Appunti Microbiologia e domande

Microbiologia

La microbiologia studia i microrganismi. I batteri, nonostante abbiano alcune caratteristiche comuni, presentano delle differenze:

• Nella morfologia e struttura;
• Caratteristiche biochimiche (esigenze metaboliche);
• Patogenicità;

La parete dei batteri è una parete di peptidoglicano. Esistono due tipi di batteri con due pareti differenti:

• Gram+: hanno una parete più spessa;
• Gram-: hanno una parete più sottile ma più complessa, all'esterno di questa parete si trova inoltre una membrana ricca di porine;

Colorazione di Gram

Gram è il nome di uno scienziato che nel 1800 ha studiato i batteri e ha messo a punto una colorazione in base alla quale, i batteri Gram+ si colorano di blu e i batteri Gram- si colorano di rosso. Queste differenze di colorazione dipendono da questa diversa struttura delle cellule e della parete. Ci sono dei batteri che non hanno la parete, i micoplasmi, sono anch'essi batteri ubiquitari e alcuni di questi possono essere responsabili di patologie molto gravi nell'uomo come polmoniti, infezioni dell'apparato oculare e infezioni dell'apparato uro-genitale. Inoltre, anche alcuni archeobatteri non hanno la parete e hanno una membrana che conferisce determinate caratteristiche.

Parete cellulare dei batteri

La parete serve per proteggere dalla lisi osmotica e da sostanze tossiche, come ad esempio da alcuni antibiotici. La parete di peptidoglicano nei Gram+ ha all'interno la membrana cellulare che è un doppio strato fosfolipidico come le membrane delle cellule eucariotiche, all'interno della quale sono inserite delle proteine, che sono proteine transmembrana oppure proteine citoplasmatiche che servono per trasferire il segnale o varie altre funzioni della cellula. La parete di peptidoglicano è composta da queste sub-unità che sono legate tutte tra di loro, come tanti mattoncini legati tra di loro a formare la parete in più strati.

Nei Gram+, oltre al peptidoglicano ci sono delle altre molecole che sono gli acidi teicolici o lipoteicolici che hanno una funzione di recezione e sono molto importanti anche per la struttura della parete di questi batteri. Nei Gram- all'esterno della parete esiste una seconda membrana formata da proteine che possono essere associate a formare dei canali che regolano l'ingresso o la fuoriuscita di sostanze e che prendono il nome di porine. Inoltre la membrana esterna contiene due foglietti, il lato esterno è diverso da quello interno; nel lato esterno questi lipidi sono costituiti da una molecola, lipopolisaccaride (LPS), che ha una componente lipidica e associata a queste lunghe catene di polisaccaridi complessi.

L'endotossina che si trova nella parete dei Gram- se viene rilasciata dai batteri ha un'attività tossica sull'ospite. Lo spazio che esiste tra la parete di peptidoglicano e la membrana esterna e interna si chiama spazio periplastico, che contiene molte proteine, enzimi che intervengono negli scambi con l'esterno, e varie funzioni per la cellula batterica. Un'altra eccezione sono i micobatteri che hanno la parete di peptidoglicano ma esternamente alla parete hanno una membrana molto ricca in glicolipidi, abbiamo tantissime specie di questi batteri, uno molto conosciuto è il micobatterio della tubercolosi, l'agente eziologico della tubercolosi appartiene a questa famiglia di micobatteri che sono alcohol/acido resistenti perché hanno delle caratteristiche tintoriali particolari, grazie al fatto che hanno questa parete così spessa.

Peptidoglicano

Il peptidoglicano è costituito da una molecola che si chiama NAG, N-acetilglucosammina, e da una molecola NAM, N-acetilmuramico. Queste due molecole sono legate tra di loro da un legame β(1,4), costituiscono il mattoncino del peptidoglicano. Alla molecola di NAM è legata una corta sequenza peptidica di 4 amminoacidi. Quindi il mattoncino è costituito da NAM, NAG e una catena peptidica. La catena peptidica serve per tenere assieme le fine di peptidoglicano, si instaurano dei legami peptidici tra il peptide di un mattoncino e il peptide di un altro mattoncino di una fila parallela. Mentre i legami tra gli zuccheri nel peptidoglicano sono legami glucosidici, si chiamano legami crociati.

