Appunti Biofabbricazione e Bioprinting

MODULO I 1.EVOLUZIONE DELLA BIOFABBRICAZIONE

La biofabbricazione è una tecnologia per la creazione di costrutti biologici con varie tecniche.

Il processo di biofabbricazione si sviluppa a partire dal 1800 e con la scoperta delle cellule staminali (1978) si

ha una grande evoluzione dei biocostrutti.

Tra il 1980 e il 2000 vengono sviluppate le prime tecniche di deposizione organizzata di materiale plastico, che

pone le basi per le applicazioni della biostampa.

Nel 1988 si sviluppa il Cytoscribing, ovvero il 1° processo di riposizionamento cellulare organizzato.

Gli inizi degli anni 2000 hanno visto i primi esperimenti significativi nella biostampa.

I ricercatori hanno iniziato a esplorare la stampa 3D per creare tessuti biologici complessi, utilizzando

inchiostri biologici (bio-inks) composti da cellule viventi. Questo periodo ha segnato la nascita vera e propria

della biostampa.

Dal 2010 fino ad oggi la biostampa si è evoluta dalla creazione di tessuti semplici (pelle) alla creazione di

strutture + complesse (organi vascolarizzati).

I progressi nelle tecniche di stampa, nella biologia sintetica e nella robotica hanno spinto oltre i limiti

precedenti.

L’ottimizzazione dei processi di biostampa e l’esplorazione dei diversi materiali di supporto cellulare, naturali e

sintetici, sta assumendo un ruolo chiave per la realizzazione di costrutti funzionali e duraturi.

OBIETTIVI E APPLICAZIONI

La biostampa può essere utilizzata per 2 macro-obiettivi:

1) MEDICINA RIGENERATIVA di tessuti e organi

2) MODELLI TISSUTALI= riesce a riprodurre dal punto di vista strutturale e funzionale (almeno in parte) un

organo o un tessuto, ma non ha lo scopo di essere impiantato.

Viene impiegato in applicazioni di drug test, test di tossicità e modellazione di patologie.

Sia la medicina rigenerativa sia i modelli tissutali sono legati al concetto di simulazione con il DIGITAL TWIN,

ovvero un database che contiene informazioni che il modellista ha estrapolato dall’entità reale.

Questo permette di replicare caratteristiche principali dell’organo/tessuto target e andare in loop (invece di

andare direttamente alla fabbricazione per comprendere le caratteristiche ottimali e poi tornare indietro, con il

digital twin si possono stimare dalla simulazione le caratteristiche ottimali e passare alla fabbricazione in un

secondo momento). Questo permette anche di risparmiare tempo.

PROCESSI DI BIOFABBRICAZIONE

MOLDING: processo in cui si crea lo stampo in cui poi si deposita l’hydrogel

➢ CELL-SEEDING: viene usato un substrato biodegradabile e biocompatibile dove vengono seminate le

➢ cellule

BIOPRINTING: viene stampato direttamente il costrutto contente le cellule, permettendo di

➢ semplificare il processo per l’operatore, renderlo + efficiente e ridurre il rischio di contaminazione.

Durante una stampa di questo tipo si devono tenere in considerazione vari fattori: contaminazione,

Temperatura (e risposta del materiale a tale T), velocità di stampa, viscosità e sforzi di taglio a cui sono

soggette le cellule.

Ecc...

➢

Prima di passare alla biostampa (fabbricazione), si deve avere chiaro l’obiettivo per capire qual è la tecnica +

adatta.

ESEMPIO APPLICAZIONE: REALIZZAZIONE DELLA CAMERA CARDIACA PER VALUTARE GLI EFFETTI DI UN

FARMACO SULLA POTENZA CONTRATTILE DEI CARDIOMIOCITI

Nello stampo è stato inserito un catetere con attaccata una sfera (palloncino) realizzata in stampa 3D in cui

può essere insufflata aria. Il catetere viene immerso in un hydrogel costituito da cellule e collagene.

Sulle pareti dello stampo viene messo agarosio per favorire l’adesione

cellulare al palloncino.

Dopo 24h si inizia a vedere l’adesione cellulare sul palloncino, mentre

dopo 2 settimane si inizia a vedere la contrazione.

Sono serviti 2 mesi di tentativi per capire quali fossero i materiali migliori

e la geometria + adatta (non sempre la geometria complessa è quella +

utile, ma dipende dall’applicazione).z

2.DALLA STAMPA 3D TRADIZIONALE AL BIOPRINTING

FASI DEL PROCESSO DI

STAMPA 3D tradizionale

Le prime 4 fasi prevedono l’utilizzo di un software:

1) FASE 1: creazione modello 3D CAD a partire da misurazioni meccaniche o ottiche, ottenute da imaging

medico (TAC o RM) o scanner ottici 3D.

