Analisi biochimico-cliniche

Criteri interpretativi per l'utilizzo degli esami di laboratorio

Si ha il referto del paziente con la misura delle diverse sostanze. Le misure sono indicate con l'unità di misura e il range di valori accettabili per quella misura. Come si determina il range di valori di riferimento (minima chiave di lettura)? Non sono fissi ma variano in base al contesto.

Elementi del referto

• Analita (misurando) misurato
• Tipo di campione
• Valore numerico trovato
• Unità di misura
• Intervallo di riferimento o valori decisionali
• Indicazioni supplementari su metodi analitici usati o altre informazioni utili per l'interpretazione (es. quando si usano marcatori tumorali)

Trasformazione del reperto di laboratorio in referto

Confronto il risultato del paziente con i risultati di una popolazione ideale (popolazione dei sani). Come analizzo l'intera popolazione? Estraggo dei campioni di riferimento e faccio una semplice analisi statistica ottenendo un range di valori che sta nel 95% dei valori della popolazione. Oltre a questi valori ci sono però anche dei fattori di rischio che spesso non rientrano nella popolazione (cioè fattori biologici che generano variazione, es. gravidanza).

Nella condizione ideale so cosa sto studiando e definisco a priori i criteri di riferimento (es. nello studio del tumore alla prostata non prendo in considerazione le donne): uso criteri di esclusione e ripartizione. In questo caso basta una piccola popolazione di 100/120 persone. Se non cosa sto studiando eseguo una selezione a posteriori: prendo un campione di 2000 persone e successivamente magari decido di escludere una categoria della popolazione (es. escludo gli adolescenti).

Se il campione ha distribuzione gaussiana, il 95% cade tra la media +/- 2 deviazioni standard (DS). Se la distribuzione non è gaussiana usiamo i percentili (valori che separano la popolazione) e il 95% sta tra limite superiore ed inferiore:

• xa = 2.5 percentile = limite inferiore di riferimento
• xb = 97.5 percentile = limite superiore di riferimento

Indipendentemente dalla distribuzione, i limiti devono indicare dove sta il 95% della popolazione (ordino i valori dal più basso all’alto ed elimino il primo 2.5% e l’ultimo). I metodi che si usano in laboratorio non sono tutti equivalenti e gli intervalli di riferimento dipendono dal metodo. La dispersione è più ampia quando il metodo è meno riproducibile: una curva è tanto più accurata quanto più è accurato e riproducibile il metodo usato per la misurazione.

Effetto della variabilità biologica

Esempio: misura delle apolipoproteine (= proteine delle lipoproteine): apoAI e apoB

• 12 soggetti presentano apoAI tra 1.2 g/l e 2.2 g/l, ma con alcune differenze (in alcuni soggetti è più bassa)
• 12 soggetti presentano apoB tra 0.6 e 1.6 g/l

C'è variabilità biologica che deriva da due fonti:

• Variabilità interindividuale
• Variabilità intraindividuale

Lo studio dell'effetto della variabilità biologica deve essere condotto da chi presenta nuovi marcatori: dei valori che per alcuni soggetti sono normali potrebbero non esserlo per altri. Se la variabilità biologica interindividuale è maggiore di quella intraindividuale, allora dovrò fare ulteriori esami.

L'indice di individualità è dato dal rapporto tra variabilità intraindividuale e variabilità interindividuale: se scende sotto lo 0.6%, la teoria di applicazione degli intervalli di riferimento è debole. È frequente trovare analiti (= ciò che si misura) con un indice di individualità molto basso (es. colesterolo totale).

