Appunti teoria Applicazioni ingegneristiche in ambito biomedico

BIOCOMPATIBILITÀ

1. Processo di emostasi

1.1 Composizione del sangue

1.2 Processo emostatico: formazione del coagulo

1.3 Assorbimento delle proteine sulla superficie del biomateriale

2. Adesione delle proteine sui materiali biocompatibili

2.1 Modello di Langmuir per assorbimento reversibile

2.2 Scatchard plot

2.3 Dosaggio in laboratorio delle concentrazioni di proteine 1

1.1 Composizione del sangue

La composizione in percentuale del sangue prevede:

• globuli rossi (eritrociti), i quali hanno dimensione di

% 7 − 8

• buffy coat, composto da globuli bianchi (leucociti), con diamentro di e da

% 10 − 15 ,

piastrine, grandi circa 2 − 3

• plasma (acqua, rifiuti, proteine, glucosio..)

%

I vasi sanguigno del corpo hanno diametri variabili a secondo della tipologia e funzione:

• Diametro interno medio vene: 5

• Diametro interno medio arterie: 4

• Diametro interno medio arteriole: 30

• Diametro intento medio venule: 20

• Diametro interno medio capillare: 8 2

1.2 Processo emostatico: formazione del coagulo

L’emostasi è il processo fisiologico che consente l’arresto della fuoriuscita di sangue da un vaso

danneggiato. Si tratta di un meccanismo altamente regolato, il cui obiettivo è formare rapidamente un

coagulo nel punto di lesione e rimuoverlo una volta completata la riparazione del tessuto. Il processo

può essere suddiviso in tre fasi principali.

1) Formazione del coagulo (fase emostatica)

Questa fase ha lo scopo di arrestare rapidamente la perdita di sangue e comprende più eventi

coordinati.

• Vasocostrizione

Il danno alla parete del vaso provoca il rilascio di mediatori vasocostrittori che determinano una

contrazione delle arteriole in prossimità della lesione, riducendo temporaneamente il flusso

ematico.

• Aggregazione piastrinica

La lesione endoteliale espone la matrice subendoteliale. Le cellule endoteliali rilasciano fattori

che permettono alle piastrine di aderire al sito di danno. Le piastrine aderenti si attivano,

cambiano forma e rilasciano mediatori (come il trombossano che richiamano altre piastrine,

₂)

portando alla formazione del tappo piastrinico primario.

• Coagulazione (formazione della fibrina)

Il tappo piastrinico viene stabilizzato dalla formazione di una rete di fibrina, ottenuta attraverso

l’attivazione della cascata coagulativa:

Via intrinseca: innescata dal contatto del sangue con superfici non endoteliali (ad

a) esempio collagene o superfici artificiali). Coinvolge l’attivazione sequenziale dei fattori ,

e porta infine all’attivazione del fattore

, .

Via estrinseca: attivata da un danno tissutale e dal rilascio del fattore tissutale (fattore

b) ),

che attiva il fattore e successivamente il fattore

.

Via comune: le due vie convergono sull’attivazione del fattore che porta alla

c) ,

formazione di trombina. La trombina converte il fibrinogeno in fibrina, che viene

stabilizzata dal fattore formando il coagulo definitivo.

3

2) Retrazione del coagulo

Una volta formato, il coagulo va incontro a retrazione: la fibrina perde acqua e si accorcia,

avvicinando i margini della ferita. Questo processo richiede energia sotto forma di ed è

importante per favorire la riparazione del tessuto.

3) Fibrinolisi

La fibrinolisi è il processo che bilancia la coagulazione e ha lo scopo di degradare la fibrina e il

fibrinogeno, limitare il coagulo alla sola sede del danno, rimuovere il coagulo al termine della

riparazione tissutale. Il processo è mediato dalla plasmina, che deriva dal plasminogeno, una forma

inattiva. Il plasminogeno viene attivato principalmente da t-PA (attivatore tissutale del plasminogeno),

prodotto dalle cellule endoteliali e u-PA (urochinasi). Il t-PA ha elevata affinità per la fibrina e agisce

quindi in modo localizzato sul coagulo. L’accoppiamento tra coagulazione e fibrinolisi garantisce una

risposta rapida ma controllata. 4

1.3 Assorbimento delle proteine sulle superficie del biomateriale

Quando un biomateriale entra in contatto con l’organismo, la prima risposta biologica non è diretta

verso il materiale in sé, ma verso le proteine plasmatiche che si adsorbono sulla sua superficie.