Il lisozima è una proteina che ha un'attività enzimatica che abbiamo nella saliva ed è presente anche in altri fluidi biologici; questo enzima taglia i legami glucosidici, quindi è un meccanismo di difesa aspecifica perché il lisozima può tagliare il legame β(1,4) tra i vari mattoncini in qualunque tipo di batterio. Nei laboratori di biologia molecolare vengono usati molti lisozima per distruggere le cellule batteriche ed estrarre il DNA.

La penicillina

La penicillina, il primo antibiotico che è stato scoperto, agisce sulla sintesi della parete di peptidoglicano e in particolare interferisce con l'attività degli enzimi che formano il legame peptidico tra una catena ed un'altra. Questo a dimostrazione che una cellula batterica, sottoposta a trattamento con penicillina, quest'ultima interferisce con la sintesi della parete, quindi la cellula batterica si rompe e fuoriesce il citoplasma. La cellula batterica non essendo più protetta dalla parete di peptidoglicano e dalla pressione osmotica, l'acqua può entrare e la cellula si lisa, scoppia e muore.

Eccezione: i micoplasmi

I micoplasmi hanno una membrana ricca di steroli, molto simile a quella delle cellule eucariotiche e sono ovviamente resistenti alle penicilline e a tutti i farmaci penicillina derivati perché non avendo la parete non c'è un bersaglio (target) del farmaco.

Il citoplasma delle cellule batteriche contiene prevalentemente acqua, come il citoplasma delle cellule eucariotiche, proteine, carboidrati, lipidi, sostanze inorganiche. Il cromosoma batterico generalmente è un'unica molecola circolare a doppia elica, in alcuni batteri può anche essere lineare; le molecole extracromosomiche, i plasmidi, sono molecole di DNA circolare a doppia elica e delle volte anche lineare, sono molto più piccole del DNA cromosomico. Mentre il DNA cromosomico contiene tutte le informazioni che sono necessarie alla cellula per dividersi, sintetizzare le membrane, la parete ecc., i plasmidi di solito contengono delle informazioni aggiuntive, ad esempio, i geni di resistenza agli antibiotici, geni che codificano proteine che danno dei vantaggi metabolici alla cellula batterica nell'ambiente in cui si viene a trovare, geni che producono delle tossine.

Quindi i batteri che sono patogeni hanno delle informazioni genetiche in più rispetto ai batteri non patogeni. Esempio: Nel nostro intestino alberghiamo dei miliardi di cellule di Escherichia coli, questi batteri nell'intestino ci fanno del bene e sono stazionari senza creare danni. Esistono, però, dei batteri Escherichia coli che sono patogeni, se le ingeriamo con dell'acqua o nel cibo contaminato soffriamo di dissenteria nel migliore dei casi, oppure ci possono essere delle malattie invasive generalizzate. Gli Escherichia coli patogeni normalmente noi non li alberghiamo ma li possiamo acquisire, essi hanno delle informazioni genetiche in più rispetto agli Escherichia coli che di solito abbiamo nella pancia che sono contenute nei plasmidi e geni che codificano per esempio per delle tossine, dei fattori di virulenza che consentono a questi patogeni di dare la sintomatologia che poi ne consegue dopo l'infezione. Inoltre, questi plasmidi non fanno il processo di meiosi, però possono scambiarsi materiale genetico attraverso vari meccanismi, quindi possono diffondere la resistenza agli antibiotici, la resistenza ai disinfettanti, i geni che contengono e codificano informazioni specifiche.

Nel citoplasma ci sono i ribosomi che sono 70S, ci possono essere sostanze di riserva come le inclusioni, ci possono essere dei filamenti proteici che ricordano il citoscheletro della cellula eucariotica che sono importanti per l'allungamento della cellula dopo che si è appena generata dalla divisione cellulare, oppure possono essere importanti per stabilire il punto centrale della cellula in cui deve avvenire la divisione. I ribosomi hanno due sub-unità, 50S e 30S. I geni ribosomiali che codificano l'RNA ribosomiale di solito sono molto conservati nei batteri della stessa specie quindi attraverso delle metodiche della biologia molecolare che ci permettono di sequenziare questi geni, il rRNA viene utilizzato per classificare i microrganismi e per creare scale filogenetiche, anche nella diagnostica di routine si ricerca il rRNA.

