Analisi biochimico-cliniche – Appunti completi e revisionati

A P P U N T I U N I V E R S I TA R I · FA R M A C I A

Analisi Biochimico-Cliniche

Appunti completi e revisionati: dalla fase pre-analitica alla

diagnostica di laboratorio per organi e apparati

Materiale di studio rielaborato a partire da appunti di lezione.

Non sostituisce i testi di riferimento né le indicazioni del docente.

Indice

1. Fondamenti di medicina di laboratorio 6

1.1 Che cos'è la biochimica clinica 6

1.2 Il ciclo di Lundberg: l'approccio "brain-to-brain" 6

1.3 Fonti di variabilità del dato 6

1.4 Variabilità analitica e controllo di qualità 7

1.5 La fase pre-analitica: la principale fonte di errore 8

1.6 Siero, plasma e anticoagulanti 10

1.7 Accettazione del campione e tempi di lavorazione 11

2. Esame delle urine e funzionalità renale 13

2.1 Cenni di fisiologia renale 13

2.2 Raccolta, conservazione e trasporto 13

2.3 L'esame completo delle urine 13

2.4 Valutazione della funzionalità renale 18

3. L'esame emocromocitometrico 20

3.1 Introduzione 20

3.2 Principi tecnici degli analizzatori 20

3.3 La serie rossa 21

3.4 La serie bianca 22

3.5 Le piastrine 22

3.6 Fase pre-analitica dell'emocromo 23

3.7 Lo striscio di sangue periferico 23

3.8 Variazioni fisiologiche 24

4. Metabolismo del ferro e diagnostica delle anemie 25

4.1 Il metabolismo del ferro 25

4.2 Assorbimento intestinale e regolazione 25

4.3 Proteine di trasporto e di deposito 26

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4.4 Marcatori di laboratorio dell'assetto marziale 27

4.5 Classificazione morfologica delle anemie 27

4.6 Le principali anemie 28

4.7 L'emoglobina: struttura e genetica 28

4.8 Emoglobinopatie: l'anemia falciforme 29

4.9 Le talassemie 29

4.10 Anemie emolitiche 30

5. Emostasi e diagnostica della coagulazione 32

5.1 L'endotelio e l'equilibrio emostatico 32

5.2 La fase vasale 32

5.3 Emostasi primaria: dalle piastrine al trombo bianco 32

5.4 Emostasi secondaria: la cascata coagulativa 33

5.5 Vitamina K, calcio e fattore piastrinico 3 33

5.6 Inibitori fisiologici della coagulazione 34

5.7 La fibrinolisi e il D-dimero 34

5.8 Quadri patologici: emorragia e trombosi 35

5.9 Test della coagulazione: fase pre-analitica 35

5.10 Test di primo livello 36

5.11 Test di secondo livello 37

5.12 Test della funzionalità piastrinica 38

6. Il fegato: fisiopatologia e diagnostica di laboratorio 40

6.1 Anatomia funzionale e vascolarizzazione 40

6.2 Funzioni del fegato 40

6.3 Il metabolismo della bilirubina 41

6.4 La colestasi 42

6.5 Marcatori di citolisi: le transaminasi 43

6.6 La lattato deidrogenasi (LDH) 44

6.7 Marcatori di colestasi: fosfatasi alcalina e γ-GT 45

6.8 Marcatori di protidosintesi ed elettroforesi delle sieroproteine 45

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6.9 Marcatori particolari e test di secondo livello 46

