Appunti di Analisi biochimico - cliniche

Biochimica clinica

Introduzione

L’analisi biochimico-clinica prevede lo studio dei metodi, dei campioni e l’utilizzo del dato del laboratorio. Si occupa di fare indagini bioumorali cioè prendendo un campione biologico, andandone a vedere la composizione, valutandone i parametri e vedere se saranno uguali o modificati in relazione a stati patologici. La biochimica clinica è quindi una scienza applicata interessata alla misura dell’effetto manifestato dalla malattia sui processi biochimici dell’organismo. Prende in esame qualsiasi campione biologico di interesse per il paziente. Viene definita “semeiotica strumentale” cioè si cerca di ottenere dei segni da una macchina o da uno strumento di laboratorio mentre quella tradizionale studia quei soggetti e anomalie in base a modificazioni evidenti all’occhio.

Percorso clinico: un paziente va dal clinico che lo visiterà e farà una diagnosi. Sulla base di quest’ultima farà ipotesi che verranno verificate tramite analisi di laboratorio che confermeranno o meno la sua teoria tramite un referto. I referti possono essere dati solo da laboratori “accreditati” ossia quei luoghi sottoposti a una procedura di accreditamento (NO farmacie e strumenti POCT). Una volta fatta una diagnosi precisa e confermata si stabilità una terapia e una prognosi e successivamente un periodo di “Follow up” ossia di monitoraggio continuo e periodico della situazione medica del paziente in seguito alla terapia. Se i risultati non confermano l’ipotesi, il medico ripartirà da zero visitando il paziente, proponendo un’altra diagnosi e esami di laboratorio su altri 3 valori da analizzare. Le analisi biochimico-cliniche ci consentono: un monitoraggio terapeutico per tutti quei farmaci con indice terapeutico ristretto; per esami di screening e per il monitoraggio delle condizioni parafisiologiche (persone che stanno bene ma in sovraccarico metabolico come in gravidanza).

Cos’è un esame e come viene fatto?

Per risolvere un problema analitico, si svolge un esame di laboratorio; si mette nel campione il reattivo 1, si incuba e si aggiunge il reattivo, si mescola e centrifuga per ottenere qualcosa di misurabile. Questo può essere un procedimento qualitativo, quantitativo o semi-quantitativo. Sapendo sempre cosa noi cerchiamo, facciamo un procedimento semi-quantitativo, una via di mezzo.

Esempi:

• Le strisce reattive con cui si fa l’analisi delle urine in casa, in farmacia o anche in laboratorio. La differenza sta nel fatto che in farmacia vengono poi analizzate sulla base del loro viraggio cromatico con la vista, in laboratorio con fotometri a riflettanza che captano la luce riflessa.
• Le reazioni per dosare il glicerolo nel sangue ed è misura indiretta dei trigliceridi agendo in rapporto 1:1. Si prende il campione + solvente/tensioattivo ➔ trigliceride in soluzione + trigliceride lipasi ➔ glicerolo (lo devo rendere misurabile) + glicerolo chinasi + ATP ➔ glicerolo-3-fosfato + ADP + PEP ➔ acido piruvico + ATP + NADH deidrogenasi ➔ prodotto visibile NAD ne studia lo spettro di assorbimento. Infatti, si può sfruttare la proprietà ottica del coenzima: prendendo in considerazione lo spettro di assorbimento del NAD che ha un picco di assorbimento a 260 nm e crescendo, l’assorbanza varia. Dopo comincia a calare quando aumenta la lambda di assorbimento.

Come si possono dosare le lipoproteine?

Vengono studiate anche per avere informazioni riguardo al rischio cardio-vascolare. Vengono separate sfruttando la loro diversa densità. Le faccio sedimentare velocemente con l’ultracentrifugazione su gradiente con Cloruro di Cesio e un fotometro mi segnala con una radiazione luminosa il passaggio delle lipoproteine. Ci sono solo in laboratori dedicati (uno per regione). Un altro modo per dosarle, se ci accontentiamo di misure meno sofisticate, è dosando il contenuto di una componente di colesterolo cLDL e cHDL. Molte delle sostanze che noi desideriamo analizzare, gli analiti, sono legati alle proprietà degli enzimi. Questi vengono misurati in due modi: con l’immuno-metodo e con la misura dell’attività biologica.

Strategia del medico

La strategia del medico è quella di prescrivere esami multiparametrici ossia esami con più analisi all’interno per studiare bene la funzionalità di un determinato organo. Questa lista conterrà più o meno esami da fare a seconda delle disponibilità finanziarie e della scoperta di un nuovo procedimento analitico con una nuova sostanza. Gli analiti che noi ricerchiamo tramite esami si misurano con la concentrazione (unità di misura=molarità), ed è quella più usata, o mg/dl o peso/volume usato nel sistema sanitario. Ci sono comunque anche altre modalità con cui studiare la funzionalità di un organo.