Criteri utilizzabili per l'utilizzo degli esami di laboratorio

1. Confronto dei risultati ottenuti con gli intervalli di riferimento per i soggetti sani [livello biologico]. Si usa la differenza critica CD per vedere se la variazione del risultato, rispetto agli intervalli, è significativa per l'organismo, cioè la differenza tra due misure quantitative misurate con lo stesso metodo e sullo stesso analita. È dovuta alla combinazione di Va (variabilità analitica) e Vi (variabilità intraindividuale).
2. Confronto degli ultimi risultati con i risultati precedentemente ottenuti dallo stesso soggetto [livello biologico]. Ci si chiede se è intervenuta variabilità biologica o analitica del metodo.
   • Esempio: analisi di elettroliti in cui le misure vengono ripetute tre volte in date diverse e si calcola qual è la differenza critica media.
   • Esempio: colesterolo su due pazienti NB: sui marcatori tumorali non abbiamo una CD specifica.
3. Impiego di livelli decisionali [livello nosologico cioè legato alla conoscenza della malattia e ne vedo gli effetti]. Il livello decisionale rappresenta il valore o risultato di un esame di laboratorio che è associato a una specifica decisione e comportamento clinico. È contrapposto al livello patognonomico in cui uso un marcatore per vedere la presenza della malattia. Per la maggior parte degli esami di laboratorio non ci sono però. Se il valore soglia per l'esame viene superato, allora si sceglie se seguire o meno il trattamento, se modificarlo ed il proseguimento delle indagini diagnostiche. I livelli decisionali sono di gran lunga preferibili ai limiti di riferimento.
   • Chi definisce i livelli decisionali? Sono definiti dalle società scientifiche a livello internazionale e sono scelti per consenso, scelta empirica (es. su base fisiopatologica) e con il calcolo delle probabilità (teorema di Bayes o curva ROC).
4. Approccio probabilistico-diagnostico [livello nosologico] attraverso rapporto di probabilità (LR), rapporto tra la frequenza con cui un certo valore di un esame diagnostico si presenta tra i soggetti con la malattia e la frequenza con cui lo stesso valore si presenta nei soggetti senza malattia. Più il rapporto è grande e più è discriminante il test (impatta sulla decisione clinica). Come si dovrebbe operare? In base al risultato traggo le conclusioni e costruisco una casistica.
   • Diagnosi (valutazione trasversale): uso i livelli decisionali (se non ci sono i limiti di riferimento)
   • Monitoraggio (valutazione longitudinale): utilizzo la CD e vedo un aumento/diminuzione del bio-marcatore
   • Valutazione del rischio: associo la concentrazione del bio-marcatore alla probabilità di andare incontro a eventi nel follow-up

I valori critici sono quei livelli di esami di laboratorio che se superati comportano un grande rischio per il paziente. Esempio: pH, glicemia, Hb sono definiti da diverse società (cardiologi americani, altre società). Questi valori non sempre concordano tra le società.

Fase pre-analitica

Tutto ciò che precede l'analisi vera e propria del campione. Sul totale degli errori fatti in laboratorio, il 62% è fatto nella fase pre-analitica (15% nell'analitica e il 23% nella post-analitica): durante questa fase, è essenziale che venga conservata l'integrità chimica, biologica e morfologica del campione biologico per garantire il più possibile la correttezza del risultato analitico.

• Appropriatezza della richiesta: l'esame deve rispondere al quesito posto per limitare i costi.
• Preparazione: si vuole che il risultato rispecchi la condizione fisiologica del paziente e bisogna tenere conto di diversi fattori quali tipo di alimentazione, esercizio fisico, postura, alcol e farmaci.
• Raccolta del campione biologico: può essere sangue e derivati (plasma e siero), urine/feci, sudore. I requisiti minimi prevedono digiuno di almeno 8 h, a riposo per almeno 5 min prima del prelievo, che deve avvenire tra le 8 e le 10 del mattino. Viene effettuata disinfezione con alcol (o altro) e i materiali utilizzati devono essere sterili.
• Stabilità del campione: trasporto e conservazione.
• Trattamenti specifici eventuali

Modalità del prelievo del sangue

Venoso (braccio) o capillare (polpastrello o lobo orecchie).

Derivati del sangue

Prelievo di siero: In provette senza anti-coagulante: il sangue coagula, si centrifuga ed il coagulato (piastrine, eritrociti, leucociti, fibrinogeno) va sul fondo mentre il liquido che rimane è siero. Problema: le cellule inglobate nel coagulo subiscono danni e inducono la liberazione di parte del contenuto cellulare, può verificarsi una variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma. La concentrazione di K, fosfatasi acida e la LDH maggiori rispetto a quella del plasma.

Prelievo di plasma: Si usa anti-coagulante, segue centrifugazione: le cellule più pesanti (eritrociti) vanno sul fondo, piastrine e leucociti in mezzo mentre il plasma rimane in alto. Contiene il fibrinogeno e i fattori della coagulazione. Vantaggi: più veloce da ottenere perché non si devono aspettare i 30 min di coagulazione e le cellule vengono stressate meno, non avviene emolisi quindi non risente del trauma della coagulazione. Più adatto nell'urgenza, ottenuto rapidamente per centrifugazione del campione senza attendere il tempo necessario alla coagulazione.

I grassi (trigliceridi) nella dieta possono influenzare la trigliceridemia ed aumentarla anche dopo un digiuno di 12 h.

