente cellulare alla soluzione di estrazione.

Perché si possono formare dei ponti di solfuro tra le cisteine libere, e questa formazione può essere negativa nello scopo di purificare una proteina.

Quindi si aggiungono dei riducenti tiolici, SH libero, per evitare la formazione di ponti di solfuro indesiderati.

Si utilizzano i detergenti.

I detergenti sono molecole che hanno una testa polare e una coda idrofobica, sono molecole anfipatiche, cioè hanno una parte idrofila e una idrofoba.

Hanno la funzione di evitare l’aggregazione delle proteine, perché può succede che le proteine espongono delle zone apolari. Queste zone apolari poi possono interagire tra di loro e questo porta a formare degli aggregati, che tengono a non stare più in soluzione.

Per l’estrazione di proteine si utilizzano i detergenti non ionici e zwitterionici. I detergenti ionici possono portare alla denaturazione delle proteine, quindi è meglio non usarli.

Lisi cellulare

Visto che le proteine da purificare si trovano all’interno della cellula, bisogna andare a rompere le membrane cellulari così che il contenuto cellulare sia riversato nella soluzione di estrazione.

Prima bisogna capire da che cellula bisogna estrarre la proteina, perché ci sono cellule che oltre la membrana cellulare si ha anche la parete, come le cellule vegetali.

Quindi il metodo di lisi cambia in base al tipo di cellula.

Ci sono due metodi di lisi: meccaniche e non meccanica.

Lisi meccaniche

Si utilizzano forze di taglio.

Si utilizzano omogeneizzatori a mescolamento che riescono a rompere le cellule, funzionano come dei frullatori.

Si utilizzano anche omogenizzatori che utilizzano le forze di attrito, funzionano tramite dei pestelli che è poco più piccolo del tubo.

Questi due omogenizzatori sono utili per le cellule dei tessuti.

Invece per i microrganismi si utilizzano delle forte pressione che fanno scoppiare la cellula.

Si utilizza ultrasonicazione che utilizza gli ultrasuoni, e che va bene per qualsiasi cellula.

C’è una sonda che produce degli ultrasuoni, e questa sonda viene inserita nella soluzione, e quando gli ultrasuoni si propagano nella soluzione questo provoca delle bolle di vuoto che tendono a implodere, e questo crea degli sbalzi di pressione che fanno scoppia la cellula.

Lo svantaggio di tutti questi metodi è che si sviluppa calore.

Lisi non meccaniche

Sono metodi più blandi.

Si utilizza lo shock osmotico che è efficace solo con le cellule animali, quindi quelle prove di pareti.

Le cellule sono messe prima in una soluzione ipertonica e poi si mettono in soluzione ipotonico dove tendono ad internalizare l’acqua. Questo fa aumentare il volume della cellula così tanto che fa scoppiare la cellula.

Un altro metodo è quello di fare cicli di congelamento e scongelamento abbastanza rapidi così da formare degli strati di ghiaccio nella membrana che portano ad alterarla.

Si utilizza l’azione di enzimi litici che sono in grado di degradare le membrane cellulari.

Uno degli enzimi più utilizzati è il lisozima, perché riesce a idrolizzare la parete cellulare batterica, che è costituita da peptoglicano, quindi è utilizzato molto nei batteri.

Quello che si ottiene dalla lisi è l’estratto grezzo o omogenato.

Separazione solido/liquido

Dalla lisi si ottiene l’estratto grezzo o omogenato tutto.

Questo estratto grezzo è un brodo eterogeneo che contiene il contenuto cellulare e porzioni del tessuto delle cellule che non sono stati completamente solubilizzate.

Quindi il primo passaggio è separate ciò che è solubile e insolubile.

Poi bisogna capire quale proteina bisogna analizzare perché poi cambia il processo da eseguire.

Tecniche di centrifugazione

Ora bisogna fare delle tecnica di centrifugazione per separare la frazione solubile dalla frazione insolubile.

Molto spesso le proteine che si trovano nella frazione insolubili sono quelle da scartare, ma in alcuni casi, con proteine ricombinanti, si possono formare degli aggregati di proteina molto grandi che difficilmente stanno in soluzione, e sono chiamate corpi di inclusione, però contengono la proteina di interesse, ma può essere una cosa positiva.

Le tecniche di centrifugazione sono tecniche separative che permettono di separare particelle in un liquido in base a differenze di dimensione e di densità.

Si separano facendo ruotare il campione a velocità molto elevate così da essere sottoposti a una forza centrifuga.

La centrifugazione sfrutta il fenomeno della sedimentazione che avviene grazie solo alla spinta della gravità, ma la centrifugazione accelera questo fenomeno di sedimentazione perché si avrà una forza maggiore alla forza di gravità, quindi velocizza il processo di sedimentazione.

Dopo questo processi si forma sul fondo il precipitato.

Invece la porzione che rimane solubile si chiama sopranatante.

Per separare queste due parti si può usare una pipetta per aspirare il sopranatante.

Com’è fatta la centrifuga

C’è un motore che fa ruotare il rotore.

Il rotore ha degli alloggiamenti che servono per contenere il campione biologico.

Il rotore ruota ad una velocità impostata imprimendo ai campioni una accelerazione centrifuga che viene mantenuta per un tempo variabile.

