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Applicazioni ingegneristiche in ambito biomedico

21/2/2022

Ci sono dei parziali oppure il totale (con orale obbligatorio sotto il 24). Le prove in itinere sono il 26 aprile e il 23 maggio. Il programma sarà suddiviso in:

Prima prova in itinere

• Introduzione: Sviluppo della medicina moderna, approcci terapeutici, utilizzo delle tecnologie.
• Biocompatibilità: Definizione del problema, sistema della coagulazione, sistema del complemento; interazione tra materiali e le proteine plasmatiche; metodiche quantitative; strategie;
• Sostituzione della funzione renale: Il trattamento emodialitico; organizzazione del rene artificiale; accessi vascolari; pompe peristaltiche; filtro dializzatore; fenomeni di trasporto attraverso le membrane dialitiche; permeabilità, ultrafiltrazione, selettività delle membrane; osmosi inversa per liquido di dialisi; valutazione dell'efficacia del trattamento; prospettive future;
• Sostituzione della funzione renale: La dialisi peritoneale; Trasporti di membrana nella dialisi peritoneale; Sviluppi futuri del trattamento dialitico;
• Sistemi per trattamento del sangue e dei tessuti: Plasmaferesi; aferesi; sistemi di adsorbimento; sistemi per la perfusione di organi per il trapianto.

Seconda prova in itinere

• Sostituzione della funzione cardiaca: Trattamento chirurgico dell'insufficienza cardiaca; circolazione extracorporea per bypass cardio-polmonare; ossigenatori.
• Sostituzione/assistenza del controllo glicemico: Terapia insulinica e controllo glicemico; infusori per l'insulina; controllo glicemico estemporaneo e continuo; controllo glicemico mediante circuito chiuso (pancreas artificiale).
• Sostituzione/assistenza della funzione polmonare: Ventilatori; sistemi per ossigenazione extracorporea (ECMO).
• Organi bio-artificiali: Ingegneria dei tessuti, scaffolds biodegradabili, bioprinting.

Programma della prima prova in itinere

Lezione 2: La biocompatibilità

La medicina moderna e le nuove tecnologie

I primi interventi chirurgici avevano degli impedimenti: La mancanza di un procedimento anestetico e lo sviluppo delle infezioni. L'ostacolo delle infezioni si è superato per mezzo dello sviluppo di antibiotici e partì la chirurgia ricostruttiva (rimozione tessuto danneggiato e ricostruzione di esso per mezzo del prelievo di tessuti sani).

Era necessario trovare dei tessuti/organi che potessero essere sostituiti con quelli non funzionanti, invece che rimuovere del tutto e basta come si faceva prima, inizio anni '60 si inizia a sviluppare la medicina degli organi artificiali e dei trapianti di organi. Per risolvere il problema del rigetto di trapianti vennero messi a punto i farmaci in grado di inibire la reazione di rigetto del sistema immunitario.

Limiti delle due strade mediche parallele del trapianto e degli organi artificiali

• Gli organi artificiali hanno il limite di non poter sostituire in modo completo le funzioni biologiche (la ciclosporina inibisce il rigetto);
• Il trapianto ha il limite della disponibilità degli organi (donatori e cadaveri). Tra specie diverse si ha rigetto immediato, la strada è molto in salita, è più facile tra stessa specie.

Negli ultimi anni ha preso piede la terapia cellulare: raccogliere cellule trovate in un corpo o create in laboratorio, manipolarle in laboratorio e trapiantarle nel paziente. Il trapianto deve essere protetto dalla terapia anti rigetto, un'alternativa molto utilizzata è quella dell'autotrapianto (prelevare cellule dal paziente, manipolarle e trapiantarle nello stesso).

Oggi si parla di evidence-based medicine: si curano i pazienti sulla base di cure scientificamente dimostrate, la sperimentazione clinica deve permettere di dimostrare che un certo trattamento è efficace. Si ricorre a clinical trials (misurazione, raccolta dati, ecc. Tutto basato sulla tecnologia).

La medicina personalizzata è basata sul fatto che i medici devono intervenire sul paziente con un trattamento ad hoc. Per farlo è necessario avere a disposizione delle informazioni sul paziente raccolte per mezzo di strumentazioni, sistemi di raccolta dati, strumenti di diagnostica (informatica medica), terapia e riabilitazione personalizzate.

