Appunti di Fisiologia vegetale

Fisiologia vegetale - 9 CFU

Prof.ssa De Lorenzo e Pontiggia

Appelli: Esame: 3 prove in itinere, quiz a risposta multipla oppure orale classico.

Testi: TAIZ, E. ZIEGER: “Fisiologia vegetale”, Quarta edizione Italiana 2012 (PICCIN).

Esercitazioni

• Estrazione parete cellulare e quantificazione glucosio mediante dosaggio colorimetrico enzimatico GOPOD.
• Quantificazione glucosio attraverso i dati ottenuti mediante dosaggio GOPOD.

Programma

L'insegnamento prevede 76 ore di didattica frontale, suddivise in lezioni teoriche e lezioni metodologiche:

Lezioni teoriche (64 ore)

Concetti introduttivi (ore 8)

• Peculiarità metaboliche e funzionali della cellula vegetale: reticolo endoplasmatico, vacuolo, perossisomi, gliossisomi, corpi proteici, oleosomi, plastidi. La parete cellulare vegetale: composizione, architettura e biosintesi. Basi molecolari della funzione dei plasmodesmi.

Bilancio idrico, trasporto dei soluti (ore 6)

• Potenziale elettrochimico e potenziale idrico. Componenti del potenziale idrico.
• Il movimento dell'acqua nella pianta. Trasporto a lunga distanza. Pressione radicale, modello della coesione-tensione. Continuum suolo-pianta-atmosfera. Trasporto dell’acqua dal suolo alla radice. Struttura dello xilema. Trasporto dell’acqua alle foglie. Traspirazione e sua regolazione. Gli stomi: struttura e meccanismi di controllo dell’apertura e chiusura.

Assimilazione dei nutrienti (ore 8)

• Pompe ioniche. Significato fisiologico del potenziale elettrico di membrana. Nutrizione minerale delle piante. Piante e funghi simbionti: le micorrize. Metabolismo dell'azoto. Fissazione dell'azoto. Simbiosi leguminose-rhizobium. Assimilazione dell’azoto.

Fotosintesi (12 ore)

• Fotosintesi. I pigmenti fotosintetici. Organizzazione spaziale e funzione dei fotosistemi. Trasporto non-ciclico di elettroni, accettori e donatori di elettroni. Trasporto di protoni e fotofosforilazione. Trasporto ciclico e pseudociclico. Spillover. Ciclo di Calvin e sua regolazione. Fotorespirazione. Sistemi per concentrare la CO₂: Piante C4. Metabolismo acido delle crassulacee. Biosintesi del saccarosio e dell'amido e meccanismi fisiologici di regolazione.

Traslocazione nel floema e catabolismo (8 ore)

• La traslocazione nel floema. Modello del flusso da pressione. Caratteristiche della traslocazione floematica: relazione sorgente-pozzo. Caricamento e scaricamento del floema. Ripartizione degli assimilati. Catabolismo-Pentoso Fosfati Gluconeogenesi.

Fotorecettori (6 ore)

• Fotomorfogenesi. Fotorecettori della luce rossa e blu: Fitocromo, crittocromi e fototropine. Risposte alla luce rossa e blu. Trasduzione del segnale luminoso.

Ormoni vegetali (12 ore)

• Gli ormoni vegetali. Auxine. Citochinine. Gibberelline. Acido abscissico. Etilene e frutto. Percezione e trasduzione del segnale ormonale.

Seme e fioritura (4 ore)

• Fisiologia del seme e. Ciclo del gliossilato. Cenni su fotoperiodismo e fioritura.

Lezioni metodologiche (12 ore)

• Lezione metodologica 1: Trasformazione genetica delle piante applicata agli studi di fisiologia vegetale.
• Lezione metodologica 2: Metodi di studio per l’identificazione dell’interazione proteina-proteina.
• Lezione metodologica 3: Metodi di studio della parete cellulare e isolamento protoplasti.
• Lezione metodologica 4: Saggi biologici e applicazione commerciale degli ormoni vegetali.

Introduzione alle piante

Le piante sono organismi pluricellulari fotosintetici costituiti da cellule eucariotiche vacuolate e con pareti cellulosiche.

Caratteristiche delle piante

• Autotrofia (fotosintesi): produttori primari del pianeta in quanto utilizzano l’energia del sole per convertirla in energia chimica.
• Vita sedentaria: le piante hanno una capacità elevatissima di rispondere agli stimoli. Alla percezione di un segnale deve corrispondere una adeguata risposta fisiologica che sia funzionale al corretto sviluppo della pianta.
• Trasporto per l’acqua e nutrienti: xilema, floema.