Le inclusioni citoplasmatiche possono esserci degli accumuli di varie sostanze che possono essere utili per la cellula, come il fosforo, il glutammonio; i batteri che vivono nell'acqua hanno delle vescicole gassose che servono per i galleggiamenti, per stare in superficie. Alcuni batteri hanno delle vescicole in grado di fissare l'anidride carbonica, altri batteri che fanno la fotosintesi hanno dei cloroplasti, altri batteri hanno i magnetosomi che sono degli accumuli di ferro che consentono ai batteri di muoversi nell'acqua in funzione del magnetismo dell'ambiente.

Divisione cellulare e crescita

La divisione delle cellule procariotiche avviene per un processo di scissione binaria che può ricordare la mitosi, quindi la cellula riceve un segnale dall'esterno che indica che vive in un ambiente che è favorevole alla sua crescita, segnale ricevuto dai recettori superficiali che sono in grado di percepire l'ambiente. Quindi se le condizioni di nutrimento, pH, temperatura ecc. sono favorevoli alla crescita microbica, le cellule si dividono; inizialmente, si ha la duplicazione del DNA a partire dall'origine di replicazione e successivamente, la membrana cellulare e la parete si invaginano, le due molecole di DNA che si sono generate si spostano nei poli della cellula e si ha la divisione cellulare. Anche i batteri possono avere delle mutazioni genetiche come tutte le cellule, possono avvenire per mutazione spontanee, sostituzione, durante la duplicazione del genoma, di una base per un'altra; oppure, meccanismi di combinazione genetica e di scambio di materiale genetico tra una cellula e un'altra.

I batteri come tutte le cellule viventi hanno bisogno di macronutrienti (elementi essenziali: carbonio, azoto, zolfo, ossigeno, fosforo, idrogeno) e di micronutrienti (ioni metallici importanti per l'attività degli enzimi e delle funzionalità cellulari). I parametri ambientali che condizionano la crescita dei microrganismi:

• Acqua: alcuni batteri hanno necessità di un maggiore contenuto di acqua rispetto ad altri nel micro-ambiente in cui si trovano. Questo parametro viene indicato con aw (w sta per water) ed è il rapporto tra la tensione di vapore dell'acqua libera, rispetto alla tensione di vapore dell'acqua evaporata. I batteri hanno valori di crescita ottimali differenti, ci sono batteri che possono crescere nell'acqua pura, mentre ci sono altri microrganismi che crescono in ambienti in cui questo valore aw è decisamente inferiore.
• Pressione osmotica (concentrazione salina): a seconda della concentrazione di cloruro di sodio nell'ambiente, i batteri sono suddivisi in diverse categorie:
  • Non alofili: batteri che hanno una crescita ottimale a concentrazioni saline molto basse quasi nulle;
  • Alotolleranti: batteri che hanno una crescita ottimale sempre a concentrazioni saline basse, ma leggermente alte rispetto ai non alofili;
  • Alofili: batteri che a concentrazioni saline basse non crescono, la loro capacità di crescita aumenta aumentando la concentrazione salina fino a valori intorno a 2 M;
  • Alofili estremi: hanno bisogno di concentrazione salina molto alta (3 / 4 M);
• Ossigeno: può favorire o inibire la crescita dei batteri:
  • Aerobi obbligati: batteri che crescono solo in presenza di ossigeno;
  • Anaerobi obbligati: muoiono in presenza di ossigeno, es. i clostridi o i tetani;
  • Aerobi-anaerobi facoltativi: batteri che hanno delle forme intermedie di metabolismo, possono essere aerobi o anaerobi facoltativi, significa che se c'è ossigeno crescono come degli aerobi, ma anche in assenza di ossigeno crescono come gli anaerobi;
  • Microaerofili: batteri che possono tollerare l'ossigeno a concentrazioni più basse rispetto agli aerobi obbligati;
  • Capnofili: batteri che possono tollerare le concentrazioni basse di ossigeno e almeno il 5% di anidride carbonica;

I batteri aerobi, quelli che possono crescere in presenza di ossigeno, sono batteri che producono degli enzimi che inattivano le forme tossiche dell'ossigeno che si vengono a produrre durante il metabolismo aerobio, la glicolisi, il ciclo di Krebs, la fosforilazione ossidativa. Quest'ultimi sono meccanismi che hanno come accettore finale l'ossigeno. I batteri anaerobi non producono questi enzimi quindi non sono in grado di tollerare l'ossigeno perché in presenza di ossigeno accumulano le forme tossiche che portano alla morte della cellula.

