Appunti Fisiologia vegetale

Scienze biologiche, Unibo FM fisiologia vegetale bilancio idrico

Le cellule vegetali sono tipicamente circondate dalla parete cellulare esterna e questa ha delle caratteristiche e una resistenza che non troviamo nelle cellule animali. La membrana plasmatica internamente si trova a contatto con la parete; il protoplasto è tutto ciò che viene delimitato dalla membrana plasmatica. La lamella mediana è il punto in cui comincia l’accrescimento della parete. La membrana plasmatica contiene tutta una serie di proteine canali che catalizzano il trasporto di soluti altrimenti impermeabili. Le cellule vegetali a differenza di quelle animali hanno una concentrazione di soluti interna che è molto superiore alla concentrazione esterna, presente nell’apoplasto, cioè ciò che si trova all’esterno della membrana; simplasto è ciò che si trova all’interno. Nelle cellule di norma la membrana plasmatica è schiacciata contro la parete, non c’è spazio tra le due: l’apoplasto è rappresentato da una serie di minerali in soluzione.

Il fatto che la concentrazione interna sia maggiore di quella esterna, fa sì che ci sarà una naturale, energeticamente favorita, tendenza dell’acqua di muoversi dall’apoplasto al simplasto per ragioni osmotiche, essendo la membrana permeabile. Se l’acqua tende ad entrare, il protoplasto tenderà ad aumentare di volume. Esso può farlo ma in maniera limitata per via della presenza di una parete all’esterno, come una scatola, che ne limita l’aumento delle dimensioni.

Consideriamo quindi il protoplasto un palloncino gonfio schiacciato all’interno delle pareti della scatola. Quando si raggiunge un equilibrio tra flusso d’acqua e schiacciamento della parete, il protoplasto avrà trovato la condizione giusta per formare un tessuto vegetale. La pressione interna si chiama turgore; la sommatoria di tutte queste pressioni determina la posizione, per esempio, di una foglia o di una pianta erbacea. Se per esempio non annaffio una pianta, il turgore interno cala, i protoplasti non si schiacciano più contro la parete perché non hanno acqua da assorbire, e questo determina un afflosciamento della pianta.

Come fanno le cellule a mantenere la concentrazione interna maggiore di quella esterna? La pressione osmotica è una proprietà colligativa, ovvero non dipende dal tipo di soluto ma dalla sua concentrazione, dipende dalla concentrazione totale di tutti i soluti all’interno della cellula. La concentrazione totale interna in una cellula vegetale è 0,3 M mentre all’esterno la concentrazione è 0,1 M. Le cellule vegetali, iperosmotiche rispetto all’ambiente esterno, vivono in maniera stabile in ambiente isoosmotico.

Le piante vivono in condizione iperosmotiche rispetto all’esterno e sono limitate nell’espansione dalla parete.

La pianta modello per eccellenza in biologia vegetale è Arabidopsis thaliana. Ne conosciamo esattamente tutto il genoma, sequenziato negli anni 2000. In questi 20 anni nel genoma sono state individuate regioni promotrici, codificanti e terminatrici. Dei 26.500 geni che codificano per proteine, almeno 1800 codificano per proteine di trasporto, quelle responsabili della creazione e mantenimento della concentrazione interna.

Pompe protoniche

Le pompe ioniche sono proteine canale che catalizzano un trasporto attivo primario. Queste proteine hanno un sito di legame per dei nucleotidi trifosforilati, tipicamente ATP, e che quindi idrolizzando 1 o più molecole di ATP ricevono energia sufficiente per svolgere un lavoro, come trasportare ioni attraverso la membrana. Queste proteine catalizzano un trasporto contro gradiente: lo ione che viene spostato non seguirebbe questo percorso spontaneamente per via del gradiente, anzi, seguirebbe il percorso opposto.

Il sistema più semplice vede una proteina che prende uno ione, X, catalizza questo trasporto che altrimenti non avverrebbe, poiché avviene contro gradiente, consumando ATP, trasporto attivo primario. Se ci fosse un’altra proteina che trasporta un altro ione, invece che consumare ATP, sfrutta il gradiente favorevole di uno ione, X, per trasportare l’altro, Y, contro gradiente, trasporto attivo secondario.

