Appunti d'esame di Patologia generale

Introduzione e definizioni

Studia i meccanismi attraverso i quali le cellule e i tessuti rispondono agli stimoli anormali alla base delle malattie, deviazione rilevabile dall’omeostasi. Può dipendere da fattori intrinsechi o estrinsechi all’organismo. L’eziologia si occupa di studiare le cause delle malattie, la patogenesi studia invece i meccanismi di azione nel determinare una malattia che, nella maggior parte dei casi, sono multifattoriali.

Cellula eucariotica: le proteine vengono degradate dai lisosomi o nel proteasoma → complesso multifattoriale cilindrico che degrada polipeptidi nella cellula e vi entrano quando sono marcate dall’ubiquitina e da cui escono come AA o piccoli peptidi. L’ubiquitina è un peptide di 76 AA attivato dal legame con l’enzima E1 → trasferita all’enzima E2 → passa alla proteina bersaglio o all’enzima E3 che catalizza l’attacco del polipeptide da degradare, consumando ATP.

Il DNA: di 2 metri avvolto in cromosomi. Nelle c. somatiche si hanno 46 cromosomi per 23 coppie totali di cui 22 autosomiche e la 23esima è quella del sesso. Formato da nucleoidi: zucchero pentoso + gruppo fosfato + base azotata.

Cromatina: costituita da DNA e proteine, cioè istoni; H2A, H2B, H3, H4. È simile ad una collana di perle, ognuna rappresenta i nucleosomi, legate da un filo, cioè DNA-linker, in cui vi è l’istone H1. Vi sono diversi livelli di condensazione del DNA:

• DNA a doppia elica
• Cromatina
• Cromatina condensata durante l’interfase
• Cromatina condensata durante la profase
• Cromosoma durante la metafase

La regolazione dell’espressione genica avviene durante o dopo la trascrizione. La regione codificante è l’esone, quella non codificante è l’introne. All’inizio vi è una porzione regolatoria formata da TATA-box, promotori ed enhancer per legare i fattori di trascrizione. ATG è il codone di inizio. All’mRNA matura vengono levati gli introni e aggiunta una coda poli A.

Regolazione trascrizione genica: tramite:

• RNA polimerasi: rRNA, mRNA, tRNA
• Fattori trascrizionali: 1. Costitutivi, non specifici per i geni; 2. Inducibili, si legano a specifiche sequenze in alcuni promotori e solo a quelli nella forma attivata.

Questi fattori devono avere 2 caratteristiche: riconoscere specifiche sequenze bersaglio e interagire con la RNA polimerasi o altri fattori di trascrizione. Questi fattori di trascrizione sono attivati da: 1. Regolazione trascrizionale; 2. Regolazione post-traduzionale: per fosforilazione, defosforilazione, degradazione di un inibitore, legame con un ligando e oligomerizzazione.

I siti di legame sono il promotore, sequenza di DNA che regola la trascrizione, e l’enhancer, elemento di rinforzo a monte o a valle del sito di inizio.

I geni possono essere: 1. Costitutivi, hanno bisogno di legare l’apparato basale di trascrizione; 2. Inducibili, hanno bisogno di legare i fattori trascrizionali inducibili per attivarsi e legarsi a promotore e enhancer. Il promotore può essere: 1. Basale: permette una corretta localizzazione del complesso di inizio e di regolare l’efficienza della trascrizione; contiene sequenze regolatorie: TATA-box a cui si lega TBP, tata binding proteine, CAAT a cui si lega C-EBP, CG a cui si lega SP1; 2. Inducibile: oltre alle sequenze basali contiene altri elementi specifici: HSF, heat shock factor che si lega a HSE, SRE, serum response factor che si lega a SRF, GRE, glucocorticoid response element.

La trascrizione è regolata da 2 tappe: cambiamento nella struttura locale del gene e l’apparato basale di trascrizione si lega al promotore.

Meccanismi epigenetici di regolazione

Meccanismi epigenetici, cioè al di sopra dei geni, di regolazione: quando la regolazione non è legata alla trascrizione dei geni ma a queste modalità:

• Acetilazione e deacetilazione regolano l’espressione genica → la prima è aumentata nelle zone con geni attivi, la seconda è un prerequisito per una struttura inattiva così il gene sarà inattivo e non verrà trascritto. Gli enzimi che partecipano a acetilazione e deacetilazione sono: HAT, istone-acetiltransferasi, e DAC, istone deacetilasi.
• L’espressione genica è associata anche alla demetilazione → la metilazione in corrispondenza della citosina dà assenza di trascrizione. Se un gene si esprime non è metilato. Per silenziare un gene, viene metilato.
• Micro RNA → nel nostro genoma circa 1000 geni codificano per miRNAs: questi non codificano per proteine ma hanno funzioni regolatorie, inibiscono l’espressione di altri geni; come?