• Velocità di filtrazione glomerulare tramite l’esame della clearance. Un esempio di clearance è quella della creatinina. Quest’ultima utilizza come substrato la creatina prodotta dal fegato a partire dagli aminoacidi. Viene messa in circolo e captata dal muscolo che la usa come immagazzinamento di energia. La creatina è quindi un marcatore d’organo che ci dice quanto organo muscolare è presente.
• Enzima amilasi: esempio la saliva è un altro parametro, ma essendo facilmente influenzabile, viene studiato sulla base dell’enzima amilasi che vi è all’interno.

Misura dell’attività biologica

• Immuno-metodo usato per determinare l’attività di enzimi e proteine quando sono in grandi miscele fra loro è il più usato. Si basa sul mettere in una provetta sulle cui pareti sono adesi anticorpi 1 di cattura, il campione; questa proteina riconosciuta dagli anticorpi verrà legata. Poi si lava via tutto e si aggiunge un anticorpo 2 di misura che legherà la proteina scelta dal primo anticorpo in un punto diverso. Questo anticorpo avrà attaccato alla sua struttura un sito esterno facilmente riconoscibile e misurabile: con la fluorescenza, chemiluminescenza, radioattività, o con il metodo Elisa. Poi creo una curva di taratura: prendo la proteina pura, la diluisco e divido in diverse provette con concentrazione di proteina crescente per ognuna e vado a vedere la quantità di segnale registrata. Avremo una relazione lineare fra le due grandezze.
• Misura dell’attività biologica è un altro metodo con il quale misurare l’attività di enzimi e proteine sfruttando le loro reazioni naturali che possono andare in entrambe le direzioni fornendogli pH, temperatura, concentrazione ionica e concentrazione di substrato saturante ottimali in modo tale che la reazione avvenga fino a che non si è esaurito tutto il substrato sul quale lavorare. L’attività biologica mi dice quanto substrato ho misurato nell’unità di tempo. Lo studio tramite un grafico in cui metto in relazione l’assorbanza (Asse Y) con il tempo in secondi (Asse X).

Nota bene: bisogna limitare gli esami biochimici perché abbiamo un 5% di valori che risulteranno alterati anche se non denotano uno stato patologico a tutti gli effetti!

Priorità degli esami

• In emergenza-urgenza per situazioni di pericolo di vita
• Screening: hanno lo scopo di evidenziare una malattia prima che si manifestino le conseguenze cliniche. Viene fatto solo per patologie per cui esiste una cura e nel caso in cui la sua conoscenza non causi essa stessa problematiche psichiche nell’affrontarla al paziente che possa portarlo anche a gesti estremi. Possono essere fatti su:
• Gruppi selezionati: neonati (fenilchetonuria), malattie professionali, prevenzione di malattie infettive, popolazioni con un numero elevato di casi di una malattia, ereditarietà accertata.
• Gruppi di singoli individui: ricerca di geni per una malattia ereditaria, familiarità diabetica e per scongiurare effetti iatrogeni (FANS, anticoagulanti…)
• Gli screening su popolazioni enormi di persone non hanno senso come non hanno senso quelli ad esempio sulla glicemia. Sono troppo dispendiosi per nulla. Esempio: screening alla prostata, neoplasia mammaria, tumori colon-retto dove si va a cercare sangue occulto nelle feci, screening neonatale, screening per soggetti che lavorano con sostanze tossiche, screening su unità trasfusionali e su atleti per le sostanze dopanti.
• Di routine esami che vengono effettuati tutti i giorni

Quello che cambia è il tempo di ritorno (TAT); infatti gli esami sono tutti urgenti ma per diminuire il TAT ci sono due modi: o si inviano i risultati attraverso mezzi informatici e arrivano prima o tramite strumenti POCT per analisi che vengono fatte nel reparto stesso.

• Esame emocromocitometrico
• Esame completo delle urine
• Emogasanalisi ed elettroliti
• Esame delle proteine plasmatiche
• Esame del liquor
• Esame dello sperma

Metabolismi (richiamo di biochimica)

Lipidi i più interessanti a livello di analisi biochimico-cliniche sono i trigliceridi e il colesterolo. I trigliceridi sono esteri del glicerolo legati a 3 acidi grassi e svolgono importanti funzioni: sintesi dei fosfolipidi e conservazione dell’energia. I lipidi, una volta introdotti, devono essere digeriti e assorbiti. Per poter essere digeriti necessitano prima di tutto dei sali biliari per poter formare un’emulsione che poi verrà del tutto digerita da determinati enzimi pancreatici avendo una superficie a loro esposta in maniera maggiore: il colesterolo viene scisso in acido grasso e colesterolo libero. Dopo la digestione nell’enterocita (cellula dell’intestino) troviamo: monogliceridi, acidi grassi e glicerolo.