Interferenti generali per la determinazione su plasma

Emolisi: il campione di plasma ha emoglobina libera al suo interno per la rottura degli eritrociti dentro i quali è solitamente contenuta. Si vede ad occhio nudo quando il campione non tende più al giallo ma al rosa e in un'analisi di tipo ottico ci possono essere interferenze sull'assorbanza; oppure ci sono analisi per la misura del grado di emolisi e si determina se l'emolisi influenza le analisi.

• Causa biologica: anemie emolitiche
• Causa meccanica: aghi troppo piccoli
• Causa chimica od osmotica: presenza di disinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche nell'ago, sulla pelle o nei contenitori
• Causa fisica: modalità di conservazione non idonea (es. congelamento)

Se l'emolisi è forte non è possibile misurare la lattato deidrogenasi LDH ma anche AST (aspartato amminotrasferasi), ALT (alanino amminotrasferasi) e K.

Lipemia: il campione di lipidi è solitamente giallo ma trasparente. Con l'aumento di trigliceridi (dovuto ad esempio dalla dieta) il campione diventa sempre più giallo e meno trasparente.

Campione itterico: campione di bilirubina che tende al giallo/arancione fluo e non si può misurare la creatinina.

Influenze sull'analisi del campione

Il tipo di alimentazione, l'assunzione di bevande alcoliche e farmaci, l'esercizio fisico, stress e affaticamento, altitudine, ritmi circadiani e postura sono tutti elementi che possono influenzare l'analisi del campione.

• Il tenore in grassi della dieta può influenzare la concentrazione plasmatica dei componenti lipidici del sangue: un pasto ricco in trigliceridi può fortemente influenzare la trigliceridemia fino ad aumentarla del 100%, anche dopo un digiuno di 12 h; la misura dei trigliceridi necessita 9-12 h di digiuno.
• L'alcol ha l'effetto di aumentare lattato, acido urico e a lungo termine l'attività di diversi enzimi plasmatici come la AST e la γ-GT. Anche la trigliceridemia e l'HDL (lipoproteine ad alta densità=colesterolo buono) aumentano considerevolmente nell'abuso cronico di alcol.
• L'esercizio fisico, se intenso e su individui non allenati, causa modificazioni della concentrazione di molti parametri di laboratorio quali variazioni a carico di enzimi plasmatici: CK (creatinchinasi), aldolasi, LDH (lattato deidrogenasi), transaminasi; (ad es. l'attività della CK può risultare raddoppiata nelle 12-30 h dopo attività sportiva intensa). Può indurre ematuria e proteinuria.
• Il farmaco o i suoi metaboliti possono avere attività biologiche collaterali che causano modificazioni della concentrazione di uno o più analiti. Si riscontra interferenza di natura fisico-chimica sul procedimento analitico: il farmaco, o suo catabolita, si combina all'analita da misurare, oppure c'è una vera e propria interferenza verso le reazioni del procedimento analitico. Le attività degli enzimi plasmatici sono particolarmente esposte alla interferenza da farmaci.
• Ritmi circadiani: analiti influenzati dal ciclo luce-buio.
• Il passaggio dalla posizione supina alla posizione eretta ha come conseguenza la fuoriuscita di acqua e componenti filtrabili dal compartimento vascolare a quello interstiziale quindi le componenti non filtrabili (proteine, enzimi, Ca, Fe) divengono più concentrati nel plasma.

Emoglobina (Hb) totale

• Concentrazione di Hb nel sangue e determinazione di eventuale anemia (anche in plasma, urine, ...)
• Determinazione di derivati emoglobinici quali HbCO e MetHb
• Determinazione di Hb minori quali HbA2 e HbF e determinazione di talassemie e HbA1c per il controllo glicometabolico del diabete
• Separazione delle Hb e presenza di Hb varianti

HbA: Struttura 64mila Da, proteina tetramerica formata da 4 catene globiniche uguali 2 a 2 (2α e 2β) e su ogni catena è presente un gruppo eme ferroprotoporfirina IX nel quale si lega il Fe²⁺ (allo stato ossidato Fe³⁺ l'Hb non è funzionale e non trasporta O). L’eme è costituito da 4 anelli pirrolici con al centro il Fe²⁺. Aptoglobina lega Hb per prendere il complesso più grande per evitare di farla finire nelle urine.

L'Hb è scissa dai macrofagi nelle sue componenti: Ham e Fe²⁺ sono recuperati e rimessi in circolo mentre la protoporfirina è trasformata in bilirubina.

