Appunti di Biochimica applicata - laboratori

Dosaggio del glucosio nel siero tramite un saggio end-point enzimatico accoppiato

Nella reazione primaria, il glucosio è presente nel siero. Dobbiamo monitorare l'aumento di assorbanza a 340 nm (spettro UV) dovuto alla produzione di NADPH. Dovremo preparare alcuni reagenti, mentre altri sono già pronti ed aliquotati.

Preparazione del tampone

Prepariamo un tampone poiché le reazioni devono avvenire ad un pH di 7.5. Dobbiamo preparare il TRIS, una base, e calcolare quanti grammi mettere in una soluzione 1 molare da 100 mL. Bisognerà portare la soluzione a pH 7.5 aggiungendo acido cloridrico. Bisogna calibrare il pHmetro nel range di pH desiderato utilizzando delle soluzioni campione.

NB: Non bisogna sciogliere subito il Tris-HCl nella soluzione. La quantità di polvere va sciolta in 70 mL, aggiungiamo l'acido cloridrico e poi alla fine aggiungiamo acqua per portare a volume.

Preparazione della soluzione di glucosio

Poi prepariamo una soluzione di glucosio concentrata per 3 soluzioni che servono per la retta di taratura finale. Allestiremo 5 provette, ognuna delle quali conterrà 2 mL di mix di reazione. Prepariamo subito i 10 mL, che poi separiamo nelle 5 provette. Si aggiungeranno poi 20 microlitri di altre sostanze.

Dopo 10 minuti di incubazione si va a misurare l'assorbanza, che dovrebbe aumentare di 0.4 circa. Se dopo 10 minuti non continua ad aumentare, vuol dire che tutto il glucosio è stato fosforilato.

Dosaggio della creatin chinasi tramite un saggio enzimatico end-point accoppiato

In questo caso misuriamo l'attività dell'enzima, non la quantità di sostanza presente nel siero. Il saggio è lo stesso, ma le misurazioni vanno fatte con tempistiche molto precise, dopo 5 e 10 minuti. In questo caso si preparano 5 mL di mix di reazione.

Laboratorio 2: analisi dell'attività della lattico deidrogenasi su gel di agarosio

Lab 3: valutazione del potere antiossidante degli alimenti

Lab 4: purificazione proteine

Giovedì 28 aprile 2022
08:35