6.10 Approccio di laboratorio alla diagnostica epatica 47

7. Pancreas endocrino e diabete mellito 49

7.1 Il pancreas e le isole di Langerhans 49

7.2 Trasporto del glucosio 49

7.3 La secrezione di insulina 50

7.4 Dinamica ormonale: dopo il pasto e a digiuno 51

7.5 Il diabete mellito: tipi e patogenesi 51

7.6 Screening 52

7.7 Diagnosi nell'adulto 52

7.8 Il diabete gestazionale 53

7.9 Parametri per la diagnosi e il monitoraggio 54

7.10 Aspetti metodologici 55

8. Lipoproteine, dislipidemie e rischio cardiovascolare 57

8.1 Struttura delle lipoproteine 57

8.2 Le classi di lipoproteine 57

8.3 Le vie metaboliche 58

8.4 Le dislipidemie 59

8.5 L'aterogenesi 59

8.6 La sindrome metabolica e l'insulino-resistenza 60

8.7 Diagnostica di laboratorio del rischio cardiovascolare 61

8.8 Considerazioni finali 62

9. Marcatori cardiaci: infarto e scompenso 64

9.1 La sindrome coronarica acuta 64

9.2 Marcatori di danno miocardico 64

9.3 Il dolore toracico in Pronto Soccorso 66

9.4 Lo scompenso cardiaco 66

10. Infiammazione, infezione e sepsi 68

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10.1 La risposta immunitaria innata 68

10.2 Le proteine di fase acuta 69

10.3 Proteina C reattiva e siero amiloide A 69

10.4 Procalcitonina e presepsina 71

10.5 Altri marcatori dell'infiammazione 71

10.6 Citochine e chemochine 72

10.7 Le immunoglobuline 73

10.8 La sepsi 74

11. Allergologia e diagnostica molecolare 76

11.1 L'ipersensibilità di tipo I 76

11.2 Livelli diagnostici 76

11.3 Diagnostica in vitro 77

11.4 La diagnostica molecolare (CRD) 78

11.5 Le piattaforme multiplex 79

11.6 Test di terzo livello 79

11.7 POCT allergologico 80

12. Autoimmunità: lupus e artrite reumatoide 81

12.1 Il lupus eritematoso sistemico (LES) 81

12.2 Gli anticorpi anti-nucleo (ANA) 82

12.3 L'artrite reumatoide (AR) 83

13. La tiroide 85

13.1 L'asse ipotalamo-ipofisi-tiroide 85

13.2 Sintesi degli ormoni tiroidei 85

13.3 Marcatori di laboratorio 86

13.4 Interpretazione: la mappa TSH/FT4 87

13.5 Interferenze e tecniche di indagine 87

14. Apparato digerente: H. pylori, malassorbimento e analisi delle feci 89

14.1 Diagnostica dell'Helicobacter pylori 89

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14.2 Le sindromi da malassorbimento 89

14.3 L'esame standard delle feci 90

14.4 Marcatori fecali specifici 91

14.5 Test dinamici e funzionali 91

14.6 Parassitologia: Enterobius vermicularis 92

14.7 Sangue occulto fecale 92

15. Point-of-care testing e farmacia dei servizi 94

15.1 Che cos'è il POCT 94

15.2 Tecnologie di rilevazione 94

15.3 Principali parametri POCT 95

15.4 Gravidanza e screening del rischio fetale 96

15.5 La farmacia dei servizi 97

16. Casi clinici e ragionamento integrato 99

16.1 Anemia sideropenica dopo resezione intestinale 99

16.2 Anemia megaloblastica da gastrite autoimmune 99

16.3 Mononucleosi infettiva 100

16.4 Sepsi da Staphylococcus aureus 100

16.5 Sindrome orale allergica e "gap" diagnostico 101

16.6 Allergia o parassitosi? 101

16.7 Concetti chiave da non dimenticare 102

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C A P I TO L O 1

Fondamenti di medicina di laboratorio

1.1 Che cos'è la biochimica clinica

La biochimica clinica è la branca della medicina di laboratorio che studia le variazioni dei marcatori

biologici, sia cellulari sia solubili, per ricavarne informazioni utili a due scopi:

diagnostico: identificare la presenza di una patologia;

prognostico e di monitoraggio: seguire nel tempo l'andamento di una malattia o lo stato di sa‐

lute del soggetto.

Il concetto centrale è lo scarto rispetto all'intervallo di riferimento: un valore acquista significato

clinico in relazione a quanto, e in che direzione, si discosta dai valori attesi.