Il modello CAD può essere archiviato digitalmente in maniera automatizzata, per permettere ad ogni

operatore di accedere al modello e lavorarci sopra.

Può essere fatto un controllo qualità per la validazione e l’ottimizzazione della produzione.

Tramite simulazioni FEM, si può re-ingegnerizzare il prodotto, individuando eventuali upgrade del

prodotto.

2) FASE 2: si passa il file CAD in .STL per renderlo leggibile dalla macchina. Questo file contiene

informazioni limitate rispetto al CAD, poichè è una ricostruzione geometrica del modello parametrico

suddiviso in punti che sono i vertici dei triangoli che compongono la mesh.

3) FASE 3: preparazione dei dati in cui l’operatore orienta il pezzo all’interno dell’ambiente di stampa.

Questa fase cambia molto a seconda del materiale scelto e dalla presenza/assenza di supporti,

fondamentali per evitare il collasso (ma si deve comunque limitare il numero di supporti perché poi

verranno rimossi).

Sempre in questa fase si decide come realizzare ogni singolo elemento (se l’oggetto finale è costituito

da + parti), quindi vengono definiti i parametri della stampa

4) FASE 4: slicing --> generazione di sezioni virtuali del modello (della parte) compresi i supporti

Le ultime due fasi prevedono l’utilizzo di un hardware:

5) FASE 5: si esegue la stampa vera e propria mediante diverse possibili tecnologie, come

prevede l’utilizzo di 1 o + filamenti termoplastici che passano attraverso un estrusore

→FDM:

riscaldato, che permette di portare il materiale da solido a semi-fluido.

Vantaggi: tecniche semplice e a basso costo

Svantaggi: bassa risoluzione, ritiro del materiale una volta raffreddato (con conseguente perdita di

geometria e qualità)

viene proiettata una luce con un pattern predefinito su una vasca piena di resina

→DLP:

fotopolimerizzante. Il piatto si sposta verso l’alto e a ogni esposizione si polimerizza un layer completo.

Vantaggi: minor problemi di posizionamento e maggior risoluzione

un piatto oscillante muove una luce laser in modo controllato su un letto di polvere, andando a

→SLS:

fondere localmente le particelle di polvere.

Svantaggio: laser non idoneo per bioprinting

6) FASE 6: post-processing--> raffreddamento del costrutto e eventuali rifiniture superficiali

FASI DEL PROCESSO DI BIOPRITING

Il processo di bioprinting coinvolge tipicamente 4 fasi:

1) Modellazione 3D: i modelli 3D sono solitamente ottenuti mediante progettazione assistita da computer

o tecniche di imaging (TC o RM→ RM molto + utilizzata nella biostampa perché rileva meglio i tessuti

molli)

2) Preparazione bioinchiostro: il bioink contiene fattori di crescita e cellule.

Il bioink insieme all’hydrogel danno origine al tessuto vitale.

La componente cellulare viene ricavata dal paziente tramite biopsia e una successiva separazione

cellulare.

3) Stampa 3D: prevede la deposizione di bioink, che incorporano cellule all’interno, in strutture

organizzate allo scopo di ricreare ambienti ideali per la proliferazione e differenziazione cellulare.

Un’alternativa è stampare prima uno scaffold in biomateriale, su cui poi fare cell seeding.

4) Elaborazione post-stampa: i biocostrutti vengono incubati e coltivati in vitro con un monitoraggio

costante

Ad oggi i principali limiti della biofabbricazione di organi complessi rimagono:

• Dimensioni

• Vascolarizzazione

• Contaminazione

• Tempo di vita

TECNICHE DI STAMPA 3D A SUPPORTO DEL PROCESSO DI BIOPRINTING

Le tecniche di stampa possono essere classificate in base al tipo di elemento stampato:

1) VOLUME: si ha un gel di supporto in cui viene iniettato tramite un ago il bioink seguendo la forma

predefinita.

Vantaggi:

+ Minor probabilità di collasso

+ Non sono necessarie strutture di supporto, perché è proprio il gel stesso che fa da supporto

+ Minor contaminazione

Svantaggi:

− L’utilizzo della deposizione tramite ago può portare a elevati sforzi di taglio sulle cellule

2) LAYER: viene realizzato un layer alla volta. Rientrano in queste tecniche:

layer fotopolimerizzato attraverso laser.