Quali sono le forze che entrano in gioco durante una certificazione e qual è la velocità:

Si ha la forza centrifuga che fa sì che le particelle si muovono verso il fondo del contenitore.

Però ci sono due forze opposte alla forza centrifuga:

• Forza idrostatica = perché il contenuto per andare in fondo deve spostare le particelle del liquido
• Forza frizionale = è opposta al movimento della particella verso il fondo

Il campo centrifuga G è dato:

La velocità di rotazione non è espressa come velocità angolare, ma si utilizza RPM = rivoluzioni per minuto.

In genere il campo centrifugo viene espresso come campo centrifugo relativo RCF, che sta a indicare quando il campo centrifugo utilizzato è più grande del campo gravitazionale.

Questa formula serve per convertire il RCF a RPM.

Quindi la forza centrifuga dipende dalla sua massa e dalla velocità con cui il rotore gira.

Calcolo della forza idrostatica

Per calcolare la forza idrostatica si semplifica la particella a una sfera, e quindi il suo volume è dato dal volume di una sfera.

Al peso della proteina bisogna sottrarre il peso del acqua, mezzo, che sposta.

Calcolo della forza di attrito

La forza di attrito è data dalla legge di Stokes.

All’inizio il rotore inizia a girare e questo fa aumentare la velocità, ma aumentando la velocità si aumenta anche la forza di attrito, finché non si arriva al equilibrio.

All’equilibrio la forza centrifuga è bilanciata dalle forze opposte.

Quindi si può dire, a un certo punto, che la forza centrifuga effettiva è data dalla forza di attrito.

All’equilibrio la particella avrò una velocità costante.

Da questa equazione si può dedurre che la velocità di sedimentazione di una particella.

Questa velocità è proporzionale alla sua dimensione, alla differenza tra la densità della particella e del mezzo, ed al campo centrifugo applicato.

Quindi più la particella è grande ed è densa e più sarà veloce la velocità di sedimentazione.

Ma più il coefficiente di viscosità è grande e minore sarà la velocità di sedimentazione.

In questa equazione non si considera la forma della particella.

Perché se una cellula è più allungata è sottoposta a maggior attrito e quindi è più lenta rispetto una particella di stessa massa ma più stretta.

Si utilizza il coefficiente di sedimentazione che è espresso in secondi.

È indipendente dalla centrifuga e dalle condizioni sperimentali.

Non si usa la velocità di sedimentazione ma questo coefficiente.

I coefficienti di sedimentazione della maggior parte delle strutture biologiche sono molto piccoli e, per comodità, viene presa come unità di misura il valore di 10^-13 secondi, che viene definito come “unità di Svedberg” (S).

Il coefficiente di sedimentazione indica quanto rapidamente sedimenta una particella sottoposta a forza centrifuga. Poiché particelle o molecole di dimensioni diverse hanno valori di coefficiente di sedimentazione diversi, la centrifugazione ne permette la separazione.

Tipologie di centrifughe

Il rotore è agganciato a un motore che imprime il moto rotatorio, e si trova all’interno di una camera d’acciaio.

Ci sono sistemi che prevedono un sistema di refrigerazione, così che l’attrito che si sviluppa quando il rotore gira viene raffreddato.

Se il rotore deve girare ad alte velocità ci sono sistemi che fanno il sotto vuoto.

In generale, le centrifughe sono classiche in base a tre parametri:

• Velocità massima che possono raggiungere
• Se hanno o meno un sistema di raffreddamento
• La capacità, cioè la quantità di materiale che può essere centrifugazione

Centrifughe da banco

Hanno velocità bassa e vengono utilizzate per far precipitare le cellule o per separare dei materiali grossolani insolubili.

Microcentrifughe

Raggiungono velocità più elevate.

Centrifughe ad alta velocità

Vengono utilizzate per purificare cellule e organuli cellulari.

Ultracentrifughe

Raggiungono dei campi centrifughi molto elevati.

Le provette da centrifuga sono sia provette piccole che vanno nelle microcentrifughe sia provette che servono per centrifughe di grandi dimensioni.

Quindi hanno una misura molto variabile in base a cosa dobbiamo separare.

Per non creare danni alla centrifuga, bisogna bilanciare la centrifuga, cioè i campioni devono essere posti diametralmente opposti così da avere un peso uniforme.

Ci sono vari tipi di rotori:

• Rotori ad angolo fisso = la provetta ha una inclinazione rispetto al asse di rotazione
• Rotori ad angolo verticale
• Rotori a braccio oscillante = si usano quando si ha bisogno di una maggiore capacità centrifugativa, perché durante la centrifugazione la provetta cambia l’inclinazione, passando da prima verticale a poi orizzontale

Altri tipi di centrifughe

Centrifugazione analitica: utilizzata per studiare alcune caratteristiche delle macromolecole come massa molecolare o grado di purezza.

Purificazione preliminare

Frazionamento

Fare un frazionamento si intende creare dei sottoinsiemi in modo tale da raccoglienti in ogni sottoinsieme delle proteine che hanno delle caratteristiche comuni.

Queste tecniche di separazione sono basate sulle diverse proprietà chimico-fisiche delle proteine = solubilità, polarità, carica ione, legame specifico, peso molecolare, idrofobicità.

Ci sono varie tappe di frazionamento per ogni proprietà chimico-fisiche.

Infatti, ad esempio, all’inizio si separano le proteine in base alla propria solubilità.