Le pompe delle piante che consumano ATP sono prevalentemente pompe protoniche. Le piante non hanno le pompe Na⁺-K⁺: questa pompa, fondamentale nella cellula animale, è sostituita funzionalmente da una pompa protonica. Noi quindi parleremo semprissimo di pompe protoniche! La cellula vegetale crea quindi gradienti protonici e poi li sfrutta per trasportare altre sostanze.

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Nelle cellule vegetali ci sono 3 tipi di pompe protoniche fondamentali:

• ATPasi (PM) localizzata sulla membrana plasmatica; è di tipo P. Idrolizza ATP e catalizza un movimento di protoni dal simplasto all’apoplasto;
• ATPasi (TP) localizzata nel Golgi, nel tonoplasto, membrana del vacuolo, e altre membrane interne. Questa non ha nulla a che vedere con l’altra ATPasi, è di tipo V, somiglia a F0-F1 dei mitocondri;
• PPasi (TP) localizzata nel tonoplasto. La pirofosfatasi invece che utilizzare ATP utilizza PPi, viene idrolizzato a due Pi separati.

I protoni o vengono fatti uscire verso l’apoplasto, dalle pompe protoniche a livello della membrana, o vengono fatti entrare all’interno del vacuolo, pompe a livello del tonoplasto: il pH aumenta nel simplasto mentre cala nel vacuolo e nell’apoplasto, dove ho concentrazioni di H⁺ maggiori. M o 0,1 μM.

Essendoci un pH = 7 nel simplasto significa che la concentrazione dei protoni è pari a 10^-7 nell’apoplasto e nel vacuolo. Per ogni protone presente nel citoplasma, pH = 7.2, ci sono 100 H⁺, pH = 5.5: questo è il gradiente che viene creato e mantenuto dalle pompe.

ATPasi protonica della membrana plasmatica

L’ATPasi protonica della PM è formata da una sola subunità ed è di tipo P: l’ATP legando la proteina nel suo sito attivo fosforila il residuo di aspartato. Asp-P è l’intermedio nella quale la pompa permane per un certo periodo prima che il Pi sia poi trasferito. Le pompe protoniche dei cloroplasti e mitocondri funzionano in modo diverso. La proteina si trova quindi in due conformazioni: in una il sito è aperto verso il citoplasma, nell’altra verso l’apoplasto. Ciò che fa cambiare conformazione è l’idrolisi di ATP. Durante l’oscillazione conformazionale, gli H⁺ vengono trasferiti all’esterno.

La proteina è formata da quasi 1000 aa. Le pompe consumerebbero continuamente ATP citoplasmatico per trasportare H⁺ se non ci fosse una regolazione. Quali sono i sistemi di regolazione? Vi è una lunga catena al dominio C-t di 70 aa che può chiudersi sulla pompa, chiudendo quindi l’accesso al sito dell’ATP, o rimanere libera nel citoplasma. A seconda della conformazione di questo dominio di autoregolazione, la pompa funzionerà o meno. La pompa protonica, quando è in condizioni inattive, si trova nella conformazione a dimero: è inattiva perché il dominio C-t autoinibitorio si trova organizzato in modo tale da inibire il dominio della proteina di fianco, in pratica, il C-t di una subunità del dimero inibisce il sito di legame per l’ATP dell’altra subunità e viceversa, “autoinibizione incrociata” per capirci. Le chinasi vanno a fosforilare diverse proteine: la presenza di un fosfato fa sì che si cambi conformazione e la proteina si attivi. La treonina può essere fosforilata da una particolare chinasi. La fosforilazione non è però sufficiente ad attivare la proteina, deve intervenire anche una proteina che si chiama 14-3-3. Queste proteine hanno la capacità di legare i peptidi fosforilati: laddove intervengono fosforilazioni per modificare la conformazione delle proteine, intervengono anche proteine 14-3-3. Queste hanno 2 domini, sono dimeri, e presentano siti di legame specifici per i Pi-peptidi, in pratica, la proteina lega un Pi di una subunità di un dimero con un sito e un altro Pi di un’altra subunità di un altro dimero con l’altro sito di legame. Si crea in questo modo una conformazione nuova in cui coppie di dimeri sono legate da proteine 14-3-3 fino ad ottenere un esamero.

Quindi:

1. Dimero con inibizione del C-t;
2. Avviene fosforilazione a livello del C-t ad opera di chinasi;
3. L’estensione C-t assume una diversa posizione e la 14-3-3 lega i fosfati legati agli aa che costituiscono i C-t di diverse subunità;
4. Si forma un esamero, con 6 subunità tutte attive, una catena di dimeri tutti attivi.

