Appunti del corso di Sintesi e analisi strutturale di biomolecole

Lezione 1

Introduzione alla produzione delle molecole

Questo corso riguarderà la produzione delle molecole e come è possibile studiarne la struttura. Le piccole molecole sono intese fino ad un peso molecolare di 1000-2000 (il peso molecolare è la somma dei pesi atomici che formano la molecola. Ricordare come si calcola).

Macromolecole

Per le macromolecole invece ci riferiamo a 3 classi:

• Proteine: è difficile distinguere la proteina dal peptide; oltre 100 amminoacidi generalmente ci si riferisce alla proteina.
• Oligonucleotidi: sono frammenti di DNA o RNA, il più delle volte hanno origine sintetica ma spesso possono avere un’origine di frammentazione di DNA di macromolecole.
• Oligosaccaridi (o polisaccaridi): oligo = piccolo, poli = tanti. Gli oligosaccaridi sono presenti nella cellulosa e nell’amido. La loro funzione è diversa: nella cellulosa ha una funzione strutturale, mentre nell’amido ha una funzione di riserva energetica. Gli oligosaccaridi servono per il riconoscimento della proteina.

Metaboliti

I metaboliti sono gli intermedi ed i prodotti del metabolismo, sono piccole molecole e possono essere distinti in primari e secondari. Per metabolismo intendiamo reazioni che consentono l’estrazione di energia dalle molecole esterne che entrano nella cellula (tale energia poi viene utilizzata nei processi ad esempio di costruzione di altre molecole).

Metaboliti primari

I metaboliti primari sono molecole del metabolismo primario (ad es. le molecole della glicolisi, catena respiratoria, ciclo di Krebs). Il metabolismo primario è necessario per la sopravvivenza, la crescita e la replicazione ed è formato da quella serie di reazioni che abbiamo in comune con tutti gli altri esseri viventi della Terra. Esempi di metaboliti primari: amminoacidi, carboidrati, trigliceridi, steroidi, nucleotidi, vitamine, acidi tricarbossilici.

Metaboliti secondari

I metaboliti secondari sono composti organici che non sono direttamente coinvolti nella normale crescita, sviluppo o riproduzione di un organismo e sono spesso limitati a una serie ristretta di specie. Le loro funzioni sono correlate a: difesa (difesa chimica di una pianta) e migliore adattamento all'ambiente. Il metabolismo secondario infatti riguarda tutte quelle reazioni che sono presenti solo in determinate specie viventi (es. la produzione di muco sulla pelle di una ranocchia, il colore rosso del peperoncino, la macchia gialla sulla ranocchia).

Il vantaggio del metabolismo secondario sta nel fatto che con la produzione di quella particolare molecola, le singole specie si ritrovano in una particolare nicchia ecologica. Come per esempio la ranocchia che ha la macchia gialla sulla sua pelle che rappresenta un segnale di pericolo perché è un colore molto acceso che spaventa gli altri animali e quindi non viene attaccata.

Il metabolismo secondario nel mondo vegetale

Il metabolismo secondario è molto predominante nel mondo vegetale, dove le piante si distinguono per esempio in base alle temperature o alla luce. È proprio grazie a ciò che possono difendersi dagli erbivori (produzione di spine, sapore amaro delle foglie). Perché le piante scelgono la difesa chimica o la comunicazione chimica? Perché non hanno la capacità di scappare.

Isolamento e caratterizzazione dei metaboliti secondari

1. Metodi di estrazione
2. Metodi di separazione (cromatografia)
3. Indagine strutturale (metodi spettroscopici)

Dall’estrazione si ottiene l’estratto vegetale (è una cosa che facciamo sempre con il caffè o il tè) questo poi viene frazionato (fase 3). Se si vuole frazionare e si ha una miscela, si deve isolare in modo tale da avere un prodotto puro cosicché si possa studiare.

Cromatografia

Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che ha lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per consentire un risultato qualitativo e riconoscimento quantitativo. Queste tecniche si basano sulla distribuzione differenziale dei vari componenti tra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l'altra chiamata fase mobile o fase eluente, che scorre continuamente verso la fase fissa.