Meccanismo d’azione: 1. Si parte da un RNAds, cioè doppio filamento, attraverso l’enzima DICER questa sequenza viene tagliata in frammenti; 2. Il breve frammento si associa a un complesso enzimatico RISC, complesso silenziatore della RNAi; 3. RNAds viene aperto da una elicasi e si ottiene un filamento di senso e uno di antisenso; 4. RISC è ora attiva e può scansionare molti mRNA nel citosol fino a trovarne uno complementare al filamento antisenso. Se l’appaiamento tra siRNA e mRNA è perfetto → RISC taglia l’mRNA e il frammento che ne deriva viene degradato dalle RNAsi. I micro RNA hanno la funzione di silenziare l’espressione genica poiché ci sono alcune regioni del genoma che codificano per brevi molecole di RNA e, se vengono individuate da RNAi, degradano tutti i mRNA complementari nel citosol. Il sistema delle RNAi inoltre si è evoluto per rispondere alle infezioni virali ed è legata anche a processi cellulari: formazione centromero e eterocromatina. Importante è che RNAi è usata per silenziare l’espressione genica di un gene.

Controllo proliferazione cellulare

Tipologia cellule:

• Perenni o post-mitotiche fisse: non si osservano mai mitosi, le cellule capaci di proliferare, di dividersi. Tra queste i neuroni, cellule del cristallino, del muscolo cardiaco e striato, adipociti, del glomerulo renale. Alcune possono duplicare il materiale genetico ma non dividersi.
• Stabili o post-mitotiche reservanti: rare mitosi; aumentano dopo stimolazione, hanno tasso mitotico molto basso; normalmente sono quiescenti e solo stimolate vanno incontro a rigenerazione. Tra queste gli epatociti durante rigenerazione epatica, fibroblasti, cellule endoteliali ed eritrociti.
• Labili vegetative intermitotiche: frequenti mitosi, hanno capacità mitotica continua e si replicano per tutta la vita. Tra queste le cellule del midollo osseo, c. epiteliali, dell’epidermide e delle mucose intestinali. Sono sostenute da una popolazione di cellule staminali.

Ciclo cellulare, dura da poche ore/24 ore/giorni: G0-Gap, riposo → G1 → S, sintesi del DNA 8 ore → G2 → M, mitosi 1 ora. Nella fase G0 la cellula si prepara alla sintesi di DNA con trasporto dei nutrimenti e ingrossamento della cellula. I° punto di check-point: G1-S → si decide se continuare o fermarsi per eventuali errori. S → duplicazione DNA; G2 → preparazione mitosi con sintesi proteica; II° punto di check-point: G2-M; M → mitosi. La durata dipende dalla fase G1, mentre le fasi S e M hanno durata standard: 8 ore e 1 ora. Il controllo molecolare del ciclo è attuato da cicline: proteine che compaiono/scompaiono nelle fasi del ciclo e le CdK: proteina chinasi ciclina dipendente che si attiva legandosi con la ciclina e formando un complesso e va a fosforilare i substrati usando ATP → complesso CdK-ciclina che controlla le fasi del ciclo. Le cicline sono di 4 tipi: 1. D: fase G1; 2. E: alla fine di G1 e S; 3. A: fase S, G2 e M; 4. B: fase G2 e M → andamento cicliche: vengono sintetizzate, raggiungono un picco, degradate e ritornano a 0. Esistono 4 tipi di CdK: CdK2, S-M, CdK4, G1-S, CdK1, M. Fasi di attivazione del complesso:

• CdK + ciclina
• CdK fosforilata e defosforilata sui residui amminoacidici
• Eliminazione inibitori CK1 = inibitori dei complessi ciclina chinasi

Controllo transizione G1-M: il punto più importante del ciclo è il punto R di restrizione che permette alle cellule di uscire dalla fase G1 ed entrare nella S → oggi chiamato Check-point G1-S. È necessaria la ciclina D, si lega a CdK → complesso CdK-ciclina. Questo complesso nella fase G1 ha come bersaglio la proteina rb: il retinoblastoma → fosforilata fa fare alle cellule il salto da G1 a S, non lega E2F; defosforilata lega un fattore E2F, fattore di trascrizione legato al promotore che spegne la trascrizione dei geni, e rimane quiescente in fase 0; in questo caso si ha controllo epigenetico dell’espressione genica poiché la cromatina si compatta, deacetilazione e metilazione degli istoni.

Controllo transizione G2-M: partecipano le cicline A e B. Con inibitori dell’attività chinasica il complesso CdK-ciclina non funziona; alcuni sono specifici altri no tra cui: p21, p27, p57, inibisce più complessi, e blocca diverse fasi del ciclo.