ESEMPI

Glicemia a digiuno: normale fino a 100 mg/dL; diagnosi di diabete sopra 126 mg/dL. L'in‐

tervallo 100–126 mg/dL è una "zona grigia": il soggetto non è diabetico, ma è ad alto rischio

e va monitorato.

Piastrine: valori fisiologici tra 150.000 e 450.000/µL. Un eccesso definisce la ,

piastrinosi

un difetto la ; quest'ultima può dipendere da ridotta produzione o da pro‐

piastrinopenia

cessi patologici (infezioni, fenomeni autoimmuni) che possono alterare anche la morfologia

delle cellule.

1.2 Il ciclo di Lundberg: l'approccio "brain-to-brain"

Il percorso di un esame di laboratorio è descritto come un ciclo chiuso, detto ciclo di Lundberg o

approccio , perché parte e termina con un ragionamento clinico.

brain-to-brain

1 Primo "brain": il clinico. Il medico (di base o specialista) richiede gli esami in base ai sintomi o

alla necessità di approfondimento.

Il laboratorio. Esegue il test attraverso le fasi , e .

pre-analitica analitica post-analitica

2

3 Secondo "brain": il laboratorio come interprete. Oggi il laboratorio ha un ruolo attivo: se l'a‐

nalista rileva un'alterazione (per esempio una componente monoclonale nel tracciato elettro‐

foretico), può approfondire autonomamente l'indagine, ad esempio tipizzando la catena im‐

munoglobulinica coinvolta, senza che il paziente debba tornare dal medico per una nuova

richiesta.

4 Ritorno al clinico. Il referto torna al medico per l'interpretazione finale.

1.3 Fonti di variabilità del dato

Il risultato di un'analisi è sempre una stima del valore reale presente nel paziente. Questa stima è

influenzata da due grandi fonti di variabilità: quella biologica e quella analitica, a cui si aggiungono

Analisi Biochimico-Cliniche 6

gli errori della fase pre-analitica (§1.5).

Variabilità biologica

Inter-individuale: differenze tra soggetti diversi legate a sesso, età, etnia, massa muscolare.

Esempio: la creatinchinasi (CK) è più alta negli uomini e nelle popolazioni con maggiore massa

muscolare.

Intra-individuale: oscillazioni nello stesso soggetto in momenti diversi, dovute a ritmi circadiani

(es. picco di cortisolo al risveglio), dieta e stato di idratazione.

Intervalli di riferimento

Definizione. L'intervallo di riferimento comprende i valori del 95% della popolazione sana. Per

una distribuzione gaussiana corrisponde a media ± 2 deviazioni standard.

Il "paradosso" del 5%. Per costruzione, il 5% dei soggetti sani (2,5% sopra e 2,5% sotto) avrà va‐

lori fuori intervallo senza essere malato. Ne sono un esempio i soggetti con conta piastrinica

stabilmente borderline.

Popolazione di riferimento. Serve un campione ampio di soggetti sani per quel parametro,

eventualmente suddiviso per età e sesso (emoglobina ed eritrociti, ad esempio, differiscono tra

uomo e donna).

Valori desiderabili. Per alcuni parametri non si usa un intervallo statistico ma un valore "deside‐

rabile" o un obiettivo legato al rischio (es. colesterolo HDL > 60 mg/dL).

1.4 Variabilità analitica e controllo di qualità

La variabilità analitica dipende dalla capacità del laboratorio di processare un campione e ottenere

un risultato attendibile. È influenzata da fattori legati al metodo (sensibilità, specificità, linearità),

allo strumento (calibrazione) e all'operatore (manualità, competenza).

Precisione, accuratezza e tipi di errore

Proprietà Definizione Errore che la compromette

Precisione Concordanza tra misure ripetute sullo Errore casuale (accidentale): senza una dire‐

stesso campione. zione costante, produce valori che oscillano so‐

pra e sotto la media.