Esistono dei patogeni come Fusicoccus amigdale, fungo, che attaccano una serie di piante, producono delle tossiche fortemente idrofile che entrano all’interno delle membrane. Il patogeno mette in crisi la pianta che non riesce, per esempio, a regolare alcune funzioni.

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Gradiente di concentrazione e potenziale di membrana

Quando il soluto movimentato da una pompa è carico, allora il suo gradiente non solo è un gradiente di concentrazione ma anche di carica. Ciò crea una condizione tale per cui nelle cellule vegetali il contenuto totale di cariche all’interno e all’esterno, rispetto alla membrana, è diverso: a ridosso della membrana, lo squilibrio di carica si concentra e otteniamo una prevalenza di carica (-) all’interno e (+) all’esterno. La cellula ha quindi un potenziale di membrana. Le cellule vegetali hanno un potenziale indicativo E_M di -120 mV negativo all’interno. Il potenziale si calcola facendo la differenza tra potenziale interno ed esterno. In una cellula vegetale, uno dei responsabili del potenziale è la pompa protonica: da una parte crea un gradiente di concentrazione, i protoni all’esterno sono 100 volte più concentrati che all’interno, e anche un gradiente di carica, all’esterno vi è una prevalenza di cariche positive.

Ci sono quindi due ragioni per cui i protoni tendono ad entrare all’interno della cellula:

1. Dal punto di vista del gradiente protonico, plasmalemma e tonoplasto delimitano due condizioni simmetriche, il pH è circa 5.2 da entrambe le parti mentre nel citoplasma è di 7.2;
2. Per quanto riguarda il potenziale di membrana, a livello del tonoplasto è -30 mV e a livello del plasmalemma è -150 mV.

A livello del vacuolo, si aprono le pompe per i protoni, che vanno all’interno, mentre il sodio viene trasportato verso il citoplasma, Na sposta cariche (+).

Una cellula fa meno fatica ad estrudere un protone nell’apoplasto o nel vacuolo? La pompa che porta il protone nell’apoplasto ha 2 problemi: il primo è che il gradiente di concentrazione è pari a 1:100 e il secondo è perché parto da un posto in cui la carica è negativa, all’interno, per portarlo all’esterno dove la carica è positiva. Per portare H⁺ nel vacuolo, il problema del gradiente persiste ma la differenza di carica è meno netta a livello del tonoplasto. Quindi, è più facile portare un H⁺ nel vacuolo.

Il potenziale elettrochimico di un soluto, Δμ misurato in kJ/mol, è un modo per rappresentare l’energia libera associata all’esistenza di un gradiente di concentrazione e di un campo elettrico. Il potenziale ci dice quindi quanta energia mi serve per compiere quel lavoro. Prendiamo in considerazione il caso del protone in ingresso, ΔμH⁺.

[ ] ≈ + + (−) + [ ] + -7 -5

Le concentrazioni citosoliche e apoplastiche di H⁺ sono rispettivamente 10^-7 M e 10^-5 M mentre il potenziale di membrana E_M è pari a -120 mV. Se avremo un valore negativo, l’energia sarà liberata nel corso del processo; se sarà positivo allora l’energia dovrà essere assorbita dal sistema perché la reazione avvenga.

10⁻⁷ 120 = 6 log + (− ) = − + −5 10 10 Δμ è quindi definito come l’energia libera per mole di una determinata specie chimica.

Consideriamo il principale catione della cellula vegetale: il K⁺. Ipotizziamo che nella cellula non ci sia potassio, condizione assurda; cosa succede in questo caso? Il potassio ha una sua tendenza spontanea ad entrare nella cellula? Sì! Questo dipende da due fattori: il primo è la concentrazione, all’esterno è sicuramente più alta rispetto che all’interno, dove abbiamo detto che è nulla, e il secondo è la distribuzione di carica, negativa all’interno. Questo trasporto spontaneo potrebbe essere catalizzato da un canale o da un trasportatore in simporto, che sfrutta il gradiente favorevole di una sostanza per far entrare uno ione senza dispendio di energia.

Se ci chiediamo quanto costa buttare fuori un H⁺ faremo...

[ ] (−) Δμ = 6 log + + + [ ] 10

È l’inverso rispetto alla situazione descritta prima, prima consideravamo l’energia che verrebbe rilasciata per far entrare un protone. Se la concentrazione apoplastica di H⁺ è 100 volte superiore a quella citosolica ed E_M è un valore positivo pari a + 120 mV, allora...