Regolazione cellulare e recettori

La regolazione cellulare può essere: 1. Autocrina: segnale prodotto e agisce sulla stessa cellula; 2. Paracrina: segnale prodotto, liberato, si lega alle cellule vicine; 3. Endocrina: ormone prodotto, rilasciato poi in circolo. I recettori sono di due tipi:

• Recettori di membrana: i segnali che ricevono rimangono esterni alla cellula e devono essere trasdotti per arrivare alla cellula → effettori → risposte trascrizionali, movimento, secrezione. Si suddividono in:

Recettori collegati alle G-proteins: tramite il doppio strato fosfolipidico per 7 volte vengono associate a G protein e sono correlate alla via della fosfolipasi gamma → recettore lega ligando → attivazione c-protein e la fosfolipasi c gamma idrolizza il fosfatidil inositolo bifosfato a diacil glicerolo, attiva la protein chinasi c: PKC, + inositolo 3 fosfato, mobilizza Ca intracellulare da RE e mitocondri; Ca è un secondo messaggero e media il movimento cellulare.

Recettori con attività chinasica intrinseca: sono recettori formati da 3 domini: 1. Dominio extracellulare che lega il ligando; 2. Dominio intra membrana; 3. Dominio intracellulare citoplasmatico → è formato da domini enzimatici detti domini tirosin chinasici e fosforilano l’AA tirosina; sono recettori autocatalitici ossia si auto fosforilano. A seconda dei ligandi abbiamo diversi recettori: EGF-R, recettore del fattore di crescita dell’epidermide; IGF-1 R, insulina receptor; NGF-R, recettore del fattore di crescita del nervo; PDGF-R, recettore del fattore di crescita derivato da piastrine; FGF-R, recettore del fattore di crescita dei fibroblasti; VEGF-R, recettore del fattore di crescita dell’endotelio vascolare. I recettori ad attività tirosin chinasica sono inattivi come monomeri poi si legano al ligando → dimerizzano → si autofosforilano → attivazione attività della tirosin-chinasi → fosforila i residui di tirosina dentro e fuori il sito catalitico → diventano siti appiccicosi per proteine del citosol. I recettori tirosin chinasici sono anche proto oncogeni = alterati in diverse forme di tumore. Le tirosine, fosforilate, richiamano proteine: 1. PLC-gamma: fosfolipasi c-gamma da cui si degrada il fosfatidil inositolo in I3P, promuove il rilascio di Ca dal RE, e DAG → attiva protein chinasi C → fosforila le proteine attivandole; 2. Proteina RAS, nella via MAP chinasi: il RAS è uno degli oncogeni più mutati nelle forme tumorali; vi è anche la proteina adattatrice SOS che si adatta alle tirosine fosforilate creando un ponte con la proteina RAS: essa lega il GTP, attiva, e il GDP, inattiva, e la proteina SOS permette questo scambio → RAS si attiva, è il segnale di inizio della cascata, e entra nella cascata, poiché una chinasi fosforila le chinasi successive e così via, di fosforilazioni MAP chinasi. Nella cascata fanno anche parte RAF, MEK e ERK. La cascata si spegne con la proteina GAP che idrolizza GTP a GDP; 3. Via della PI3K/AKT/mTOR: permette di capire come funziona la Rapamicina: un immune soppressore. PI3K + proteine fosforilate → si attiva PI3K → attiva Akt → attiva mTOR → vis che controlla la sintesi proteica per la cellula fondamentali per la replicazione.

Recettori sprovvisti di attività catalitica intrinseca: recettori presenti sulla membrana si legano a ligandi idrofilici. I principali sono i recettori per le citochine: la trasduzione avviene tramite il legame con 2 proteine dette JAK, cioè giano chinasi con due siti catalitici. Recettore attivo + chinasi → trasduzione STAT-JAK: proteina jak fosforila stat → dimerizza e raggiunge il nucleo.

• Recettori intracellulari: sono nella cellula e generano loro una risposta → legano segnali lipofili e danno risposte molto rapide. Recettore + ormone → complesso recettore-segnale va al nucleo. Qua il recettore è anche fattore trascrizionale. Le heat shock protein vengono allontanate e il complesso va al nucleo dove funge da fattore di trascrizione → dà mRNA e nuove proteine.

Fattori di crescita

• EGF: fattore di crescita epidermico; i recettori che legano questo fattore fanno parte della famiglia degli ERB-2.
• PDGF: fattore di crescita di derivazione piastrinica; è un mediatore del riparo delle ferite necessario per far proliferare i monociti, fibroblasti e cellule muscolari lisce.
• TGF beta: è mitogenico per le cellule muscolari lisce e vi induce proliferazione mentre nei cheratinociti e nelle cellule del SI inibisce replicazione e crescita cellulare.

