Biochimica II - dalle proteine che legano l'ossigeno alle vitamine

Biochimica II

Proteine che legano l'ossigeno

L'ossigeno è poco solubile in acqua a causa della sua apolarità, pertanto nel corpo umano è necessario agevolare il trasporto dell'ossigeno con altre molecole. Queste sono principalmente proteine, in particolare mioglobina, proteina monomerica che trasporta ossigeno nel muscolo, ed emoglobina, proteina tetramerica che trasporta ossigeno nel sangue.

Gruppo eme

Per legare l'ossigeno viene sfruttata la proprietà di metalli, in particolare il ferro, di legarlo. Il ferro viene sfruttato nella sua forma Fe²⁺ all'interno di un anello tetrapirrolico sostituito detto protoporfirina IX, che col ferro(II) costituisce il gruppo eme. L'eme globinico (eme b) è quindi composto dalla protoporfirina IX e dal Fe²⁺ che instaura quattro legami di coordinazione con gli atomi di azoto dei pirroli. Il ferro(II) inoltre forma altri due legami di coordinazione, uno con l'istidina prossimale (His F8) di una delle proteine di trasporto e l'altro proprio con l'ossigeno da trasportare.

La presenza dell'ossigeno nel legame di coordinazione varia l'angolo ferro(II)-protoporfirina. Quando esso è assente, il ferro(II) presenta un raggio ionico più grande e di conseguenza la protoporfirina è lievemente inclinata, mentre quando il ferro(II) lega anche l'ossigeno, esso "tira su" il ferro e ristabilizza il legame sul piano dell'anello porfirinico. Essendo il ferro in grado di legare ossigeno, potrebbe legarlo anche come ferro libero all'interno dell'eme, ma se questo accadesse tenderebbe a ossidarsi formando un dimero eme(Fe³⁺)-eme(Fe³⁺) legati da un singolo atomo di ossigeno.

Per questo motivo è necessaria la componente polipeptidica (His F8) nella quinta posizione di coordinazione del ferro, essa permette un trasferimento parziale, non ossidazione totale, dall'ossigeno al ferro(II). Il trasferimento parziale porta alla formazione di uno ione superossido che viene trattenuto dal legame col ferro(II) parzialmente ossidato a ferro(III). Il legame tra ossigeno e ferro è stabilizzato ulteriormente dalla presenza di un'istidina distale (His E7) nella proteina di trasporto poiché si lega al secondo atomo di ossigeno creando un angolo di legame più stabile. La presenza di componenti idrofobiche (Phe e Val) impedisce ulteriormente l'ossidazione del ferro.

La componente peptidica è utile anche grazie a una funzione di protezione da molecole tossiche. Infatti, quando il ferro(II) lega il CO, l'His E7 provvede a inclinare il legame senza legarsi con l'ossigeno del CO, favorendo così un rilascio del CO e il legame con l'O₂.

Mioglobina (Mb)

La mioglobina è una proteina monomerica contenuta nelle cellule del miocardio, nelle fibre muscolari di tipo I e nelle fibre muscolari di tipo IIA che svolge funzione di immagazzinamento dell'ossigeno. La mioglobina non lega sempre l'ossigeno, esiste infatti un equilibrio tra mioglobina deossigenata (Mb) e mioglobina ossigenata (MbO₂) regolato da una costante di dissociazione K_d. A partire dalla K_d, conoscendo la concentrazione di mioglobina non ossigenata e di ossigeno, possiamo risalire alla concentrazione di mioglobina ossigenata.

Spesso viene utilizzato il valore Y definito come la frazione di siti di Mb occupati da O₂ e calcolato come concentrazione di mioglobina ossigenata (MbO₂) fratto concentrazione totale di mioglobina (Mb+MbO₂).

Curve di legame con O₂ della mioglobina

Il valore Y dipende dalla concentrazione di ossigeno secondo una relazione specifica. Sostituendo la concentrazione di emoglobina ossigenata e raccogliendo all'interno dell'equazione per calcolare Y, si ottiene che Y dipende dalla concentrazione di ossigeno divisa per la somma tra concentrazione di ossigeno e K_d. Dato che la concentrazione è proporzionale alla pressione parziale di ossigeno (pO₂), si può rappresentare graficamente l'iperbole di saturazione e determinare la pressione alla quale metà della mioglobina presente è ossigenata, chiamata p50.

Dalla curva di saturazione si può determinare anche l'affinità della mioglobina per l'ossigeno a una determinata pressione parziale, dimostrando che la mioglobina non favorisce il rilascio dell'ossigeno nei tessuti poiché l'affinità è molto alta quindi tenderebbe a rimanere saturata alle pressioni parziali di ossigeno del sangue.

