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Biochimica lezione 1

Dogma centrale della biologia

Dogma centrale della biologia: nelle cellule umane si va da DNA a proteine, passando per RNA, poi ci sono organismi che possono fare processo inverso, es retrovirus, ma il dogma è che c’è una direzione univoca. Quante proteine contiene una cellula? Circa 5 mila-6 mila, e i trascritti quanti sono? Circa 40 mila, chi codifica per una proteina nel trascritto? Solo RNA messaggero, che tra tutti i trascritti è solo l’1% o meno.

Le proteine sono 5 mila circa, ma la cellula non esprime tutte quelle proteine insieme, a seconda degli stimoli, uno stimolo extracellulare è qualcosa che provoca una risposta nella cellula. Il DNA si replica grazie ad una serie di enzimi tra cui la DNA polimerasi, il DNA viene trascritto: il DNA è a doppia elica, il trascritto a singola elica complementare a un filamento e identico all’altro, tutto ciò avviene nel nucleo.

Prodotto RNA, questo esce nel citoplasma, si forma il ribosoma e avviene la traduzione, la proteina deve poi essere foldata, impacchettata, cioè bisogna dargli una struttura tridimensionale per svolgere il suo ruolo nel reticolo endoplasmatico. Quante proteine sono coinvolte in questi processi? Circa 2 mila, proteine per la replicazione, fattori per la trascrizione. Prodotto RNA messaggero, si produce il trascritto primario, ma nell’uomo c’è la regolazione data dallo splicing: da un trascritto posso produrre proteine diverse, che saranno tutte isoforme della stessa proteina.

Oltre allo splicing, c’è la regolazione dell’esporto: altre proteine che si legano per portarlo fuori, per essere tradotto ci sono sequenze segnale che dicono al ribosoma dove partire. Esistono almeno 3 RNA: ribosomiale, acidi nucleici a singola elica che si associa alle proteine del ribosoma, perché il ribosoma ha bisogno di un acido nucleico? Il ribosoma, per incorporare il filamento, deve riconoscere da dove iniziare a leggere, perché la proteina degli eucarioti inizia da una metionina codificata dal codone AUG, ma in un RNA non c’è un solo AUG, come fa il ribosoma a dire parto da qui? Deve trovare l’open reading frame, punto da cui il ribosoma parte per fare la proteina intera.

Tipi di RNA e codice genetico

Altro RNA è il tRNA, RNA di trasporto degli amminoacidi, quanti ce ne sono? Il codice genetico è degenerato, ci sono più triplette che codificano per uno stesso amminoacido, perché? I raggi UV possono causare dimeri di timina, perché il raggio UV interferisce sul DNA, si rompe il legame 5’-3’ fosfodiestere, se si rompe il legame lì, abbiamo estremità 5’ o 3’ libero, interviene la DNA polimerasi, la polimerasi ha tre attività: una polimerasica, correttore di bozze o proof reading in direzione 5’ 3’, quindi controlla di aver messo le basi giuste, riparo.

La polimerasi dove si lega? Al 3’, quindi arrivano le polimerasi, una si lega ad un 3’ libero, un’altra ad un altro. La direzione della polimerasi è 5’-3’, siccome deve riparare, la prima cosa che fa è quella di eliminare tutto e copiare sulla base della base che c’è nell’altro filamento, la mutazione c’è quando la polimerasi sbaglia, le mutazioni sono più frequenti negli anziani perché le polimerasi sono meno efficienti.

Quindi per ogni buco si attacca una polimerasi, elimina, mette il nucleotide corretto e chiude. Il tumore si ha perché si ha una mutazione spontanea dovuta al riparo scorretto, per questo gli anziani sviluppano tumori più facilmente. Quindi ci sono almeno 20 tRNA nel citosol, poi almeno altri 20, perché nella cellula c’è il DNA genomico e quello mitocondriale, abbiamo più mitocondri in una cellula, a seconda della cellula abbiamo più o meno copie del DNA mitocondriale.

DNA mitocondriale

Il DNA mitocondriale si eredita dalla madre, quindi se la mamma è un’atleta, lo saremo anche noi, se la mamma ha una mutazione a livello del DNA mitocondriale, la avremo anche noi. Perché si eredita dalla mamma? È ancora oggetto di studio, la cellula uovo femminile è la cellula più ricca di DNA mitocondriale, se uno spermatozoo la feconda, ha tanti mitocondri ma la quantità è inferiore, quindi la cellula uovo attiva enzimi che degradano il DNA mitocondriale maschile, ma ci sono più risposte.