→SLA:

Questa tecnica ha una risoluzione molto elevata

Generalmente con questa tecnica la viscosità non è un problema, ma viene presa in considerazione nel

momento in cui si vuole aumentare la velocità del processo (+ il materiale è viscoso, + tempo impiega a

ricoprire il piatto).

3) LINEA: estrusione 1D, ovvero micro-estrusione con ugelli di dimensioni variabili

La risoluzione è molto variabile perché dipende dalla dimensione dell’ugello.

Si può interrompere il processo e fare una modifica in itinere.

Per evitare la contaminazione, possono essere utilizzate + testine che lavorano sullo stesso piatto di

stampa ma in fasi diverse.

L’utilizzo di + testine permette di fare una stampa multi-materiale e variare la risoluzione localmente

(usare testina + piccola nella zona a risoluzione maggiore).

4) GOCCIA (DROP): si basa sulla deposizione di gocce. La risoluzione dipende dal volume della goccia,

che varia in base alla potenza del laser utilizzato.

Esistono diverse tecniche, tra cui:

based

→Laser- In queste è importante considerare la viscosità per la creazione della goccia

→Inkjet acustiche: vengono utilizzati US o onde acustiche. In questo caso la viscosità è meno

→Tecniche

influente ed è garantita una maggiore vitalità cellulare perché l’energia è meno concentrata

5) SFEROIDE: aggregati 3D cellulari che garantiscono una maggiore vitalità cellulare nel tempo, perché

essendo già degli agglomerati sono + robusti.

La dimensione può variare a seconda delle cellule utilizzate.

GRAFICO RTM

Per scegliere la tecnica di stampa + adatta alla nostra applicazione, si può considerare il parametro RTM,

ovvero il rapporto tra la risoluzione spaziale e il tempo di fabbricazione (oppure si può esprimere come

prodotto tra Risoluzione spaziale e delivery rate).

1

= =∗ = ∗

spaziale= inverso della dimensione (d) della minima caratteristica fabbricabile

=risoluzione

delivery rate= quantità di volume (V) depositata nell’unità di tempo

= Asse ascisse: spessore della + piccola feature realizzabile

Asse ordinate: delivery rate

in alto a sx (delivery molto alto e spessore

→Spostandoci

molto piccolo) si hanno processi molto efficienti, ovvero

molto veloci e ad alta risoluzione.

Nel grafico ogni tecnica non corrisponde a un punto ma a

un luogo di punti perché ogni tecnica ha la possibilità di

adattare parametri specifici in base al materiale (in

particolare si può vedere che l’elettrospinning ha un range

dimensionale molto grande).

FASI PER CAPIRE SE IL MATERIALE E’ STAMPABILE

1) PREVISIONE DEL COMPORTAMENTO: viene fatta con MISURAZIONI REOLOGICHE

Si studia la deformazione di un materiale sottoposto a forze estere (risposta allo stress).

In base alla risposta si possono suddividere in 2 macro-categorie: Newtoniani e non newtoniani.

Per misurare la reologia del materiale si applicano sforzi di taglio (shear stress ) sulla superficie mobile si

=

misura l’angolo infinitesimo creato a seguito della deformazione rispetto alla parete statica (shear rate=

gradiente di scorrimento: di deformazione).

̇ = →velocità

A seconda dello shear rate in funzione dello shear stress (oppure della viscosità in funzione dello shear rate) si

possono suddividere in:

materiali NEWTONIANI: lo shear rate è direttamente proporzionale in maniera lineare allo shear stress

➢ (aumentando lo stress, aumenta la deformazione). In particolare la pendenza della retta corrisponde

alla viscosità, infatti la viscosità rimane costante (non varia) al variare dello shear rate

Esempio: acqua, aria

materiali SHEAR THINNING (pseudo-plastici): all’aumentare dello shear rate, lo shear stress aumenta

➢ meno rapidamente rispetto ai newtoniani. In questo caso la pendenza diminuisce, infatti il fluido

diventa meno viscoso quando viene deformato + velocemente (viscosità diminuisce quando shar rate

aumenta)

Esempio, Ketchup, sangue

materiali SHEAR THICKENING (dilatanti): all’aumentare dello shear rate, lo shear stress aumenta +

➢ velocemente rispetto ai Newtoniani. Quindi in questo caso la pendenza aumenta, infatti il fluido

diventa + viscoso quando deformato velocemente (viscosità aumenta all’aumentare dello shear rate).

Esempio: amido di mais

Fluido di BINGHAM: si attivano superata una certa soglia (yeld stress ) e poi assumono un

➢ 0

comportamento lineare come i Newtoniani, infatti anche la loro viscosità è costante al variare dello

shear rate.