• pH (concentrazione di ioni idrogeno): a seconda della concentrazione di ioni idrogeno e quindi del pH, i batteri si distinguono in:
  • Acidofili: batteri che crescono a valori di pH inferiore al 5.5;
  • Neutrofili: batteri che crescono a valori di pH compresi tra 5.5 e 7.9;
  • Basofili: batteri che crescono a valori di pH superiore a 7;
• Temperatura:
  • Psicrofili estremi: tra -2 a -10 gradi;
  • Psicrofili: temperature ottimali basse;
  • Mesofili: temperature ottimali intermedie;
  • Termofili: temperature ottimali alte (40-65 gradi);
  • Termofili estremi: tra i 70 e i 110 gradi;

Come crescono i batteri quando hanno le condizioni adeguate per la crescita? Da una cellula se ne generano due, quindi la velocità di crescita è definita come il numero di generazioni in un determinato tempo (1/10 ore). Il tempo di generazione è il tempo necessario ad una cellula per produrne due, ogni cellula ha tempi diversi per dividersi; ci sono dei batteri, come Escherichia Coli o Staphylococcus aureus, che ci mettono dai 20 ai 30 minuti per dividersi; altri batteri come il micobatterio della tubercolosi ha bisogno di 18 ore per dividersi. Il numero finale di cellule che noi abbiamo in un determinato tempo dipende dal tempo di generazione di quella specie batterica e viene calcolato come N0 numero iniziale di cellule per 2ⁿ dove n è il numero di generazioni. Ovviamente la velocità di crescita sarà ottimale quando tutte quelle condizioni di pH, ossigeno, temperatura ecc. saranno ottimali.

I primi terreni di coltura che sono stati sviluppati nel 1800 liquidi erano fatti da estratti di dado, se prepariamo del brodo sterile, ci inoculiamo dentro dentro dei batteri, ogni 30 minuti andiamo a prelevare un'aliquota di quel brodo e andiamo a contare quanti batteri si sono generati durante quel periodo di tempo, otteniamo una crescita batterica rappresentata con una curva; all'inizio il numero di batteri rimane uguale a quelli inoculati, dopo improvvisamente il numero di batteri comincia a crescere rapidamente in maniera esponenziale; alla fine i batteri non crescono più e rimangono lo stesso numero per un po' di tempo e poi tendono a calare. La fase iniziale si chiama fase di Lag, è una fase in cui i batteri inoculati si adattano al luogo abbiente. La fase esponenziale è la fase in cui dopo l'adattamento i batteri si moltiplicano in maniera esponenziale. In questa fase i batteri possono produrre anche delle sostanze tossiche che possono cambiare il pH del terreno, ad esempio, e i nutrienti scarseggiano. La fase stazionaria è la fase in cui le condizioni ottimali per potersi dividere scarseggiano e si arrestano.

Appendici batteriche

Le appendici batteriche sono costituite da flagelli lunghi e da strutture più sottili chiamate pili. I flagelli possono essere presenti sia nei batteri Gram positivi che in quelli Gram negativi, sono costituiti da una proteina che si chiama flagellina e possono essere in numero variabile nella cellula poiché ve ne può essere uno, due o molti. Sono inoltre ancorati alla cellula da un corpo basale e servono per il movimento in funzione di vari nutrienti, del pH, della temperatura. I flagelli possono essere di numero variabile, quando sono in numero unico si chiamano monotrichi, se sono due/tre ad un polo della cellula sono definiti lofotrichi e quando sono due/tre ad entrambi i poli della cellula sono definiti anfitrichi e se invece sono distribuiti su tutta la superficie della cellula sono definiti peritrichi. Le cellule possono essere colorate con colorazioni specifiche per il flagello, il quale inoltre risulta essere ancorato alla membrana cellulare attraverso un anello multiproteico che ha una componente transmembrana e una componente intracitoplasmatica che è quella che poi regola il movimento.