Il DNA mitocondriale è di origine batterica, infatti è DNA circolare non protetto, più esposto a mutazioni: quello che avevamo alla nascita è molto diverso da quello che abbiamo ora. Ci sono poi gli mRNA che sono la quota più bassa, ma ci sono anche altri tipi di RNA: small nuclear RNA, miRNA.

Gene, promotore e unità trascrizionale

Cos’è un gene? È un insieme di nucleotidi che comprende introni ed esoni, che produce un trascritto, ma un gene funziona sempre? No, chi regola il gene? Il DNA stesso tramite proteine di regolazione che si legano al DNA nelle sequenze di regolazione che stanno a monte ma anche a valle ma anche in mezzo agli introni, quindi c’è una regione che si chiama promotore, regione regolatoria, che sta o prima delle sequenze o negli introni o alla fine, quanto è lungo un promotore non è possibile definirlo.

L’unità trascrizionale comprende gene e promotore. Il promotore regola l’espressione del gene sia in maniera positiva sia negativa, inibizione. Il DNA mitocondriale è policistronico, se ho DNA circolare ho una polimerasi che si attacca in un punto e produce un unico trascritto, quindi in quel trascritto ci sono tutti i geni che devono essere codificati in quel trascritto, così è anche il DNA procariotico. Il DNA genomico degli eucarioti è monocistronico: da un gene una proteina, a parte quando abbiamo splicing, un gene più proteine.

Attività trascrizionale e componenti della trascrizione

Per attività trascrizionale si intende la velocità di sintesi di RNA: numero di trascritti sintetizzati nell’unità di tempo e riflette la velocità di inizio al sito di origine della trascrizione. Le componenti basali servono al reclutamento dell’RNA polimerasi, permettendo alla trascrizione di iniziare: la maggior parte dei geni ha la polimerasi già lì sul gene ma non funziona, devo reclutare qualcosa che attivi la polimerasi, di solito le componenti basali fanno parte del complesso di pre inizio, quindi la polimerasi può essere reclutata ma anche essere già lì sul promotore, quindi per funzionare servono le componenti basali per dare segnale di partenza.

I componenti costitutivi ci sono sempre, se tolgo quella proteina, la trascrizione non avviene più, servono a controllare l’efficienza di trascrizione, quando si parla di trascrizione basale, un gene ha sempre un minimo di trascrizione, poi posso andare a regolare in modo da accelerare o diminuire questa trascrizione, ma non andrò mai a 0, i componenti costitutivi servono a definire i livelli basali dell’attività trascrizionale di ogni gene. I componenti regolatori alterano l’efficienza dell’inizio di trascrizione, aumentando o diminuiscono l’attività trascrizionale di un determinato gene.

Tutti i fattori di trascrizione legano il DNA? No, alcuni interagiscono fisicamente con esso, altri interagiscono con i fattori legati al DNA, quando una proteina interagisce produce una modifica conformazionale che cambia l’attività, gli elementi che legano direttamente il DNA si chiamano elementi che agiscono in cis, gli altri che interagiscono con i fattori legati al DNA si chiamano elementi che agiscono in trans.

Esistono una serie di RNA polimerasi con specificità diverse: la polimerasi 2 si siede sui geni che codificano per un mRNA, la 3 si lega ai geni che servono per trascrivere il tRNA, quindi hanno una specializzazione, la 1 lega i geni che codificano per rRNA.

Fasi della trascrizione

Come procede la trascrizione? Tre fasi. Una fase di legame della polimerasi, se il gene non ha l’RNA polimerasi reclutata, cosa fa la polimerasi? Deve aprire una bolla da cui inizia la trascrizione e inizia a produrre l’mRNA, fase di inizio, poi fase di allungamento e fase di terminazione. Si lega una polimerasi alla volta? No, appena una libera il sito di inizio, se ne lega un’altra.

L’RNA polimerasi non ha bisogno di primer per partire, la DNA polimerasi sì, quindi al suo interno è in grado di fare una piccola denaturazione dell’elica che deve essere srotolata, come fa a capire dove deve iniziare? Il complesso di inizio si assembla sempre nello stesso punto in un gene, se c’è la TATA box viene riconosciuta quella, dove si assembla il complesso di pre inizio è il sito di inizio della trascrizione, con la sequenza AUG, quindi nella bolla inizia sintesi di RNA, si apre la bolla e la polimerasi inizia a sintetizzare su uno dei due filamenti, uno dei due a seconda dei geni, e poi inizia l’allungamento.

Nei procarioti c’è un promotore a -35 o -10, +1 è sito di inizio della trascrizione, il fattore sigma è un fattore di inizio della trascrizione, quindi posso avere la polimerasi legata, ma senza il fattore sigma non inizia la trascrizione. Tra tutti i geni, le sequenze a -35 e -10 sono abbastanza simili, perché i batteri hanno un unico fattore di trascrizione che è il fattore sigma che si lega sul -10 con la porzione grossa e con la coda sul -35.