Interazione cellule-cellule e cellule-matrice: le cellule vivono ancorate alla matrice extra cellulare una vicina all’altra e per proliferare hanno bisogno di spazio; la membrana della matrice è formata da: 1. Proteine fibrose strutturali; 2. Glicoproteine di adesione; 3. Sostanza fondamentale: proteoglicani e acido ialuronico. La forma più semplice è la membrana basale, collagene di tipo 4: vi si appoggiano tutti gli epiteli, sotto vi è matrice interstiziale, collagene + elastina + proteine diverse per tessuto. Le molecole di adesione comunicano con la matrice e sono di due famiglie diverse: eterofiliche e omofiliche, uguali tra di loro e legano due cellule uguali. Inoltre, assicurano il contatto cellula-cellula e cellula-matrice. Il nucleo prima di dividersi riceve segnali diversi: se sono positivi si divide, la cellula migra o si differenzia, se sono discordanti prevale il segnale di posizione. Ogni cellula ha un orologio biologico e dopo un certo n. di replicazioni diventa senescente, non succede nelle cellule tumorali.

Differenziamento cellulare: partendo da 1 genoma → cellule differenti. Il differenziamento opera con meccanismi di solito reversibili: 1. Repressione ed espressione geni; 2. Metilazione DNA; 3. Deacetilazione degli istoni. È stato anche fatto un esperimento di clonazione della rana di Gurdon: voleva clonare una rana da cellule differenziate; coltivò cellule della pelle e, estratto il nucleo, lo iniettò in una cellula madre, quindi inserì il nucleo diploide al posto di uno aploide → si sviluppò una blastula normale che dà un girino e dimostrò che da una cellula differenziata posso ottenere un organismo normale per riprogrammazione del DNA. Pose le basi per la clonazione.

Cellule staminali

Svolgono divisione asimmetrica poiché le due cellule che derivano dalla divisione sono differenti: una rimane staminale mentre l’altra diventa progenitrice, poiché via via dà origine a cellule differenziate. Però non è detto che siano sempre tutte asimmetriche. Esse sono in grado di generare cellule mature di tessuto/organo in cui si trovano e generare anche altre cellule staminali. Sono divise in base alla loro potenzialità: 1. Cellule totipotenti: possono dare origine a tutto il nostro organismo e si trovano nell’embrione nei primissimi stadi di vita; 2. Cellule pluripotenti: le ritroviamo quando l’embrione diventa gastrula e ha i 3 foglietti embrionali; 3. Cellule multipotenti: sono in alcuni tessuti dell’adulto come nel midollo osseo.

Clonazione terapeutica: secondo questa tecnica si potrebbe curare ad esempio un paziente infartuato prelevandone il nucleo da una cellula qualsiasi, inserito in un ovocita senza nucleo e stimolato → questo impara a riconoscere il nucleo e si divide dando la blastula → se ne prelevano le cellule staminali totipotenti, messe in coltura e stimolate mi danno una popolazione di mioblasti inoculati poi nel cuore del paziente e rigenererebbero l’area infartuata senza problemi di rigetto. Per etica è però una tecnica vietata dalla legge 40 del 2004 che vieta la clonazione e utilizzo di embrioni umani. Le cellule multi e pluripotenti ricevono segnali di differenziamento/proliferazione come FGF e VEGF e in base alla localizzazione che ricevono sapranno quale cellula diventare reprimendo/dereprimendo l’espressione di alcuni geni. Essendo vietato l’uso delle cellule staminali embrionali, si usano le staminali nell’adulto dal midollo osseo:

• Cellule emopoietiche: sono in nicchie protette dal midollo osseo e, se opportunamente stimolate, danno processo emopoietico e, in vitro, possono anche trans-differenziarsi in altre cellule ancora.
• Cellule delle cripte intestinali: tra un villo e un altro si formano le cripte all’interno delle quali vi sono le staminali che si dividono a dare una staminale e una progenitrice che prolifera e si differenzia in: cellule assorbenti, entero endocrine e globet che producono muco.
• Cellule dell’epidermide: sono poco numerose e sono a contatto con la membrana basale. Essendo un tessuto che si rinnova facilmente per esfoliazione, le staminali si dividono molto. La c. progenitrice migra verso l’alto e si differenzia a formare strato basale, spinoso e granuloso.
• Cellule del cordone ombelicale: è importante perché il trapianto di queste cellule nel midollo osseo dà meno problemi di rigetto. Circa il 40-50% dei pazienti affetti da leucemia/linfomi non dispone di donatore compatibile, così può utilizzare il sangue del cordone ombelicale. Si aspira sangue dal cordone e si raccoglie in una sacca sterile, inviata alla banca del cordone ombelicale per le analisi e la crioconservazione in speciali contenitori a -190°C.

Morte cellulare: ce ne sono 3 tipi con strutture diverse:

• Apoptosi, detto suicidio cellulare: la cellula condensa e diventa più piccola; è