La biocompatibilità

I materiali che vengono inseriti nel corpo e le loro forme e geometrie non devono indurre fenomeni che possono alterare il funzionamento del corpo umano o dello stesso impianto. Se il dispositivo viene ben accettato dall'organismo si possono ottenere risultati clinici importanti, molti pazienti possono farne uso e chi costruisce i dispositivi guadagna (aumentano risultati clinici e impatto economico). Non c'è un materiale biocompatibile al 100% quindi le complicanze possono sempre insorgere, è importante minimizzarle o tenerle sotto controllo.

Il problema della compatibilità coinvolge tutte queste aree, la superficie a contatto con il sangue deve avere delle caratteristiche, importante il contatto con la superficie, le proteine, le cellule (non sempre contro le pareti) ma soprattutto le proteine. C'è una risposta biologica legata all'interazione delle proteine con i materiali.

Globuli rossi 45%, ce ne sono di più in uomini; Buffy coat 1% (Globuli bianchi e piastrine); Plasma 55% (acqua, rifiuti, proteine, glucosio); Diametro interno arterie: 4 mm; Diametro interno arteriole: 30 μm; Diametro interno capillare: 8 μm; Diametro interno venule: 20 μm; Diametro interno vene: 5 mm; Limite microscopio ottico: 1 μm; Limite microscopio elettronico: 0.3 nm.

Le piastrine: sono prodotte mediante la disgregazione dei megacariociti. Hanno una vita media 10 gg, e sono gli attivatori del processo della coagulazione. Non sono cellule perché non hanno il nucleo. La membrana delle piastrine: stessa membrana della cellula, doppio strato fosfolipidico. Emettono pseudopodi e adesione piastrinica (per riparare il danno del tessuto), attivazione (contenuto dei granuli viene rilasciato), secrezione, aggregazione.

Emostasi o coagulazione

Arresto della fuoriuscita di sangue da un vaso danneggiato (coagulazione fisiologica). Ci sono 3 fasi:

• Formazione di fibrina:
  • Vasocostrizione: il danno alla superficie interna del vaso provoca il rilascio di alcuni fattori vasocostrittori che agiscono nelle arteriole a livello della lesione per contrastare la perdita di sangue.
  • Aggregazione piastrinica: Cellule endoteliali a causa della lesione secernono una proteina che si dispone presso la lesione permettendo l’adesione piastrinica. Le piastrine una volta adese, rilasciano citochine (tromboxano A₂) che “reclutano” altre piastrine che a loro volta si accumulano presso la lesione attaccandosi alle altre già presenti. Si forma il tappo emostatico.
  • Coagulazione: stabilizzazione dell’aggregato grazie all’attivazione della fibrina. Il processo di attivazione della fibrina segue un meccanismo a catena a cui partecipano molti fattori. Via intrinseca con superficie non endoteliale (contatto innescata dall’attivazione di XII che si verifica quando il sangue entra in contatto con la matrice extracellulare, in particolare con il collagene. Viene poi attivato XI che attiva IX che a sua volta si attacca a VII e attiva X); Via estrinseca (trauma a livello tissutale) attivata da tromboplastina, fattore III, prodotta dal tessuto danneggiato. Viene attivato in seguito il fattore VII che poi attiverà X. Diminuendo il calcio blocco la coagulazione, oppure usando eparina (anticoagulante che blocca tutto) oppure altro anticoagulante che blocca la vitamina K e blocca la cascata; Via comune le due si congiungono. Questa via ha inizio con l’attivazione del fattore X che a sua volta attiva la trombina che permette la conversione del fibrinogeno in fibrina. È un’operazione di taglio, clivaggio. Il fibrinogeno ha 3 eliche con ponti disolfuro (vedo slides). Ci sono fibrino-peptidi attaccati, finché ci sono non coagula, ma se si staccano allora il fibrinogeno si stacca dal pezzo finale e si crea una catena, la fibrina. Un intervento del fattore XIII attivato permette la precipitazione della fibrina e la formazione del coagulo (rete di fibrina).
• Detrazione del coagulo: Fibrina cede acqua e si accorcia (è richiesta energia sotto forma di ATP);
• Fibrinolisi: Processo atto a bilanciare la coagulazione del sangue, le funzioni di questo processo sono essenzialmente: Degradare complessi di fibrina, Limitare la formazione del tappo emostatico nelle sedi di danno vascolare e non oltre, Rimuovere la fibrina al termine del processo riparativo.