Tecniche spettroscopiche per l'indagine strutturale

• Risonanza magnetica nucleare (NMR)
• Spettrometria di massa
• Diffrazione di raggi X
• Dicroismo circolare / spettroscopia UV

Le tecniche spettroscopiche si basano sul fatto che abbiamo delle molecole in soluzione e le irradiamo con una radiazione elettromagnetica. Si va poi a vedere se c’è differenza tra l’onda elettromagnetica incidente e quella risultante: se sono uguali allora non c’è interazione e quindi non ci sono informazioni da analizzare. Se invece entra una cosa ed esce con uno o più parametri differenti, allora quella modifica ha sottolineato un’interazione. In quella differenza variata è contenuta l’informazione strutturale. Lo studio della spettroscopia consiste proprio nell’andare a vedere la modifica subita che informazione ci dà sulla molecola.

Lunghezza d'onda

La lunghezza d’onda è la distanza tra due punti successivi e si misura in nanometri, micrometri ecc. L’intensità dell’onda è data da quanto è alta e possono esserci radiazioni più intense o meno intense a parità di lunghezza d’onda.

L’energia che porta la radiazione elettromagnetica è data dalla relazione:

E= h x V

h = costante di Plank

λ = lambda cioè la lunghezza d’onda

V = frequenza = (c = costante / λ)

Quindi deduciamo che l’energia è inversamente proporzionale alla lunghezza d’onda. Quindi, ad esempio, tra l’UV e il visibile porta più energia l’UV perché ha frequenza maggiore; invece l’infrarosso rispetto al visibile porta meno energia.

Ricerca di nuove molecole biologicamente attive

Perché c'è una costante ricerca di nuove molecole biologicamente attive? Essenzialmente per i seguenti motivi:

• Farmacologico-terapeutico
• Diagnostica analitica
• Composti modello (per una comprensione dei meccanismi dei processi biologici o delle strutture di altre biomolecole)

L'identificazione di biomolecole "utili" (ad es. un nuovo farmaco) può derivare da:

• Un random screen di prodotti naturali
• Un random screen di prodotti sintetici
• Progettazione razionale cioè non si saggia casualmente tutto ciò che abbiamo ma decidiamo di sintetizzare una molecola che ha un bersaglio ben definito
• Caso fortuito

Random screening di prodotti naturali

Questa tecnica consiste semplicemente nel controllare, con test appropriati, l'attività biologica di tutti i prodotti che capita di venire a portata di mano, indipendentemente da qualsiasi considerazione razionale. I prodotti naturali, ad esempio, hanno sempre dimostrato di essere una fonte estremamente importante di molecole dotate di attività biologica. Da un'analisi dei risultati ottenuti da uno screening di circa 10.000 prodotti chimici è possibile dedurre la probabilità di trovare un composto dotato di interessanti proprietà farmacologiche. Solo 1 esce fuori su 4 risulta nella produzione di un prodotto commercializzabile.

Tassolo: un buon risultato di uno screening!

Taxol (o tassolo) è una pianta molto comune nei nostri giardini: non perde le foglie e produce bellissime bacche rosse. La prua di Robin Hood era fatta di legno di taxol, come tutti gli archi di qualità nell'Inghilterra medievale. Nel 1962 un estratto di un campione della corteccia di Taxus brevifolia rivelò proprietà citotossiche. Il principale componente attivo è stato identificato come taxol. All'inizio degli anni '90 fu immesso sul mercato come potente antitumorale.

Non si poteva però avere questa molecola da una fonte naturale (corteccia della pianta) perché significava scortecciare una pianta intera per ottenere 1-2 gr. di tassolo. Si è quindi pensato di ricorrere ai chimici sintetici. Le prime due sintesi proposte risultavano essere 40 reazioni ma dal punto di vista economico già un farmaco prodotto da 20 reazioni ha un costo esorbitante. Ad oggi il tassolo è detto semi-sintetico. Fu praticamente visto che piante geneticamente vicine al tassolo, producono in grosse quantità dalle foglie una sostanza molto simile. Tale molecola con 5-6 reazioni di modifica a basso costo, poteva essere trasformata in tassolo.