L’insieme delle proteine adsorbite costituisce l’interfaccia reale tra biomateriale e organismo e

determina la successiva risposta biologica. Le conseguenze dell’adsorbimento proteico sono differenti

1) Attivazione della cascata della coagulazione

Alcune proteine plasmatiche, in particolare il fibrinogeno, tendono ad adsorbirsi rapidamente sulle

superfici artificiali. Il fibrinogeno adsorbito può subire un cambiamento conformazionale, esponendo

siti di legame che non sono accessibili nella forma circolante. In questa condizione, il fibrinogeno può

legarsi ai recettori piastrinici (/), favorendo l’adesione e attivazione delle piastrine, il rilascio

di mediatori pro-coagulanti, la formazione del tappo piastrinico e possibile sviluppo di trombi. Di

conseguenza, una superficie con elevata affinità per il fibrinogeno mostrerà anche un’elevata

trombogenicità.

2) Attivazione del sistema del complemento

Il sistema del complemento è una componente dell’immunità innata ed è costituito da circa 30

proteine solubili che circolano nel plasma in forma inattiva. La loro attivazione avviene tramite una

cascata enzimatica.

• Via classica

Un materiale estraneo può essere riconosciuto indirettamente attraverso anticorpi

(immunoglobuline, a forma di Y). Quando più anticorpi si legano a un antigene, la loro porzione

costante consente l’attivazione della proteina L’attivazione di innesca una cascata che

. 1

porta alla formazione del complesso di attacco alla membrana (). Il si inserisce nella

membrana dell’agente estraneo, formando un poro che altera il potenziale di membrana e porta

alla sua distruzione.

• Via alternativa

Alcune superfici artificiali possono attivare direttamente il complemento senza il coinvolgimento

degli anticorpi, portando all’attivazione della proteina Questa attivazione dipende dalle

.

caratteristiche chimico-fisiche della superficie del biomateriale. L’effetto finale è comunque la

produzione di mediatori infiammatori e del . 5

3) Reazione da corpo estraneo

Se l’attivazione immunitaria persiste, l’organismo può sviluppare una reazione da corpo estraneo,

caratterizzata da adesione e attivazione di macrofagi e monociti sulla superficie del biomateriale,

fusione di queste cellule in cellule giganti multinucleate, attivazione dei fibroblasti, che producendo

collagene, formano una capsula fibrotica attorno al materiale: ne segue l’invasione della capsula da

parte di cellule endoteliali per garantire apporto di nutrienti. Questa risposta ha lo scopo di isolare il

materiale estraneo dal resto dell’organismo, ma può compromettere la funzionalità del biomateriale e

portare al suo rigetto. 6

2.1 Modello di Langmuir per assorbimento reversibile

Quando un biomateriale entra in contatto con il sangue, la prima risposta biologica è dominata

dall’adsorbimento delle proteine circolanti sulla sua superficie. Questo evento iniziale è cruciale

perché alcune proteine, come il fibrinogeno, possono favorire l’adesione piastrinica e innescare la

cascata coagulativa. Per questo motivo, un biomateriale biocompatibile dovrebbe presentare bassa

affinità per il fibrinogeno.

Il modello di Langmuir descrive l’adsorbimento proteico assumendo che la superficie presenti un

numero finito di siti di legame, l’adsorbimento sia reversibile, ogni sito possa legare una sola molecola

e non vi siano interazioni tra le molecole adsorbite.

La reazione superficiale, cioè il legame proteina-sito di legame, è assimilabile a una reazione chimica:

[] []

+ ⇌ []

dove:

concentrazione della proteina in soluzione [ ]

• []: ⁄

densità superficiale dei siti di legame liberi [ ]

• []: ⁄ 2

densità superficiale dei siti occupati dalla proteina [ ]

• []: ⁄ 2

Si può semplificare la reazione ipotizzando che essa avvenga seconda una cinetica di primo ordine e

considerando costante di associazione (velocità di assorbimento) e la costante di dissociazione

(velocità di distacco). All’equilibrio vale:

[][] = []

da cui si ricava la costante di equilibrio (o di affinità): []

= = [][]

Immaginiamo ora di avere inizialmente un certo numero di

siti di legame occupati dalla proteina. Poiché il legame

non è stabile, le proteine tenderanno progressivamente

a staccarsi dalla superficie. Con il passare del tempo, il

numero di proteine adsorbite diminuisce e l’andamento di

questo processo è un esponenziale negativo. Si assume

che la velocità di dissociazione dipenda dalla quantità

di proteine legate in quell’istante, quindi il processo

segue nuovamente una cinetica del primo ordine:

[]

= = − []

Integrando l’equazione si ottiene la variazione del legame

proteina-sito nel tempo:

[] −

[]() = []

0

dove è il numero iniziale di siti occupati, cioè a

[] = 0.

0

Questa relazione descrive quantitativamente la natura reversibile e dinamica dell’adsorbimento

proteico sulle superfici dei biomateriali. 7

Per valutare il grado di copertura della superficie si introduce il parametro il quale rappresenta il

,

numero di siti di legame occupati rispetto al numero totale dei siti di legame :

[] []

0

[] []

= =

[] [] []

+

0

Sostituendo l’espressione della costante di equilibrio si ottiene:

[]

[][] =

[]

= 1 + []

Questa relazione presenta un andamento tipo Michaelis–Menten: per basse concentrazioni di

proteina ([] l’aumento di è quasi lineare cioè mentre a concentrazioni elevate si

≪ 1), ≈ [],

raggiunge un plateau di saturazione cioè (i siti di legami liberi si esauriscono).

→ 1

La conoscenza della costante consente quindi di prevedere l’affinità tra una proteina e un

biomateriale e di valutare la sua biocompatibilità. 8

2.2 Scatchard plot

Per determinare sperimentalmente la costante di affinità il numero totale di siti di legame, si utilizza

e

il diagramma di Scatchard. Si parte dalla relazione: []

[] = []

Sapendo che e assumendo che la concentrazione di proteina in soluzione resti

[] = [] − []

0

praticamente costante ([] ), si ottiene:

≈ []

0 [] = −[] + []

0

[]

0

Questa è l’equazione di una retta, dove è la pendenza mentre è l’intercetta sull’asse delle

− []

0

ordinate. []

Dal grafico di in funzione di è quindi possibile ricavare la costante di affinità e il

[]

⁄

[]

0

numero totale di siti di legame disponibili sulla superficie del biomateriale.

[] 9

2.1 Dosaggio in laboratorio delle concentrazioni di proteine

Per studiare l’adsorbimento proteico è necessario misurare la concentrazione di proteine in

soluzione, operazione che può essere eseguita con diverse tecniche (colorimetria, fluorescenza,

marcatori radioattivi).

La tecnica più comune per la valutazione della concentrazione di proteine in soluzione è la

colorimetria. Si utilizza uno spettrofotometro e un colorante (ad esempio Coomassie Brilliant Blue)

che si lega alle proteine. Il principio è basato sull’assorbimento della luce. Un fascio luminoso di

intensità iniziale attraversa la soluzione e parte della luce viene assorbita dalle proteine, quindi il

0

detector posto dopo la soluzione misura l’intensità trasmessa . Da queste grandezze si ricava

l’assorbanza, parametro che è proporzionale alla concentrazione proteica, quindi conoscendo il

valore dell’assorbanza è possibile ricavare la concentrazione delle proteine in soluzione:

= − log() = − log( )

0

Lo spettrofotometro utilizza un monocromatore o un filtro, che seleziona sola una specifica

lunghezza d’onda della luce bianca perché l’assorbimento della luce da parte delle sostanze dipende

dalla lunghezza d’onda: infatti esiste una lunghezza d’onda caratteristica alla quale l’assorbimento è

massimo ( ). In questo modo si misura solo l’assorbimento dovuto al colorante–proteina;

Per convertire l’assorbanza in concentrazione è necessaria una curva di calibrazione:

1. si preparano soluzioni con concentrazioni di proteine note

2. si misura l’assorbanza di ciascuna soluzione

3. si costruisce una retta di regressione lineare

4. l’assorbanza del campione incognito (di cui non si conosce la concentrazione) viene

interpolata sulla curva.