La Fibrinolisi è operata dalla plasmina, fattore anticoagulante che viene anch’esso attivato dalla trombina. Il significato di questo accoppiamento di reazioni ad effetto biologico opposto è quello di garantire a una rapida formazione di un trombo, un altrettanto rapida eliminazione. Si tratta della ripartizione dei coaguli del sangue che è una parte cruciale della guarigione della ferita.

Il Sistema fibrinolitico degrada la fibrina e il fibrinogeno attraverso la plasmina che deriva a sua volta dal plasminogeno, un precursore inattivo (è il fattore XII che attiva il plasminogeno in plasmina). Il plasminogeno viene trasformato in plasmina ad opera del t-PA (attivatore tissutale del plasminogeno) oppure dell’u-PA (urochinasi). Il t-PA è sintetizzato dalle cellule endoteliali che lo riversano continuamente in circolo, dove si trova libero o complessato con gli inibitori. Ha un'affinità elevata per la fibrina e risulta quindi essere un efficiente attivatore del plasminogeno solo a livello della fibrina.

Bisogna trovare il modo di far accettare alle piastrine il materiale artificiale di modo che si possa tenere sotto controllo la cascata coagulativa e quindi evitare la formazione del coagulo e di trombi. La componente cellulare che riveste la superficie dei vasi, quella più interna a contatto con il lume del vaso, è la cellula endoteliale.

Gli elementi circolanti non possono arrivare direttamente sulla superficie della cellula endoteliale grazie a uno strato di proteine, proteoglicani, acido ialuronico e carboidrati (creano i glicosamminoglicani) definito glicocalice, che la riveste.

Lo strato ha carica negativa il che permette la repulsione delle proteine plasmatiche anch'esse negative e la repulsione elettrostatica delle piastrine anch'esse leggermente negative (no coagulazione interna), e così le piastrine si tengono leggermente sopra, non a contatto stretto.

Se l'endotelio si danneggia e si stacca una cellula, si espone il sottoendotelio, la cellula si attacca alla matrice extracellulare se le piastrine arrivassero a contatto con l'endotelio si attiverebbero all'incontro con il fibrinogeno, la cosa pericolosa dell'interazione è che il fibrinogeno si trasformerebbe in fibrina attivando la coagulazione.

Il materiale artificiale non ha un rivestimento simile al glicocalice quindi potrebbe esserci qualcosa che faccia aderire le piastrine: Se a una superficie artificiale aderisce il fibrinogeno, le piastrine si attivano e di conseguenza ne vengono richiamate altre fino alla possibile formazione del trombo. Se fibrinogeno è circolante espone dei siti di legame non utilizzabili dalle piastrine e non avviene la reazione di coagulazione; se il fibrinogeno è adeso alla superficie le piastrine interagiscono. La piastrina si ancora, espelle contenuto di granuli e cambia la forma, inizia così la formazione del trombo che può avvenire se la superficie (causa di fibrinogeno o collagene).

Dobbiamo modificare la superficie per evitare che la formazione di trombi avvenga.

Interazione piastrine e fibrinogeno su parete danneggiata

VWF (fattore di Von Willebrand) è importante per la funzione piastrinica catena proteica che ha diverse lunghezze a seconda di come viene assemblata. Come il fibrinogeno, se è circolante in forma globulare non fa aderire le piastrine; se invece aderisce al sotto endotelio si allunga esponendo i siti di legame e permette l’adesione delle piastrine e l’attivazione della cascata coagulativa. Se la catena si accorcia la coagulazione non avviene in maniera ottimale e si può andare incontro ad emorragie (es. in organi artificiali). Le piastrine come il VWF sono sensibili alle condizioni di moto.

Lezione 3: La biocompatibilità

Come possono essere modificati i materiali per diminuire l’interazione con le proteine del sangue? Proteine assorbite da un biomateriale determinano la reazione dell’organismo al materiale stesso mediante:

• Attivazione della cascata della coagulazione
• Attivazione del sistema del complemento: il sistema del complemento consiste in 30 proteine solubili che circolano nel plasma nella loro forma inattiva; possono essere attivate enzimaticamente attraverso una serie di reazioni.