Progettazione razionale di farmaci

Oggi non siamo più costretti a fidarci solo della fortuna: conosciamo metodi che consentono la progettazione razionale delle molecole con attività biologica. Partendo dalla patologia e utilizzando conoscenze mediche, fisiologiche, biochimiche, farmacologiche e chimiche possiamo arrivare all'identificazione di una proteina (recettore/enzima) che ha un ruolo chiave nella patologia. La regolazione o l'inibizione di questo recettore dovrebbe avere risultati positivi sulla patologia.

In Rational Planning tutte le tecniche di indagine strutturale sono sempre più coinvolte:

1. Scoprire la conformazione del sito enzimatico-proteico responsabile delle interazioni con il substrato.
2. Sulla base di queste informazioni, progettare la conformazione adeguata della molecola del farmaco.

Questa attività di ricerca è definita come "DRUG DESIGN".

• È necessario conoscere la struttura del bersaglio da colpire (enzima o recettore).
• È possibile progettare, tramite computer, un ligando perfettamente corrispondente.
• Le modifiche conformazionali dovute all'evento vincolante dovrebbero essere tenute in debita considerazione.
• La valutazione dell'energia di interazione è possibile.

Enzimi e inibitori

I processi biologici possono quindi essere controllati o dalla modulazione dell'attività di un enzima o dall'interazione tra una molecola appropriata e il suo recettore. Un inibitore enzimatico impedisce all'enzima bersaglio di catalizzare la sua reazione specifica. Esempio tipico: la penicillina e i suoi derivati agiscono in questo modo. I batteri sono dotati di una parete cellulare rigida formata da catene di un polimero lineare (composto da unità alternative di N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico unite da legami glicosidici) collegati tra loro da brevi catene peptidiche. La penicillina inibisce in modo irreversibile l'enzima che catalizza questa reticolazione; le rigide pareti cellulari non possono essere formate e la pressione interna fa letteralmente esplodere i batteri. Le cellule umane non sono dotate di pareti cellulari: la peptidoglicano transpeptidasi non è presente nel nostro organismo e la penicillina non interferisce con altri processi metabolici.

Farmaci come agonisti e antagonisti

Un processo biologico coordinato da un sistema messaggero-recettore chimico può invece essere modulato con l'uso di agonisti o antagonisti.

• Un agonista possiede una struttura adeguata per interagire con un recettore, spesso mimando con una grande efficacia l'azione di un composto che è in natura coinvolto in quel processo biologico.
• Gli antagonisti si legano al recettore provocando una catena di eventi che non determinano l'azione biologica normalmente innescata dallo stesso recettore dopo l'accoppiamento con la molecola di segnalazione.

Esempi

Il progesterone innesca la sua azione biologica legandosi a una specifica proteina recettrice. Il complesso ormone/recettore che si forma migra dal citoplasma al nucleo cellulare dove interagisce con il DNA modulando l'espressione di determinati geni. Il recettore può anche legarsi ad altre molecole: per esempio, medrossiprogesterone acetato e noretindrone. Il complesso è in questi casi ancora più stabile di quello che si forma con l'ormone naturale e svolge qualitativamente la stessa azione biologica. Medroxyprogesterone acetato e noretindrone sono agonisti del progesterone.

L'anti-ormone RU-86 si lega al recettore per il progesterone. La sua struttura spaziale non è tuttavia corretta; il complesso non è in grado di attivare i processi che promuovono l'impianto nell'utero dell'uovo fecondato. RU486 è un antagonista del progesterone; la sua somministrazione causa la fine della gravidanza.

Lezione 2

Tipi di sintesi

Le biomolecole "utili" (ad esempio farmaci) possono essere prodotte per:

• Sintesi chimica
• Biosintesi (processi biotecnologici e reazioni enzimatiche)
• Sintesi mista (enzimatico-chimica)
• Isolate da fonti naturali

Una reazione chimica è un processo attraverso il quale si formano e si rompono i legami chimici. È importante calcolare la resa di una reazione che indica la frazione (in %) delle moli del reagente che si trasformano in prodotto. Resa di reazione = (moli del prodotto / moli del reagente) x 100.