Esempio: dentifricio

Materiali VISCOPLASTICI: si attivano superata una certa soglia (yeld stress), dopo la quale il

➢ comportamento non è lineare, ma simile a quello dello shear thinning, infatti la viscosità diminuisce

all’aumentare dello shear rate.

Modelli di riferimento: leggi che permettono di modellare determinate caratteristiche di un materiale

• Power Law: usata per valutare l’estrudibilità e la tenuta del filamento di un biocostrutto→

= ̇

• Rabinowitsh: calcolare lo sforzo di taglio reale alle pareti dell’ugello

• Hagen-Poiseuille (generalizzata): serve per calcolare il flusso all’interno di un capillare, un vaso o un

4

ugello sfruttando la componente geometrica e la pressione→ = ∆

8

• Numero di Deborah (De): in base al suo valore si può valutare se il comportamento è pseudo-fluido o

pseudo-solido→ = 2

• Numero di Weber (We): descrive la stabilità di un getto o di una goccia→ =

2) TEST SPERIMENTALI E/O SIMULAZIONI: è importante effettuare una fase di sperimentazione reale per

valutare l’abilità dell’hydrogel di creare filamenti o gocce quando è applicata una pressione.

TEST DEPOSIZIONE MATERIALE

Devo ricreare le condizioni di estrusione reali, estrudendo gocce o filamenti finché non si ottiene la PROPER-

GELATION. Bisogna infatti evitare le condizioni di:

UNDER-GELATION: la sotto-reticolazione porta a 2 problematiche:

➢ 1)Non conserva le dimensioni, in quanto il pezzo di abbassa

2)I pori sono molto + piccoli, non consentendo ai nutrienti di

raggiungere tutto il costrutto e arrivare a tutte le cellule

Però l’ambiente + soffice permette la migrazione e proliferazione

cellulare.

OVER-GELATION: si ha un hydrogel troppo viscoso, quindi sono

➢ necessari maggiori sforzi di taglio per l’estrusione. Questi sforzi di taglio

elevati generano grumi.

Inoltre la matrice troppo densa ostacola la migrazione cellulare e la diffusione dei nutrimenti.

Tra le due la + problematica è l’over-gelation.

TEST COLLASSO/STABILITA’ DEL FILAMENTO

Viene depositato un filamento su una struttura rigida costituita

da colonne a distanze diverse le une con le altre.

Tramite questo test posso ricavare l’indice di collasso:

−

= ∗ 100%

totale compresa tra le colonne e il filamento (che corrisponde a un rettangolo se il filamento non collassa)

=area

reale -->data dalla differenza tra l’area totale e l’area di collasso

=area

L’indice di collasso permette di capire qual è la distanza massima tra due colonne successive, oltre la quale il

filamento collassa.

Per evitare il collasso del filamento si può pensare a un reticolo + stretto, ma non sempre questo è compatibile

con la vitalità e sopravvivenza cellulare.

TEST DI STAMPABILITA’

Affinché un materiale sia stampabile e stabile dopo la stampa, devono emergere 3 comportamenti

fondamentali dalle curve di caratterizzazione:

1) Alta soglia di stress (fino a 200Pa compatibile alla sopravvivenza cellulare) da applicare prima che il

fluido cambi comportamento da pseudo-solido a pseudo-fluido

2) Comportamento pseudoplastico n < 1 dalla Power Law

3) Alta viscosità che lo rende stabile pre e post estrusione

Quando parliamo di estrusione di filamenti continui attraverso un ago, i + indicati sono i fluidi di Bingham

(elasto-plastici), perché fluiscono solo dopo aver superato una certa soglia e dopo di questa assumono un

comportamento Newtoniano.

Al contrario i fluidi dilatanti tendono ad

ostruire l’ago.

3) OTTIMIZZAZIONE DELLA STRUTTURA: si possono effettuare test che permettono di valutare e

determinare la distanza minima ottimale tra due filamenti adiacenti, oltre la quale si inizia ad avere

fusione o sovrapposizione non idonea.

Quindi posso capire come varia il comportamento del filamento nella direzione dell’estrusione non

principale.

4) STAMPA DEL BIOCOSTRUTTO: in base alla applicazione, si deve trovare il giusto compromesso tra la

stampabilità e la biocompatibilità.

Spesso si tende a utilizzare bioink multi-materiale, in modo da variare la viscosità e il comportamento

(dilatante o pseudo-plastico) del materiale stesso

Un biocostrutto ideale deve:

Essere Biocompatibile

❖ Promuovere l’adesione cellulare e l’attività cellulare

❖ Fornire segnali simili a quelli della matrice ECM

❖ Mimare il tessuto riproducendo le sue proprietà m