Crescita e struttura

• Crescita indeterminata: dopo l'embriogenesi grazie all’azione dei meristemi (cellule indifferenziate che conservano la capacità di dividersi e differenziarsi).
• Parete cellulare: compartimento dinamico e regolatorio fondamentale per il funzionamento della cellula vegetale (sostegno meccanico e impermeabilità).

Differenza tra parassiti e patogeni

Un patogeno è anche un parassita ma un parassita non è per forza un patogeno, in quanto un patogeno ha armi aggiuntive rispetto al parassita.

Organismi modello per lo studio della fisiologia vegetale

Le piante modello sono varie in quanto hanno caratteristiche diverse e quindi in base a ciò che si vuole studiare si può usare un organismo diverso.

Struttura della cellula vegetale

Una caratteristica peculiare della cellula vegetale è la parete cellulare, che dà sostegno alla cellula. La zona di contatto tra le pareti di due cellule adiacenti è detta lamella mediana. All'interno ci sono altre strutture peculiari che sono i cloroplasti, gli organelli deputati alla fotosintesi e che sono unici delle cellule vegetali.

Dimensioni delle cellule vegetali

Le dimensioni delle cellule vegetali possono essere molto diverse e la loro dimensione dipende dal tipo di parete cellulare. Possiamo trovare cellule vegetali in un range compreso tra 25 µm e 300 µm.

Frazionamento cellulare

Per studiare le cellule vegetali una metodologia importante è il frazionamento sia cellulare, sia subcellulare.

• Distinzione del tessuto: digestione enzimatica, frullatore o mortaio e pestello; operazione che devono essere delicate perché altrimenti si rompe tutto.
• Centrifugazione differenziale: le caratteristiche degli organelli sono diverse e queste possono essere sfruttate per separare il composto che si è formato.
• Centrifugazione su gradiente di densità o isopicnica: alcuni organelli non si separano per dimensione ma grazie a densità diverse.

Quando si rompe la parete cellulare e le membrane, le sostanze all'interno della cellula tendono a riunirsi formando dei microsomi. Per capire quei microcosmi da quale compartimento provengono si utilizzano i marcatori, specifici per ogni organello. Generalmente un marcatore è una proteina o un enzima.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica o plasmalemma permette alle cellule di assorbire e trattenere o escludere sostanze. Le membrane sono formate da un doppio strato fosfolipidico in cui sono incluse proteine.

Reticolo endoplasmatico

Il reticolo endoplasmatico (RE) è una rete di tubuli e cisterne fondamentali per tutte le proteine che devono essere secrete ed è suddiviso in RER (con i ribosomi) e REL. Nel RER le proteine che devono essere secrete sono caratterizzate da una sequenza N-terminale (peptide segnale). Questa è una sequenza da 20 a 35 a.a. che serve per l’ingresso nel reticolo. Se non ci sono altri segnali la proteina viene secreta, se ce ne sono altri la proteina va in altri compartimenti.

Struttura e funzioni dell'apparato di Golgi

Le cellule vegetali hanno un Golgi più operoso rispetto alle cellule animali, perché è coinvolto nella biosintesi della parete cellulare. La struttura è formata da cisterne appiattite, dalle quali escono ed entrano vescicole.

• Ci sono le cisterne interne o cis, più vicine al reticolo da cui ricevono vescicole.
• Poi ci sono le cisterne mediane che ricevono vescicole dal compartimento cis e mandano vescicole alle cisterne trans, le più distali rispetto al reticolo.

Ogni cisterna fa delle operazioni: dalle trans le vescicole possono andare direttamente alla membrana oppure ad altre strutture, come i lisosomi.

Funzioni del Golgi

• Biosintesi dei polisaccaridi complessi della superficie cellulare. La parete è fatta da pectine, emicellulose, la fase amorfa della parete, e dalla cellulosa.
• Processamento e modificazione di glicoproteine destinate alla superficie cellulare e vacuoli.
• Accetta e modifica membrane dal Reticolo Endoplasmatico e Plasmalemma per endocitosi.

Plasmodesmi

I plasmodesmi sono come dei tunnel strutturali che mettono in comunicazione il citoplasma di due cellule adiacenti. Questi canali sono circondati da plasmalemma e all’interno è presente il desmotubulo, che origina dal RE ed è in continuità tra il RE delle due cellule adiacenti.