Sintesi chimica di molecole organiche

La sintesi chimica di una molecola organica avviene con una o più reazioni (sintesi multistadio) tra varie molecole di reagenti che portano a una variazione della struttura molecolare. Prima di iniziare una sintesi bisogna prendere in considerazione che alcuni fattori come:

• Una buona progettazione della sequenza di reazioni da fare (analisi retrosintetica).
• Il numero delle reazioni da fare (meglio progetto con poche reazioni).
• La resa di ciascuna reazione e resa finale (meglio se la resa è alta).
• Le condizioni di reazione (evitare condizioni difficili e co-reagenti costosi).
• Le condizioni di purificazione (ogni fase o tutto alla fine) (meglio reazioni che producono sottoprodotti facilmente eliminabili).
• La complessità ed il costo complessivo.

Analisi retrosintetica

Per analisi retrosintetica si definisce una serie di reazioni chimiche che ci permettono di partire da un composto facilmente reperibile a bassissimo costo, per la creazione del nostro composto finale. Quindi si procede al contrario: si parte dal prodotto finale e ci si chiede da quale composto più semplice può essere esso preparato.

FGI = Functional Group Interconversion

Questo è un esempio di analisi retrosintetica (trasformazione di gruppi funzionali) dove la freccia doppia indica che la reazione deve essere letta nel verso opposto. In realtà si potrebbe fare direttamente la bromurazione, in modo tale da far legare Br in posizione 4, ma quando l’azoto NH₂ è libero la bromurazione non avviene. Quindi bisogna “bloccare” l’azoto prima trasformandolo momentaneamente in ammide (successivamente verrà rimosso).

Sintesi multistadio lineare

Il prodotto di ogni reazione diviene il reagente della reazione successiva. Quindi c’è anche una sequenza temporale nelle reazioni. Esempio: costruzione di un peptide, aggiungendo un amminoacido alla volta al peptide in crescita. La resa totale di una sintesi multistadio è data dal prodotto delle rese delle singole reazioni:

Resa totale = (0.7 x 0.8 x 0.5) x 100 = 28% (Calcolata per il prodotto D)

Sintesi multistadio convergente (o a blocchi)

Oltre alla reazione lineare è possibile eseguire anche una reazione di tipo convergente dove si fanno avvenire prima le reazioni che da A portano a B, da parte si esegue la reazione che da C porta a D ed infine si esegue la reazione tra B e D che ci dà E. Esempio: una sintesi convergente è usata nella costruzione di peptidi con elevato numero di amminoacidi e può portare al prodotto finale con delle rese più elevate.

Analisi retrosintetica con formazione di legami C-C

Divagando... le reazioni dove c’è la formazione di legame C-C ci permettono di poter far crescere la nostra struttura. La formazione C-C porta delle complessità di scheletro carbonioso più complesse, mentre invece la scissione C-C è più semplice.

Se ad es. si fa una reazione di combustione (quindi brucio) del pentano:

C₅H₁₂ + 8O₂ → 6H₂O + 5CO₂ + calore

È una reazione di ossidazione: l’O (è l’ossidante, si riduce passa da 0 a -2 quindi accetta e-). Il C si ossida. Il fatto che il carbonio si ossida è molto importante perché è una reazione su cui si basa la nostra vita: infatti all’interno delle nostre cellule traiamo energie da reazioni metaboliche (cataboliche in questo caso) tramite ossidazioni del carbonio. Mangiamo carbonio ridotto e lo trasformiamo in carbonio ossidato. L’accettore finale di elettroni è l’ossigeno che respiriamo.

Comprendere l'ossidazione e la riduzione

Divagando... Come riusciamo a capire, guardando una molecola prima e dopo, se un carbonio è più ridotto o più ossidato?

1° esempio: (acido acetico) (anidride carbonica)

Nell’acido acetico il C più ridotto è CH₃, il più ossidato è CO₂. Tra CO₂ ed il C carbonilico è più ossidato CO₂. Perché? Un carbonio più legami ha con H e più è ridotto, mentre un C più legami ha con l’O (o con un eteroatomo più elettronegativo) e più è ossidato.

2° esempio: (ammina CH₃-NH₂) (metanolo)

Il carbonio nell’ammina è legato ad un eteroatomo (N) più elettronegativo del C. Si contano il numero di H a cui un carbonio è legato, se il numero di H aumenta C si riduce se il numero di H diminuisce C si ossida.