La polimerasi prende nucleotide, stacca il gruppo fosfato e lo attacca costituendo il nuovo filamento costituendo legame 5’-3’ fosfodiestere. Ci sono una serie di fattori sigma, ognuno specializzato in qualcosa, ad esempio, uno interviene in caso di shock termico. Si lega la polimerasi, si crea la bolla, inizia a trascrivere su uno dei due filamenti finché non viene trascritto tutto l’RNA, come termina la trascrizione?

Terminazione nei procarioti

Nei procarioti ci sono due meccanismi: terminazione Rho dipendente o terminazione Rho indipendente. Meccanismo Rho dipendente: la polimerasi arriva alla fine del gene, la proteina Rho è un anello che entra nell’RNA nascente e prende contatto con la polimerasi, se prende contatto con essa, c’è cambiamento conformazionale, blocco l’attività della polimerasi e si stacca l’RNA.

Su altri geni invece Rho non è stata trovata, come termina la trascrizione? Alla fine di questi geni, l’RNA nascente ad un certo punto, facendo il complementare, abbiamo una sequenza che induce una forma di forcina, impedendo l’avanzamento della polimerasi, quindi la polimerasi si stacca. Come si forma la forcina? C’è regione ricca di G e C che per diminuire l’entropia si appaiano.

Trascrizione negli eucarioti

Negli eucarioti, la questione è un po’ più complessa: sito di inizio della trascrizione, regioni regolatorie, il sito di inizio è il sito dove si assembla il complesso di inizio, ma non dove inizia la trascrizione: ci sono elementi regolatori anche dopo. Il promotore è più complesso di quello procariotico, abbiamo molte regioni su cui si lega qualcosa.

Es: gli acidi biliari, contenuti nella bile che sta nella cistifellea, sono anfipatici, fatti da colesterolo idrossilato. Gli acidi biliari sono tensioattivi, formano una micella dentro cui mettono i trigliceridi che poi possono essere assorbiti nell’intestino, il 5% di acidi biliari vengono eliminati tramite le feci, il resto assorbito nell’ileo. La sintesi degli acidi biliari dipende dalla colesterolo 7 alfa idrossilasi, gli acidi biliari che tornano al fegato devono inibire questo enzima.

Perché questo enzima viene spento dagli acidi biliari? Quando arrivano gli acidi biliari, un istone deacetilasi migra nel nucleo andando a togliere i gruppi acetili dagli istoni e il gene si reprime perché si compatta la cromatina, quindi i fattori di trascrizione non possono più accedere, cromatina acetilata è aperta.

Negli eucarioti o ho già l’RNA polimerasi o devo reclutarla, in ogni caso, non funziona da sola, devono essere reclutati altri fattori: la polimerasi ha una coda carbossiterminale su cui ci sono dei siti di fosforilazione, le proteine reclutate sono in grado di fosforilare la coda, la prima fosforilazione fa cambiare conformazione alla polimerasi, la seconda la fa spostare.

Oltre a questi fattori, si recluta il complesso del mediatore che serve a prendere contatto con tutti gli altri elementi regolatori che si trovano a migliaia di paia di basi di distanza, poi sono reclutati rimodellatori della cromatina che la acetilano per andare ad aprirla e consentire la trascrizione. La trascrizione basale non richiede tutte queste componenti, solo quando devo accelerare o rallentare la trascrizione di un determinato gene.

Modificazioni post trascrizionali

Mano a mano che questo avviene, si inizia a trascrivere, si mette un capping che consente di proteggere da una eventuale nucleasi che potrebbe tagliare questo filamento.

Una volta che sta avvenendo la trascrizione, sull’mRNA devono avvenire modificazioni post trascrizionali e lo splicing, la prima modificazione è il capping all’estremità 5’ ovvero aggiungere un segnale, è una modificazione chimica: si metila una guanosina che diventa 7 metil guanosina, quindi ho aggiunto il capping che protegge l’mRNA.

Altra modificazione: quando finisce la trascrizione come faccio a dire la cellula che quello è un mRNA per mandarlo nel citosol per essere tradotto? Si aggiunge la coda di poli adenilazione, tutte adenine, poliA, circa 200, solo all’mRNA, mano a mano che si arriva alla fine della trascrizione, c’è una sequenza che richiama proteine che tagliano e attaccano questa sequenza di poliA. L’mRNA viene poi legato da altre proteine che lo portano nel citosol.