Tra le cellule si possono avere anche più plasmodesmi, e in particolare la quantità dipende dagli scambi metabolici tra le cellule in considerazione. Lo spazio che si crea tra la membrana e il desmotubulo lascia passare solo molecole con dimensioni tra 800 e 1000 nm, ma si è scoperto che alcuni virus, di dimensioni maggiori, producono una proteina (proteina di movimento) che fa allargare le dimensioni del plasmodesma.

Riguardo l’origine la maggior parte dei plasmodesmi si forma durante la citodieresi, ma alcuni possono formarsi anche dopo.

I plasmodesmi fanno sì che nella pianta si possano determinare due compartimenti principali: simplasto: il compartimento all'interno della cellula, ovvero il citoplasma in continuità tra una cellula e l’altra. apoplasto: compartimento al di fuori della membrana plasmatica, ovvero il sistema continuo di pareti.

Parete cellulare

La parete cellulare è una struttura che circonda il protoplasto esternamente alla membrana plasmatica ed è composta principalmente da polisaccaridi, proteine e composti fenolici.

• Spessore da 0,1 µm a 100 µm.

Funzioni della parete cellulare

• Agisce da esoscheletro e mantiene e determina la forma e la grandezza della cellula; infatti, digerendo la parete tramite enzimi litici la cellula vegetale assume una forma tondeggiante.
• Fornisce supporto e resistenza meccanica.
• Permette la creazione della pressione di turgore (circa 0.2 MPa) insieme al vacuolo.
• Il vacuolo insieme alla parete determina la rigidità della cellula vegetale.
• In ambiente ipotonico la pressione dell’acqua nel vacuolo viene controbilanciata dalla rigidità della parete cellulare che determina la pressione (pressione di turgore).

Questa pressione è responsabile della rigidità di tessuti non lignificati (es. foglie, giovani fusti). Se invece l’ambiente è ipertonico, avviene il fenomeno inverso: il vacuolo perde acqua, quindi si contrae e di conseguenza la riduzione del volume di tutto il protoplasto porta al distacco della membrana plasmatica dalla parete cellulare (plasmolisi).

Questo è il motivo per cui tessuti non lignificati, quando la pressione di turgore diminuisce, avvizziscono. La plasmolisi generalmente causa prima la perdita di turgore e poi, se prolungata nel tempo, la morte della cellula.

• È responsabile dell’architettura della pianta.
• Ha un ruolo metabolico (enzimi).
• Barriera fisica per patogeni.
• Ruolo nella segnalazione (oligosaccarine).
• Permeabilità all’acqua e ai soluti (apoplasto).

Anatomia della parete cellulare

La parete cellulare viene depositata a strati a livello della membrana plasmatica, per cui gli strati depositati per prima, sono quelli più distali dalla cellula. Mentre gli strati che vengono depositati per ultimi sono quelli più prossimali alla cellula. Dall’esterno verso l'interno troviamo:

• Lamella mediana: è lo strato in continuità tra due cellule adiacenti, composta principalmente da pectine e ha uno spessore di circa 30 nm.
• Parete primaria: ha una struttura chimica molto più complessa rispetto alla lamella mediana (sostanze pectiche 35%, emicellulose 25%, cellulosa 25%, proteine 1-8%) ed è molto idratata. Ha uno spessore di circa 0,1-1 µm.
• Parete secondaria: è tipica delle sole cellule che hanno completato il differenziamento e può contenere cellulosa, lignina, suberina, cutina e cere.

Composizione della parete cellulare

• Fase microfibrillare: cellulosa.
• Fase matriciale: polisaccaridi, proteine, composti fenolici, lignina, acqua.

Zuccheri all’interno della parete cellulare

Cellulosa

• Polisaccaride formato da catene lineari di β-D-glucosio uniti con legami 1-4.
• Legami H tra 20-40 catene.
• L’unità strutturale della cellulosa è detta cellobiosio.
• Le microfibrille della cellulosa sono composte da regioni cristalline, che escludono l’acqua e regioni amorfe, più sensibili all’azione di cellulasi.

Emicellulosa

• Legano tra loro le diverse microfibrille di cellulosa.
• Sono polisaccaridi di matrice non carichi che si legano alla cellulosa tramite legami H sulle microfibrille neosintetizzate rendendole meno cristalline.
• Sono molecole ramificate (xiloglucano, xilani, glucomannani).

Pectine

• Le pectine formano gel idratati.
• Sono composte da zuccheri acidi o neutri.
• Rendono carica la superficie della parete per l’adesione e il riconoscimento cellulare.
• Sono i polisaccaridi di parete più solubili.
• Sono molecole ramificate (omogalattorunano, ramnogalatturonano I e II, arabinani, arabinogalattano I).