Accuratezza Concordanza tra il valore misurato e il Errore sistematico: tendenza costante, sempre

valore vero del parametro. in eccesso o sempre in difetto (es. strumento

starato).

— Scorretta applicazione del metodo. Errore grossolano: campione sbagliato, tecnica

di rilevazione errata.

Caratteristiche di performance di un metodo

Sensibilità analitica: capacità di rilevare concentrazioni minime dell'analita o variazioni molto

piccole. È cruciale per analiti presenti in tracce, come gli ormoni (concentrazioni nM o pM), o

con intervalli fisiologici molto stretti, come sodio e potassio. Esempio: le troponine ad alta

sensibilità attuali rilevano il danno miocardico molto prima dei test del passato.

Analisi Biochimico-Cliniche 7

Specificità analitica: capacità di misurare solo l'analita d'interesse, senza interferenze della ma‐

trice (farmaci, altri metaboliti presenti nel siero). Un esempio in ematologia è la capacità dell'a‐

nalizzatore di distinguere le cinque popolazioni leucocitarie.

Linearità: intervallo di concentrazioni in cui il segnale è direttamente proporzionale alla

quantità di analita. Un campione troppo concentrato, che "esce" dalla retta di calibrazione, va di‐

luito fino a rientrare nell'intervallo lineare.

Controllo di qualità

Il controllo di qualità serve a monitorare nel tempo le prestazioni del sistema analitico e non va

confuso con la calibrazione, che invece imposta la relazione tra segnale e concentrazione.

Controllo di qualità interno (CQI). Insieme ai campioni dei pazienti si analizzano materiali di

controllo a concentrazione nota (in genere commerciali). Per ogni parametro si usano più livelli

che coprano l'intervallo di misura: normale, patologico alto e patologico basso.

Valutazione esterna di qualità (VEQ). Periodicamente il laboratorio riceve campioni "ciechi" da

un centro di riferimento, li analizza e invia i risultati; il centro ne verifica l'accuratezza confron‐

tandoli con il valore atteso e con gli altri laboratori partecipanti.

1.5 La fase pre-analitica: la principale fonte di errore

La maggior parte degli errori di laboratorio non avviene durante l'analisi, ma prima: le stime attri‐

buiscono alla fase pre-analitica oltre la metà degli errori totali (fino al 60–70%). La standardizza‐

zione della preparazione del paziente e del campionamento è quindi l'unico modo per garantire che

il risultato rappresenti davvero la condizione del soggetto.

Preparazione del paziente

Digiuno di 8 ore (minimo 6). Per il profilo lipidico studi recenti indicano che può bastare un di‐

giuno più breve. Anche un digiuno (oltre 24–48 ore) è dannoso: attiva il catabolismo,

eccessivo

mobilizza glicogeno e lipidi e aumenta la bilirubina, falsando il profilo metabolico.

Riposo: evitare sforzi intensi prima del prelievo, perché la muscolatura sotto stress libera enzimi

come LDH e CK. Con l'introduzione delle troponine ad alta sensibilità, LDH e CK hanno perso

utilità nella diagnosi cardiaca, perché le troponine distinguono molto meglio il danno miocar‐

dico da quello muscolare scheletrico.

Astensione dal fumo nelle ore precedenti.

Idratazione: bere quantità eccessive di acqua causa emodiluizione e sottostima di parametri

come le proteine totali.

Postura: passare dalla posizione sdraiata (clinostatica) a quella eretta (ortostatica) sposta liquidi

tra i compartimenti. La posizione clinostatica induce emodiluizione e quindi sottostima di alcuni

analiti. Nei pazienti allettati a lungo, inoltre, il riassorbimento osseo mobilizza calcio, alterando

la calcemia e aumentando il rischio di osteoporosi.

Farmaci e integratori: l'acido ascorbico (vitamina C, presente negli agrumi o come conservante

alimentare) interferisce chimicamente con la ricerca del glucosio urinario, rendendola inattendi‐

bile o falsamente negativa.