Il materiale estraneo è un materiale che se messo a contatto con GB (anticorpi) non viene riconosciuto come parte del nostro organismo, che tenta di eliminarlo. Se l’anticorpo riconosce l’antigene si attiva la cascata del complemento, il riconoscimento è dovuto al fatto che abbiamo una serie di anticorpi molto variabili fra di loro. P.s. anticorpi sono immunoglobuline con forma ad Y, prodotti dalle cellule. Hanno una variabilità rispetto all’esterno che riconosce una molecola complementare. Lo si fa con cellule che hanno parti terminali molto diverse tra loro.

Gli anticorpi sono anche responsabili delle reazioni sbagliate fatte dall’organismo, come le allergie. Gli anticorpi sbagliano nelle reazioni autoimmuni, in cui l’anticorpo riconosce un antigene che però è parte dell’organismo. Gli anticorpi si bloccano sulla superficie del materiale immesso esterno. Tutti espongono la parte costante, perché a variabile sarà legata all’antigene.

Quando l’anticorpo aderisce ad un antigene, la parte esterna dell’anticorpo fa aderire altri anticorpi e poi aderisce la proteina del complemento (si attiva solo se all’antigene si collegano più anticorpi non solo uno, se sono attivati più siti di legame). Più specificatamente:

• Il complemento riconosce la presenza di anticorpi legati ad antigeni riconosciuti come estranei. Reazione antigene-anticorpo attiva C1 nella produzione di una catena più ridotta (C1a) la riduzione permette l’interazione con altre molecole. Trasforma C4 in C4b e C2 in C2a e questo permette altre trasformazioni fino alla produzione del complesso macromolecolare MAC (membrane attack complex). MAC è in grado di inserirsi nella membrana di un agente infettante, esso crea un foro alterando le funzioni della membrana che permettono all’agente infettante di sopravvivere. Perdita del potenziale di membrana e l’agente estraneo viene distrutto. Ha una forma di anello che, partendo dalla membrana del batterio si incastra nel doppio strato fosfolipidico e tutti gli elementi vanno nella membrana. Il buco che c’è al centro permette il passaggio da interno ad esterno di ciò che c’è nel batterio (ioni che cambiano il potenziale di membrana e cambia spesso fino a distruggere il batterio perché cambia troppo).

Alternative pathway: Interazione superficie artificiale / sistema del complemento. Materiali artificiali possono attivare direttamente il sistema del complemento grazie al riconoscimento di alcune superfici, e parte da C3. Il materiale in contatto con il sangue fa aderire delle proteine, C3 aderisce e crea C3b e C3a e solo C3a va ad attivare le cellule del sistema immunitario che crea citochine e da cui, esaurendo la funzione si ha la opsonization, distruzione.

La reazione dipende dalle caratteristiche superficiali del materiale che dipendono:

• Dalla forma
• Dalla rugosità
• Dalle cariche elettriche

Si studiano le strutture sulla superficie della membrana che potrebbero intervenire e si potrebbe modificare la superficie della membrana.

Molti materiali infatti sono fatti con polimeri che però da soli indurrebbero una reazione di questo tipo e sono quindi trattati in maniera artificiale con un rivestimento che esponga ioni per fare in modo che sia più idrofobico o idrofilico e se si riesce ad ottenere così ha le giuste caratteristiche meccaniche e si conferisce anche biocompatibilità. Tra questi esempi ci sono le lenti a contatto in silicone (permeabili all’ossigeno), devono essere a contatto con l’ossigeno, e se rivestito con un materiale artificiale allora era più biocompatibile perché da solo il silicone crea danni il fattore H blocca questa reazione.

Sistema del complemento è molto legato alla coagulazione. Attivato il complemento superficialmente, si attiva anche il 12esimo fattore, da lì con tutta la cascata si crea trombina che ha due effetti:

• Attivazione della piastrina
• Complemento agisce anche lui sul complemento.

Dobbiamo fare in modo che i materiali agiscano con le proteine (monomero con il materiale). Per vedere se un materiale è adatto oppure no si cerca di migliorarli sempre per avere risultati adeguati. Devo studiare l’alterazione del materiale con queste molecole. Se il materiale ha affinità per l’albumina, arriva meno fibrinogeno (competizione) e si riesce ad essere più biocompatibile, l’albumina è carica negativamente e non fa aderire le piastrine quindi è una situazione da favorire. Ma bisogna capire quando il materiale è in contatto con altre cellule devo studiare cosa succede ai materiali in contatto con le proteine, cosa succede ai fattori della coagulazione, e cosa succede tra interazione con piastrine e sistema del complemento.