Neuroglobina (Ngb)

La neuroglobina è una proteina monomerica che agisce come piccola riserva di ossigeno nei neuroni, proteggendo dall’ipossia. Ha un’affinità più alta della mioglobina per l’ossigeno grazie alla coordinazione esavalente del ferro(II) nell’eme globinico, che è legato direttamente all’His E7 quando non è legato con ossigeno.

Avvelenamento da CO

La tossicità del CO è dovuta alla formazione di carbossiemoglobina (COHb). Superando il 20% di concentrazione di COHb si ha avvelenamento che porta a cefalea, nausea, dispnea e altri sintomi; oltre il 50% si raggiunge la morte. L’avvelenamento da CO viene curato somministrando ossigeno puro o con camere iperbariche. Esiste una neuroglobina wild-type modificata (NgbH64Q) con un’affinità elevata per il CO riducendo la sua tossicità, riducendo la formazione di carbossiemoglobina, utile come terapia per ipossia.

Emoglobina (Hb)

L’emoglobina è una proteina tetramerica composta da due catene polipeptidiche uguali a due a due. Le catene globiniche presenti nell’emoglobina possono essere di vari tipi, una coppia proveniente dalla famiglia alfa e una coppia proveniente dalla famiglia beta delle globine.

• Famiglia ALFA: α - emoglobine di tutti i tipi (embrionale, fetale e dell’adulto)
• ζ - emoglobine embrionali
• θ - scoperta recentemente con funzione ignota
• Famiglia BETA: β - emoglobina dell’adulto
• δ - emoglobina dell’adulto
• γ - emoglobina embrionale e fetale
• ε - emoglobine embrionali

Le catene globiniche presenti nell’emoglobina sono differenti nelle diverse fasi di vita:

• Fase embrionale → prevalgono catene α, ζ, γ, ε.
• Fase fetale → le catene ε e ζ scompaiono e lasciano il posto alle catene β.
• Dopo la nascita → le catene γ diminuiscono, le catene β aumentano e subentrano le catene δ.

In base alla fase della vita si formano quindi emoglobine differenti dalla combinazione delle varie catene globiniche alfa e beta. Le emoglobine embrionali includono Hb Gower 1 (ζ₂ε₂), Hb Gower 2 (α₂ε₂), e Hb Portland (ζ₂γ₂). L'emoglobina fetale è HbF (α₂γ₂). Le emoglobine dell'adulto sono HbA (α₂β₂) e HbA2 (α₂δ₂).

Le catene globiniche beta dell’emoglobina sono strutturalmente molto simili alla mioglobina, questo perché le globine derivano tutte da una globina ancestrale che si è modificata nel corso dell’evoluzione.

Emoglobina - Struttura

Le catene α sono legate alla catena β corrispondente da interazioni idrofobiche molto intense date dagli amminoacidi presenti, formando così due dimeri αβ legati da legami a idrogeno più deboli. L’emoglobina è quindi separabile in questi due dimeri attraverso trattamento con urea, o un altro agente caotropico.

L’emoglobina esiste in due conformazioni, una conformazione T (tesa) con bassa affinità per l’ossigeno e una conformazione R (rilassata) con alta affinità per l’ossigeno. La conformazione T è stabilizzata da interazioni ioniche tra gli amminoacidi che vengono meno in presenza dell’ossigeno che si lega all’eme, poiché favorisce lo scivolamento delle due eliche all’interfaccia passando dallo stato T allo stato R.

Curve di legame di O₂ dell'emoglobina

Data la presenza di questi due stati, l’emoglobina è presente in una miscela di questi stati che porta la curva di saturazione ad avere un andamento sigmoidale adatto a trasportare l’ossigeno nel sangue dai polmoni ai tessuti. L’andamento sigmoidale riflette un meccanismo di legame cooperativo dell’emoglobina con 4 siti di legame massimi.

Si può quindi descrivere l’equilibrio di dissociazione allo stesso modo della mioglobina tramite le pressioni parziali, con la differenza che dobbiamo tenere di conto dell’allosterismo dell’emoglobina ottenendo l’equazione di Hill. Sperimentalmente si può determinare un coefficiente di Hill che riflette la cooperatività dell’emoglobina e esprime il grado di interazione dei siti di legame.

La cooperatività dei siti di legame dell’emoglobina può essere descritta con due modelli: il modello concertato (Monod-Wyman-Changeux, MWC) e il modello sequenziale (Koshland). Nel modello concertato esistono contemporaneamente tutte le forme con le subunità in forma T e R, in equilibrio favorito in base alla presenza di ossigeno. Nel modello sequenziale, il legame con una molecola di ossigeno induce una modifica conformazionale nelle altre subunità favorendo il legame con altre molecole che induce ulteriori modifiche.