Terminazione negli eucarioti

Come termina la trascrizione negli eucarioti? Due modelli:

• Torpedo model, quando l’RNA passa sulla sequenza per il segnale per la poli adenilazione, si legano le proteine che tagliano subito dopo la sequenza di poli A e aggiungono le adenine e rimane questo mRNA che non ha più il capping, arriva una nucleasi che lo degrada fino a toccare la polimerasi modificandola conformazionalmente, così perde la polimerasi e si stacca.
• Modello allosterico, abbiamo sempre poli A, l’RNA polimerasi riconosce che un pezzo è stato tagliato e quindi è stato visto che questo pezzo tagliato si ripiega e forma una sorta di gomitolo che blocca la polimerasi e la fa staccare, il pezzo tagliato viene poi degradato.

Splicing e splicing alternativo

C’è poi lo splicing, se ho un trascritto primario di RNA, questo comprende sia introni che esoni, il trascritto maturo deve essere formato solo da esoni, porzione codificante. Nel trascritto maturo si tengono le regioni 5’ non tradotta e 3’ non tradotta perché sono quelle che scortano l’RNA nel citosol.

Come avviene lo splicing alternativo? Ci sono sequenze che lo inducono, c’è un’adenina che fa attacco nucleofilo ad una guanina formando un cappio, quindi un OH che è rimasto libero si lega ad un ad un fosfato, si perde un introne e si attacca l’esone all’altro esone. Per fare questo, sono coinvolte 150 proteine che atterrano sull’introne e favoriscono la reazione, servono per riconoscere per complementarietà le strutture necessarie, riconoscono le guanine in fondo e l’adenina in mezzo.

Nel 75% dei geni circa, avviene lo splicing alternativo: posso produrre una serie di RNA maturi, se ho ad esempio esone 1, esone 2 e esone 3, posso produrre RNA 1-2, 2-3, 1-3, oppure abbiamo casi di introne mantenuto. Ci sono siti di splicing strong o siti weak, dove lo splicing può o non può avvenire, dipende dalla sequenza degli introni.

Es: la troponina, trascritto primario, con uno splicing posso avere mRNA dell’alfa troponina T o con un altro mRNA della beta troponina T.

RNA editing e apolipoproteine

Lo splicing è un meccanismo di regolazione post trascrizionale, altro esempio è l’RNA editing, di cui c’è un solo esempio. Le apolipoproteine, le lipoproteine sono trasportatori di acidi grassi e trigliceridi nel nostro organismo poiché il plasma è idrofilico, le apolipoproteine sono la porzione proteica di queste lipoproteine, quando mangiamo l’intestino produce i chilomicroni che prendono i trigliceridi, nel tessuto adiposo i trigliceridi passano lì e liberano i chilomicroni che lasciano colesterolo nella lipoproteina che diventa LDL, low density lipoprotein, che va in periferia e deposita il colesterolo.

Anche il fegato produce lipoproteine a bassissima densità, ricche di trigliceridi. Se mangio una torta e non ne ho bisogno, i trigliceridi sono accumulati per riserva, ma lo zucchero viene trasformato in acido grasso attraverso il fegato e sono trasportati con le very low density lipoprotein, andando a costituire tessuto adiposo.

Sia i chilomicroni sia il fegato hanno come principale apolipoproteina l’apoB100, solo che l’intestino, pur avendo lo stesso gene, produce una proteina tronca, che è apoB48. Il gene sono 26 esoni, nel fegato, se faccio traduzione di questa ho l’apoB100 che serve a mandare l’eccesso di energia al tessuto adiposo sotto forma di trigliceridi, l’intestino, dovendo produrre i chilomicroni che sono molto più grossi delle very low density lipoprotein, ha bisogno di questo gene per l’apoB100, ma nell’esone c’è una tripletta CAA che nell’intestino viene convertita in UAA, perché nell’intestino c’è la citidina deaminasi che deamina la citosina e la fa diventare uracile, quindi quando il messaggero va nel citosol degli enterociti, quando arriva lì, il ribosoma si ferma generando una proteina tronca: apoB48.

Lezione 2: traduzione

Negli eucarioti il codone di inizio è sempre AUG e l’amminoacido è sempre metionina, chi sono gli attori della traduzione? mRNA e ribosomi, leggermente diversi tra procarioti ed eucarioti anche se fanno la stessa cosa, cambia la massa molecolare, circa 2 milioni e mezzo per i procarioti e il doppio negli eucarioti. Sono come un panino dell’hamburger con una parte superiore grande e una piccola, questa è la parte proteica, i ribosomi sono associati a rRNA, diversi se consideriamo eucarioti e procarioti. Altro attore nella traduzione sono i tRNA, normalmente rappresentati a trifoglio,