Proteine di parete

Nella parete primaria l’8-10% è costituito da proteine, con diverse funzioni: strutturali, enzimatiche, di segnalazione.

Proteine strutturali

Queste portano a un irrigidimento della parete perché consentono la creazione di legami intramolecolari che intrappolano le pectine. Questo tipo di proteine sono costituite da unità ripetute, ma alcune proteine potrebbero avere anche altre funzioni.

• Tra le glicoproteine ricche di idrossiprolina troviamo le estensine:
• Sono HRGP (proteine ricche in aminoacidi idrossiprolina).
• Sono coinvolte nell’autoassemblaggio della parete cellulare.
• Stabilizzano la parete formando legami covalenti tra residui di tirosina di molecole diverse.
• Gli zuccheri si legano a residui di serina e di idrossiprolina.

Le estensine appena secrete sono relativamente solubili e diventano sempre più insolubili durante la maturazione cellulare o a seguito di ferite e attacco dei patogeni. Si ritiene che il processo di insolubilizzazione sia dovuto a legami intermolecolari di difeniletere fra le tirosine. Questi legami vengono catalizzati da enzimi chiamati perossidasi, perché utilizzano come substrato il perossido di idrogeno (acqua ossigenata).

Proteine enzimatiche

• Enzimi ossidativi (perossidasi).
• Enzimi idrolitici per la degradazione dei legami dei polisaccaridi di parete (pectinasi, cellulasi, emicellulasi) sono utili durante i diversi processi di crescita e sviluppo della pianta.

Le pectinasi e le emicellulasi includono vari tipi di enzimi, in base a quale tipo di legame rompono; mentre le cellulasi devono rompere solo il legame 1-4. Tra le pectinasi importanti troviamo quelle che degradano l’omogalattorunano. Di questi enzimi ne esistono di due tipi: poligalatturonasi che tagliano i legami alfa 1-4 (esoenzimi ed endoenzimi), pectato liasi: non è una idrolasi, per cui non incorporano acqua. Enzimi per l’espansione cellulare (trans-glicosidasi) e altre proteine per l'espansione.

Tra queste troviamo le espansine, che riescono a rendere più espansa la parete a pH acido. Queste proteine rompono legami tra le componenti della parete su siti specifici strutturali.

Parete secondaria

La parete secondaria è composta da altri componenti, la maggior parte fenolici.

Lignina

• Polimero di composti fenolici, specialmente fenilpropanoidi (monolignoli).
• Quando si deposita la lignina, viene degradata la componente matriciale e la lignina si deposita lì dove c’era la componente matriciale.
• Rinforza e impermeabilizza la parete cellulare.
• Aumenta la resistenza all’attacco dei patogeni.
• La sintesi di lignina elimina H₂O dalla parete e forma una trama idrofobica che lega la cellulosa e previene l’espansione cellulare.

Una varietà di lipidi idrofobici (cutina, cere e suberine) sono associati alla parete per svolgere particolari funzioni come, ad esempio, ridurre le perdite di acqua (cuticola) e impedire l’ingresso di patogeni.

Cutina

• Acidi grassi idrossilati con lunghezza fino a 16.
• Alcani a catena lunga, esteri, acidi grassi.

Cere

• Suberina: acidi dicarbossilici.

All'interno del tessuto radicale, la suberina è la principale componente della "banda di Caspary", una banda continua di materiale ceroso idrofobo ed isolante posta all'interno delle cellule dell'endoderma radicale che impedisce il passaggio di acqua e dei soluti in essa disciolti nel cilindro centrale del tessuto vascolare attraverso lo spazio fra le pareti. Il sughero è un tessuto vegetale di rivestimento di origine secondaria, che riveste il fusto e le radici delle piante legnose nelle quali sostituisce l'epidermide (isolante e impermeabile). A maturità le cellule del sughero muoiono, il protoplasto degenera e viene sostituito da aria (diventando così anche un buon isolante termico). Le cellule del sughero possono apparire colorate (in giallo, bruno) a causa di tannini e/o resine presenti nel lume cellulare.

Sintesi della parete cellulare

Emicellulose e pectine vengono sintetizzate nel Golgi. Cellulosa viene sintetizzata nella parte esterna della membrana plasmatica. Nella maggior parte dei casi il mattone fondamentale per la sintesi dei componenti polisaccaridici della parete cellulare è l’NDP-zucchero, o zucchero attivato.