In questo modo si ottiene la concentrazione di proteine, informazione essenziale per analizzare

quantitativamente i fenomeni di adsorbimento sui biomateriali. 10

EMODIALISI

1. Accesso vascolare (fistola arterovenosa)

1.1 Cos’è un accesso vascolare e perché necessario per l’emodialisi

1.2 Tipi di accesso vascolare: arterizzazione della vena e alternative alla fistola arterovenosa

2. Circuito extracorporeo del sangue

2.1 Disegno del circuito con tutti i suoi componenti

2.2 Funzionamento del rivelatore dell’aria

2.3 Pompa utilizzata per movimentare il sangue e la sua posizione

2.4 Pressione arteriosa e pressione venosa nel circuito del sangue

2.5 Struttura e funzionamento del dializzatore

2.6 Movimento del sangue all’interno del tubo rigido

3. Circuito idraulico del liquido di dialisi

3.1 Disegno del circuito con tutti i suoi componenti

3.2 Pompa dosatrice e composizione del liquido di dialisi

3.3 Funzionamento del controllo della conducibilità (Ponte di Wheatstone)

3.4 Pompa utilizzata per movimentare il liquido di dialisi e la sua posizione

4. Trasporto diffusivo dei soluti

4.1 Struttura delle membrane e dimensione media dei pori, quali molecole passano

4.2 Legge di Fick per trasporto attraverso film sottili

4.3 Legge di Fick per trasporto attraverso membrana: ingombro sterico ed effetto idrodinamico

4.4 Confronto tra scambio equicorrente e controcorrente

5. Trasporto convettivo dei soluti

5.1 Sieving coefficient e flusso totale del soluto

6. Adeguatezza della seduta emodialitica

6.1 Necessità di valutare l’efficienza della seduta (fenomeno di Rebound)

6.2 Come avviene la valutazione attualmente

7. Modalità di dialisi

7.1 Emodiafiltrazione: ultrafiltrazione e il suo funzionamento 11

1.1 Cos’è un accesso vascolare e perché necessario per l’emodialisi

Per accesso vascolare si intende una modalità di inserimento di un dispositivo medico all'interno

di un vaso sanguigno, solitamente una vena o un'arteria, con lo scopo di somministrare farmaci o

liquidi, prelevare sangue, eseguire dialisi e monitorare parametri emodinamici.

Nell’emodialisi, l’accesso vascolare è indispensabile perché consente il prelievo e la restituzione del

sangue al paziente a portate elevate e costanti, necessarie per garantire un’adeguata depurazione

extracorporea.

Esistono diversi tipi di accessi vascolari, classificati principalmente in base alla durata dell’uso

(temporanei o a lungo termine), al tipo di vaso sanguigno utilizzato (vena o arteria) e al

posizionamento del dispositivo. 12

1.2 Tipi di accessi vascolari: arterizzazione della vena e alternative alla FAV

In emodialisi è necessario disporre di un accesso vascolare in grado di garantire portate elevate e stabili,

dell’ordine di circa , indispensabili per un’efficace depurazione del sangue. Tuttavia, in

condizioni fisiologiche, nel braccio circolano solo , valore insufficiente per il trattamento.

80 − 100

Per questo motivo è necessario modificare chirurgicamente la circolazione del paziente, creando un

accesso vascolare adeguato.

1) Fistola arterovenosa (FAV)

L’accesso vascolare di prima scelta è la fistola arterovenosa, che consiste in un bypass chirurgico tra

un’arteria e una vena. Il sangue arterioso, passando direttamente nella vena, determina un importante

aumento della portata venosa, rendendo il vaso idoneo alla cannulazione con aghi di grosso calibro.

La vena, pur essendo a bassa pressione, è in grado di sostenere alte portate, e dopo la rimozione

dell’ago è sufficiente una lieve compressione per evitare emorragie.

Le principali anastomosi utilizzate sono:

• Distali (lontane dal cuore), garantiscono

portate più moderate ma hanno un minor

rischio di complicanze

Radio-cefalica: arteria radiale con

▪ vena cefalica.

• Prossimali, che forniscono portate

maggiori:

Brachio-cefalica: arteria brachiale con vena cefalica.

▪ Brachio-basilica: arteria brachiale con vena basilica.

▪

Le configurazioni chirurgiche possibili dell&rsqu