Analisi Biochimico-Cliniche 8

Identificazione, prelievo e conservazione

Identificazione del paziente e del campione tramite , per tracciarlo ed evitare scambi,

barcode

soprattutto nei pazienti ricoverati.

Laccio emostatico: non va mantenuto oltre 1 minuto. Una stasi prolungata provoca emoconcen‐

trazione (aumento fittizio di emoglobina, ematocrito e proteine) e può causare emolisi.

Ago a farfalla (butterfly): il tubicino di raccordo è inizialmente vuoto ed è l'unico tratto del si‐

stema sottovuoto in cui il sangue può coagulare prima di incontrare l'anticoagulante.

Contenitore idoneo per ogni esame (es. contenitore sterile per l'urinocoltura) e corretta con‐

servazione (es. urine delle 24 ore a +4 °C).

Tipologie di campione

Campione Caratteristiche e utilizzo

Sangue venoso Il più comune; prelievo di norma dalla vena del gomito (vena mediana cubitale).

Sangue arterioso Per l'emogasanalisi (O , CO , pH) nei pazienti critici. Prelievo più profondo e dolo‐

2 2

roso, in genere dall'arteria radiale.

Sangue capillare Nei neonati (puntura del tallone) e nei test POCT in farmacia. Meno attendibile del

venoso per alcuni parametri.

Urine Campione estemporaneo per l'esame completo; mitto intermedio in contenitore

sterile per l'urinocoltura; raccolta delle 24 ore per ormoni e proteine (Cap. 2).

Feci Sangue occulto, esame parassitologico (es. per gli ossiuri).

scotch test

Matrici cheratiniche Le sostanze si accumulano nella matrice: permettono di documentare l'assunzione

(capelli) di farmaci o droghe avvenuta anche mesi prima.

L'emolisi

L'emolisi è la rottura della membrana eritrocitaria con rilascio del contenuto cellulare nel siero o

nel plasma, che assume un colore rosato o rossastro. È una delle principali cause di rifiuto del cam‐

pione. L'emolisi , dovuta a errori pre-analitici, non va confusa con le anemie emolitiche, in

in vitro

cui l'emolisi avviene .

in vivo

Cause meccaniche e fisiche Cause osmotiche

Ago di calibro troppo sottile (flusso Soluzioni ipertoniche: l'acqua esce dalla cellula, che si

turbolento) raggrinzisce ( ).

crenatura

Residui di disinfettante sulla cute Soluzioni ipotoniche: l'acqua entra, la cellula si rigonfia

( ) fino a rompersi.

swelling

Laccio mantenuto oltre 1 minuto

Congelamento del sangue intero (cristalli di

ghiaccio)

Rapporto sangue/anticoagulante errato

CONSEGUENZE ANALITICHE DELL'EMOLISI

Falso aumento degli analiti più concentrati negli eritrociti che nel plasma, soprattutto potassio

e LDH; interferenza nella determinazione dell'albumina; sottostima della conta eritrocitaria.

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1.6 Siero, plasma e anticoagulanti

Siero e plasma

Entrambi sono la frazione liquida del sangue ottenuta per centrifugazione, ma si ottengono in modo

diverso:

Plasma: sangue raccolto con anticoagulante e centrifugato. Contiene tutte le proteine, compresi

fibrinogeno e fattori della coagulazione. Rappresenta meglio la frazione solubile presente in

.

vivo

Siero: sangue lasciato coagulare (senza anticoagulante, 20–30 minuti) e poi centrifugato. È privo

di fibrinogeno e di gran parte dei fattori della coagulazione, consumati per formare il coagulo.

Risente inoltre delle sostanze liberate durante la coagulazione (es. proteasi dei leucociti, potas‐

sio dalle piastrine).

Entrambi sono normalmente giallo paglierino e limpidi; diventano rossastri in caso di emolisi e

torbidi (lattescenti) in caso di lipemia.