Acidi grassi e glicerolo sono solubili: passano ai capillari sanguigni e venosi, entrano nel circolo portale, vanno al fegato e poi nel circolo generale. I restanti lipidi insolubili invece devono essere riconfezionati in lipoproteine (chilomicroni), entrano poi nel circolo linfatico, villi intestinali e poi circolo venoso. La bile, utilizzata per emulsionare i grassi, viene sintetizzata dal colesterolo e, dalla cistifellea passa tramite il dotto di Wirsung nella papilla maggiore e sfocia nell’intestino.

Quindi il colesterolo: entra nelle membrane per regolarne la fluidità, esfolia l’epitelio epidermico, sintetizza molecole steroidee con destini diversi e sintetizza acidi biliari che diventeranno sali biliari. Invece i trigliceridi si trovano in rapporto 1:1 con il glicerolo (1 trigliceride=1 glicerolo+3 acidi grassi) quindi si utilizza per misurare indirettamente i trigliceridi.

Processi di metabolismo dei lipidi

Lipidi ➔ emulsionati con Sali biliari e assorbiti ➔ tessuti periferici + lipoproteina lipasi ➔ acidi grassi e glicerolo:

• Gli acidi grassi a catena corta vengono assorbiti nell’intestino tenue e vanno al fegato
• Gli acidi grassi a catena lunga vengono assorbiti dagli enterociti e riesterificati a trigliceridi + colesterolo = chilomicroni ➔ tessuti periferici (trattengono solo trigliceridi) ➔ i rimanenti chilomicroni con il colesterolo vanno poi al fegato che li metabolizza.

Di acidi grassi ne abbiamo bisogno: per il metabolismo basale dei tessuti, per il battito cardiaco, per il mantenimento della glicemia nel fegato. A seconda della glicemia verranno rilasciati diversi enzimi pancreatici tra cui insulina e glucagone che innescheranno glicolisi, gluconeogenesi, glicogenosintesi e glicogenolisi a seconda delle necessità. Proprio la gluconeogenesi usa glicerolo per formare glucosio come anche usa il lattato e gli aminoacidi. Invece per quanto riguarda la sintesi dei trigliceridi a partire da glucosio e dallo scheletro carbonioso di aminoacidi vengono sintetizzati dagli epatociti unendoli a molecole proteiche e dando vita alle VLDL ➔ tessuti periferici che trattengono i trigliceridi lasciando IDL ➔ verranno ulteriormente impoveriti a LDL (ricche solo di colesterolo).

Nota bene: i chilomicroni vengono secreti da enterociti e le VLDL dagli epatociti. Siccome il percorso di digestione e assorbimento è così lungo, per le loro analisi si prevedono 10-16 ore di digiuno precedenti.

Biosintesi lipidi

Dopo un pasto ricco di aminoacidi e zuccheri ➔ glicolisi e decarbossilazione del Piruvato ➔ AcetilCoA ➔ ciclo di Krebs (ATP) e nel mitocondrio diventa acido citrico, va al citosol dalla navetta del citrato citoplasma ritorna AcetilCoA + Ossalacetato + NADH + malato ➔ nel deidrogenasi ➔ malato + malicodeidrogenasi ➔ Piruvato che torna al mitocondrio come ossalacetato grazie alla piruvatodeidrogenasi. Per ogni 1AcetilCoA portato nel citosol si forma un NADPH ➔ AcetilCoA + CO₂ ➔ MalonilCoA.

Gli acidi grassi possono diventare trigliceridi e fosfolipidi. Il ciclo dei trigliceridi: Piruvato ➔ ossalacetato ➔ PEP ➔ Diidrossiacetonfosfato ➔ glicerolo-3-fosfato-triacilglicerolo (trigliceride). Sintesi di colesterolo: 3AcetilCoA ➔ mevalonato ➔ isoprene attivato ➔ isomerizzazione isoprene ➔ squalene ➔ ciclizzazione squalene ➔ colesterolo.

Catabolismo lipidi

Acidi grassi ➔ AcetilCoA. Devono essere attivati con lo shuttle della carnitina e trasportati nei mitocondri dove avverrà la beta-ossidazione. Poi l’Acetil-CoA può entrare nel ciclo di Krebs o essere trasformato in corpi chetonici.