L'Hb, come le altre proteine, è sintetizzata dal ribosoma; il Fe²⁺ è introdotto con la dieta mentre il gruppo eme è sintetizzato in fegato e midollo osseo con reazioni che avvengono nei mitocondri e nel citosol:

• Condensazione tra succinil Co-A e glicina che dà acido amminolevulinico che è portato nel citosol dove forma coproporfirinogeno e rientra nei mitocondri
• Decarbossilazione dà protoporfirina IX con i 4 anelli pirrolici che legano il Fe²⁺

Emopoiesi nel midollo osseo dell'adulto da cui derivano la linea linfoide, mieloide che darà origine a eritrociti, leucociti e piastrine.

L'eritropoiesi è sotto il controllo di epo (eritropoietina) prodotta dal rene. Determina:

• Aumento di sintesi dell'emoglobina negli eritroblasti
• Promuove la differenziazione dei precursori eritroidi a reticolociti ed eritrociti e il loro rilascio in circolo

Quando l’epo è bassa a livello periferico, interviene il rene che risponde producendo epo: è prodotta in funzione del grado di ipossia (=carenza di O).

L'eritrocita è rilasciato in circolo dove vi rimane per 120gg ed è poi rimosso attraverso:

• Emolisi extra-vascolare: l'eritrocita espone sulla superficie dei marker di invecchiamento (90%)
• Emolisi intra-vascolare: l'eritrocita si rompe nel letto vascolare rilasciando il suo contenuto nel plasma (10%)

Anemie

• Primitive: policitemia vera
• Secondarie: risposta fisiologica a situazioni di ipossia
  • Altitudine, ridotta pO₂ atmosferica (alta montagna)
  • Malattie polmonari con insufficienza respiratoria (enfisema)
  • Cardiopatie
  • Hbpatia ad alta affinità per O₂: non lo rilasciano
  • Nefropatie

Metodo di Drabkin: metodo spettrofotometrico. Tutte le Hb presenti nel campione (HbO₂, Hb, HbCO, Hb⁺) vengono convertite in un unico derivato molto stabile (Hb⁺CN^-) che ha un massimo di assorbimento a 540 nm. Campione: sangue coagulato con EDTA. Protocollo: 5 ml di reagente di Drabkin (K ferricianuro, K⁺ cianuro, detergente) + 50 mL sangue. Calcolo Hb misurata in g/dL. Interferenze: essendo un esperimento ottico il campione deve essere limpido.

Valori di riferimento: divisi per uomini e donne e fasce d'età (neonato Hb alta, donna bassa fino a età fertile)

Hb nel globulo rosso

• Diverse per sintesi genetica (nell'adulto):
  • Hb A0 92-95% (α₂,β₂)
  • HB A2 2-3% (Α₂,Δ₂) trasporta O come Hb A0, importante perché marcatore di β-talassemia
  • Hb F < 1 % (α₂,υ₂) fetale (componente emoglobinica principale nel neonato)
• Diverse per modifiche post-traduzionali:
  • HbA1c glicata: lega glucosio spontaneamente
  • HbA1a lega fruttosio-1,6-difosfato
  • HbA1b lega glucosio 6-fosfato
  • HbF acetilata (nel neonato)
• Diverse per il sostituente legato all'eme (derivati emoglobinici):
  • Hb O₂ 98% ossigenata se si considera sangue arterioso
  • Hb deoxy 60% deossigenata se si considera sangue venoso
  • Hb CO 2-3%
  • Met Hb <2% con Fe³⁺ (ossidato) sempre legato

Importanza della misurazione di Hb

Perché aumento e diminuzione sono legate a patologie quali l'anemia: riduzione della concentrazione totale di Hb nel sangue periferico (riduzione del 20% rispetto ai valori fisiologici di riferimento).

Criteri WHO per la diagnosi: Uomini < 13 g/dL Donne < 12 g/dL Gravidanza < 11 g/dL: in generale con Hb <8 g/dL c'è anemia grave che richiede trasfusione. Manifestazioni cliniche molto varie:

• Pallore cutaneo e delle mucose
• Debolezza, mancanza di energie, facile affaticamento
• Tachicardia
• Dispnea da sforzo
• Alterazioni epiteliali come capelli sottili e fragili, unghie fragili, appiattite o concave, ragadi agli angoli della bocca

Possibili cause: Ridotta produzione di RBC (matrice eritropoietica nel midollo osseo): insufficiente produzione nel midollo osseo di cellule del sangue (anemia aplastica) per infiltrazione neoplastica del midollo osseo.