= + ( ) = +

La nostra proteina ATPasi ha circa un rendimento del 50%: consuma 50 di energia e fa un lavoro che ne produce 24. Anche la pompa presente sul vacuolo trasporta due protoni all’interno consumando 1 solo ATP. Quanto costa portare un protone all’interno del vacuolo? Le concentrazioni sono circa le stesse mentre il potenziale di membrana è 30 mV...

− = + ( ) = + −

Il potenziale di membrana rende meno arduo il trasporto di protoni. Il rendimento di questa ATPasi è invece del 60%.

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Potassio e concentrazione dei soluti

Ipotizziamo che il potassio possa andare all’equilibrio potendosi muovere liberamente attraverso la membrana fino a raggiungere una condizione di equilibrio elettrochimico di K⁺, condizione in cui non c’è più una tendenza netta del potassio né di entrare né di uscire. Se il potassio ha questa possibilità, quali saranno i rapporti tra interno ed esterno delle concentrazioni del potassio? Le due concentrazioni non saranno le stesse perché il polo negativo all’interno influisce sulla distribuzione di K⁺. Il potassio, essendo uno ione carico, sente il campo elettrico quindi consideriamo il potenziale elettrico pari a -12 kJ/mol, - perché il potassio entra. Ciò comporta che la concentrazione citosolica deve essere 100 volte superiore a quella apoplastica, questo perché bisogna azzerare il potenziale elettrico, quindi mettendo i valori nella formula bisogna ottenere 12 kJ/mol.

In pratica, essendoci il gradiente elettrico che è pari a -12 kJ/mol che agisce sul potassio, la distribuzione della sua concentrazione deve essere tale da, una volta calcolato il logaritmo e moltiplicato per 6, dare 12 kJ/mol. Per ottenere questo risultato, quindi, il potassio deve essere concentrato 100 volte di più all’interno.

Il potassio ha tipicamente una concentrazione apoplastica di 1 mM, quindi nel citoplasma sarà di 100 mM: questo costituisce il principale soluto della cellula vegetale. Se il potenziale di membrana aumenta di 60 mV, allora la concentrazione di potassio all’interno andrà ad aumentare. Ogni 60 mV la concentrazione di uno ione monovalente aumenta di 10 volte; per gli ioni bivalenti, invece, ogni 60 mV la concentrazione aumenta di 100 volte.

Quindi, aumentando il potenziale di membrana, aumenta la concentrazione di potassio all’interno e, di conseguenza, la concentrazione totale dei soluti, 0,3 M, all’interno della cellula. Il potassio entrando renderà il potenziale di membrana meno negativo perché il polo negativo si annulla. La pompa protonica, però, finché funziona, può bilanciare questo effetto: se K⁺ tende ad annullare il potenziale di membrana, la pompa di H⁺ tenderà a funzionare più velocemente per espellere protoni e mantenere il potenziale costante. A monte c’è quindi la pompa protonica che, decidendo di consumare più o meno ATP, può alzare, abbassare o mantenere il potenziale di membrana.

Sistema passivo: canali per il potassio + sistema attivo: pompe protoniche = risultante del trasporto generale.

Simporto del saccarosio e sodio

Esistono dei sistemi di simporto, per esempio, per il saccarosio. Questi trasportatori sfruttano il gradiente elettrochimico favorevole dei protoni per trasportare all’interno il saccarosio. Queste proteine oscillano tra due conformazioni. Il gradiente elettrochimico del saccarosio è facile perché è una molecola neutra: non sente il campo elettrico. Se voglio concentrare il saccarosio 1:10 all’interno della cellula considero quindi solo le concentrazioni interne ed esterne. Parto che dentro e fuori siamo in equilibrio: accendo il sistema di trasporto e i protoni entreranno easy per il potenziale favorevole. Per ogni saccarosio trasportata all’interno 1:10 consumerò 6 kJ/mol; se trasporto altro saccarosio per arrivare ad una concentrazione 1:100 allora avrò consumato 12 kJ/mol, svolgo l’equazione del gradiente elettrochimico di prima ma contando solo le concentrazioni. Tutto l’ATP prodotto verrà poi usato per compiere diversi lavori.

Le piante non amano il sodio quindi tendono a buttarlo fuori. Non hanno una pompa sodio-potassio ma sfrut