Fattori che influenzano il rilascio di ossigeno

Attraverso l’esercizio fisico si favorisce il rilascio di ossigeno nei tessuti poiché si riduce la pressione parziale al loro interno consumando ossigeno, passando da un rilascio di ossigeno a riposo del 21% a un rilascio totale del 66%. Per determinare questi valori si utilizza la curva di saturazione dell’emoglobina considerando pressioni parziali di ossigeno a riposo e durante l’attività fisica.

La presenza di 2,3 - bisfosfoglicerato (2,3-BPG) riduce l’attività dell’emoglobina in quanto il 2,3-BPG funge da effettore allosterico negativo legandosi alla tasca che si forma tra le subunità nella forma T. La forma T viene stabilizzata e viene sfavorito il passaggio alla forma R. Il 2,3-BPG è presente in ogni cellula ma nei globuli rossi è presente in maggior quantità (5mM), viene sintetizzato a partire da 1,3-BPG attraverso una via alternativa alla glicolisi che è la via di Rapoport-Lubering. Nonostante il 2,3-BPG sia un effettore negativo, la sua presenza è essenziale in quanto permette un rilascio di ossigeno efficiente.

L’altitudine influenza ulteriormente il rilascio d’ossigeno in quanto aumenta la quantità di 2,3-BPG nei globuli rossi raggiungendo 8mM a circa 4500m di altezza. Varia anche la pressione parziale dell’ossigeno in quanto l’aria è più rarefatta e si ha una produzione maggiore di eritropoietina che favorisce la produzione di globuli rossi. Con tutti questi fattori si riduce l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno e si favorisce il rilascio, oltre ad un adattamento dell’organismo alle pressioni parziali di quelle altitudini.

Emoglobina fetale (HbF)

L’emoglobina fetale non presenta le catene β dell’emoglobina dell’adulto ma presenta catene γ non adatte a legare il 2,3-BPG, quindi aumenta l’affinità di HbF per l’ossigeno.

Effetto Bohr

A livello dei tessuti periferici sono presenti cellule che producono CO₂ tramite metabolismo ossidativo. La CO₂ entra quindi nel sangue attraverso i capillari tissutali. L’enzima anidrasi carbonica all’interno dei globuli rossi catalizza l’idratazione della CO₂ a H₂CO₃ che si dissocia formando HCO₃^- e ioni H⁺. Parte degli ioni H⁺ viene rilasciato, ma il pH del sangue deve rimanere stabile (7,4), pertanto l’emoglobina agisce come sistema tampone.

Gli H⁺ si legano reversibilmente al C-terminale dell'emoglobina favorendo la formazione di legami ionici tra i residui che portano a cambiamenti strutturali. Il legame con ioni H⁺ favorisce il rilascio di ossigeno in quanto si legano con la forma T dell'emoglobina riducendo la quantità di forma R legante l'ossigeno. Quando (nH⁺)Hb lega l'ossigeno passando alla forma R, rilascia gli ioni H⁺ deprotonando l'His C-terminale.

Quando i tessuti svolgono metabolismo ossidativo consumano ossigeno e producono CO₂, portando alla formazione di ioni H⁺ e a legami con Hb con conseguente rilascio di ossigeno. A livello polmonare la CO₂ deve essere rilasciata spostando l'equilibrio verso la produzione di CO₂ grazie a un antiporto tra Cl^- e HCO₃^-. Parte della CO₂ si lega covalentemente all'Hb sull'N-terminale formando carbamino emoglobina stabilizzata in forma T che favorisce il rilascio di ossigeno fino all'88%.

Emoglobina glicata (HbA1c)

L'emoglobina glicata (HbA1c) è una forma di HbA che ha reagito tramite glicazione col glucosio (Glc) presente nel sangue. La forma lineare del Glc reagisce con i residui di Lys dell'emoglobina formando basi di Schiff, queste vengono ridotte a chetoammine (prodotti di Amadori) e successivamente formano prodotti AGE (Advanced Glycation End Products) che inattivano la proteina. La concentrazione di HbA1c è elevata nei diabetici in quanto aumenta con un'elevata glicemia per un lungo periodo, misurare la concentrazione di HbA1c è utile per determinare se la terapia ha avuto effetto.

Patologie

Le patologie legate all’emoglobina possono essere di due tipi principalmente: talassemie, legate all’espressione dei geni a livello quantitativo, e emoglobinopatie, anomalie strutturali a livello qualitativo. Le talassemie sono patologie che portano ad anemie di gravità variabile con una ridotta produzione di catene globiniche. Se non vengono prodotte le catene della famiglia alfa si parla di α-talassemie, se non vengono prodotte le catene della famiglia beta si parla di β-talassemie. Sono molto frequenti i...