Carboidrati

Nella dieta noi introduciamo saccarosio, lattosio, glucosio e tutto viene trasformato in glucosio dal nostro organismo. La glicemia deve essere mantenuta intorno a 80 mg/dl. Questo valore viene mantenuto grazie alla secrezione di diversi enzimi pancreatici tra i quali insulina (dopo un pasto che attua la glicogenosintesi e la glicolisi) e il glucagone che attiva la gluconeogenesi e la glicogenolisi. Questo valore va mantenuto costante il più possibile in modo da non incombere né in coma ipoglicemico né in coma diabetico. Il glucosio è responsabile delle reazioni di glicazione: il gruppo aldeidico (del glucosio) trova un gruppo amminico primario e vi si lega e la molecola si trasforma in un intermedio che non si stabilizza e formerà un aldimina in alcuni minuti/ore. Quando questi complessi si legano a molecole sono indici di senescenza come quando si legano ai globuli rossi invecchiati dopo circa 120 giorni per poterli eliminare.

Vie principali del metabolismo

• Ciclo dei pentosi
• Glicolisi
• Glicogenosintesi
• Glicogenolisi
• Gluconeogenesi

Dalla glicolisi deriva il Piruvato che ha diversi destini:

• Ciclo di Krebs (in presenza di O₂)
• Fermentazione lattica
• Fermentazione alcolica (in assenza di O₂)

Nota bene: i carboidrati vengono digeriti e assorbiti in poco tempo motivo per il quale per le analisi bastano 8 ore di digiuno precedenti.

Aminoacidi

Catabolismo: avviene tramite transaminazione e ciclo dell’urea;

1. Si allontanano i gruppi amminici e vanno sull’alfa-chetoacido: l’amminoacido diventa chetoacido e l’alfa-chetoacido diventa amminoacido; dal citoplasma va ai mitocondri dove la glutammato deidrogenasi fa una nuova deaminazione ossidativa e si origina NH₃ + alfa-chetoacido e l’ammoniaca va al ciclo dell’Urea.
2. Gli scheletri carboniosi rimasti sono trasformati in intermedi metabolici per ottenere glucosio, corpi chetonici o intermedi del ciclo di Krebs, tramite via chetogenica e via glucogenica.

Tipi di esami

Gli esami diagnostici sono mirati a convalidare o escludere un sospetto diagnostico o a risolvere quesiti lasciati aperti dai profili di base.

Profili mirati

Accostamento morfo-funzionale di un organo. Sono pannelli di analisi che si riferiscono a un tessuto/organo. Esempio per la funzionalità epatica alcuni enzimi nel complesso ci possono dare più informazioni che singolarmente. Tra i più importanti:

• Profilo epatico: enzimi (aminotransferasi, LDH, ALP, GGT), bilirubina, proteine totali, fibrinogeno, albumina, emocromo, esame urine (urobilinogeno e bilirubina).
• Profilo renale: urea, creatinina, elettroliti plasmatici e urinari, esame urine completo (fisico, chimico e citologico).
• Profilo tiroideo: T3, T4, T3 libero, T4 libero, tireotropina
• Profilo pancreatico: amilasi plasmatica e urinaria e lipasi

Prove funzionali dell’evoluzione temporale di una sostanza nell’organismo

Misura per vedere come viene assorbita, metabolizzata ed escreta. Si andrà poi a costruire una curva da carico. Alcuni esempi sono:

• Esame di clearance urinaria (creatinina, inulina per il rene). L’esame di clearance della creatinina ci dice l’esatta funzionalità del rene. Forniamo qualcosa e vediamo in quanto tempo viene eliminata, così si va a vedere la quantità di urina prodotta e se ne misura la quantità di creatinina dentro
• Ematica (fegato). Riguarda sia il rene che il fegato. Le clearance epatiche non sono più usate, quella renale sì come anche la curva da carico.
• Prove da carico (carico di glucosio OGDT orale o per endovena). OGDT (=test di tolleranza al glucosio) si tratta di dare un bolo di glucosio da bere 70 g in 200 ml e si misura la glicemia. Poi creiamo la curva da carico: un soggetto senza problemi avrà una curva in aumento poi in discesa della glicemia, se invece c’è qualcosa che non va la curva sarà crescente avendo difficoltà nel metabolizzare il glucosio.
• Prove di stimolo
• Prove di inibizione

Profilo urinario (esempio) è uno dei profili multiparametrici e comporta almeno 3 esami diversi:

• Un esame chimico delle sostanze presenti all’interno
• Un esame fisico che riguarda colore, aspetto, pH e peso specifico. pH, peso specifico e colore dipendono dallo stato di idratazione. Potremo avere pH più o meno acido/basico (4,7-8) ma tendiamo ad avere un metabolismo che elimina acidi e che introduce sostanze neutre. Noi usiamo glucosio e lo trasformiamo in CO₂ e questa, o è in equilibrio con l’acido, o verrà trasformato. Tenderemo ad avere un pH più acido perché introduciamo cibi basici che verranno eliminati come acidi.