Analisi biochimica degli alimenti (modulo 2)

Principi di spettroscopia UV-VIS

23/11/2022

Spettroscopia = approccio che studia la luce, cioè una radiazione elettromagnetica.

Caratteristiche delle onde elettromagnetiche

Nelle onde elettromagnetiche si associa un campo magnetico e elettrico tra di loro ortogonali.

Onde = poiché nello spazio si propaga in modo sinusoidale

• Intensità = ampiezza dell’onda massima in positivo o in negativo (onda oscilla tra un minimo e un massimo)
• Lunghezza d’onda

Si misura in nanometri 10^-9 m

Definisce distanza tra due massimi o due minimi della sinusoide (distanza percorsa in un ciclo completo di oscillazione)

• Frequenza

Si misura in ^-1

Numero di oscillazioni in 1 secondo. =

Correlata alla lunghezza d’onda dalla formula: − ():

Velocità della luce nel vuoto circa 300000 km/s

Spettro elettromagnetico

Spettro elettromagnetico Lunghezza d’onda identifica il colore della luce.

↑ = ↓ Al crescere della lunghezza d’onda la frequenza diventa più piccola.

Più frequenze piccole più energetiche (pericolose)

Luce

• Visibile = Comprende radiazioni elettromagnetiche di lunghezza d’onda comprese tra 400 e 700 (spettro del visibile)

• Al variare della lunghezza d’onda varia il colore che vediamo.
• Spettro del visibile rappresenta colori dell’arcobaleno
• Basse = viola
• Alte = rosso

• Ultravioletto

• Comprende radiazioni elettromagnetiche comprese tra 350 e 10 nm
• Inferiori allo spettro del visibile, più piccole rispetto al viola

• Infrarosso Lunghezze d’onda appena più grandi dello spettro del visibile, più grandi del rosso
• Bianca = contiene tutti i colori dello spettro visibile. 1

Quando un oggetto viene illuminato, alcune lunghezze d’onda vengono

• Assorbite
• Non assorbite = riflesse o trasmesse (a seconda se l’oggetto è trasparente o opaco).

• Colore percepito è dato dalle lunghezze d’onda della luce non assorbite.
• Oggetto bianco = riflette tutte le lunghezze d’onda
• Oggetto nero = non ne riflette nessuna.
• Soluzione trasparente = non assorbe nessuna lunghezza d’onda.

Cromoforo

Cromoforo.

Cromoforo: gruppo di atomi in grado di conferire colore ad una sostanza poiché è in grado di assorbire specifiche assorbite sono diverse e specifiche in base al cromoforo

In genere (ma non esclusivamente) sono costituiti da molecole insature.

Se un cromoforo assorbe lunghezze d’onda nella regione dell’ultravioletto all’occhio umano non vediamo nulla ma si possono sfruttare per alcune caratterizzazioni strumentali.

All’aumentare del numero dei doppi legami aumenta la lunghezza d’onda assorbita

Spettrofotometro

Spettrofotometro

Possiede: lampada + strumento monocromatore

1. Il compito dello strumento monocromatore è separare la luce emessa dalla lampada nei singoli colori che prendono strade differenti.
2. Solo una verrà mandata sul campione, scelta in base alla assorbita dal cromoforo che stiamo studiando.
3. In una cuvetta si pone una soluzione in cui è disciolto il cromoforo ad una determinata concentrazione c.
4. La luce monocromatica viene inviata sul campione con una determinata e intensità luce-incidente 0
5. Se il cromoforo assorbe quella lunghezza d’onda luce emessa avrà

• Intensità minore = intensità della luce-trasmessa
• Uguale

Intensità della luce-trasmessa dipende da: spessore cuvetta e luce-incidente 0:

Trasmittanza frazione di luce incidente che attraversa il campione

Rapporto tra intensità della luce-trasmessa e intensità luce-incidente 0

0 < < 1

Assume valori

• Se luce non viene assorbita = 1
• Se tutta la luce viene assorbita = 0

= 0 2

Assorbanza = intensità della luce incidente (monocromatica)

0 = intensità della luce trasmessa

0 = − log() = − ( ) = log ( ) 0

• = 1 → = 0

Se

• = 0 → = ∞

Se

• = 0.1 → = 1

Se (passa 10% della luce)

• = 0.01 → = 2

Se (passa 1% della luce)

→ e sono grandezze adimensionate

Lo spettrofotometro è uno strumento che permette di:

1. Selezionare della luce incidente sul campione (contenuto in una cuvetta)
2. Misurare e0
3. (misurare assorbanza di una soluzione mediante lo spettrofotometro (e non la trasmittanza))

1 Grafico decrescente

[] = 1 = 0

Parte quando

[]↑ tende a 0

Grafico crescente

[] = 0 → = 0 []

Assorbanza direttamente proporzionale < 1)

Per soluzioni sufficientemente diluite ([]).

→ ha una correlazione lineare con2

Legge di Lambert-Beer

Legge di Lambert-Beer,

Permette di correlare assorbanza di una soluzione, misurata ad una data alla concentrazione del cromoforo

=

• = concentrazione del cromoforo (M)
• = cammino ottico, spessore della cuvetta (cm)
• ^{-1 -1} (epsilon) = coefficiente di estinzione molare (M cm)

• Proprietà del cromoforo ad una data lunghezza d’onda
• Varia in base a:
• Cromoforo
• Diverse di uno stesso cromoforo
• [] = 1 = 1

Equivale al valore di che la soluzione dovrebbe avere e

Richiami di enzimologia

Ruolo di un enzima

Non altera gli equilibri, ma riduce energia attivazione

La presenza di un enzima permette di raggiungere più velocemente lo stato di equilibrio di una reazione.

Lo stato di equilibrio è una proprietà di ogni singola reazione e può essere più o meno spostato verso i prodotti.

1 Grafico chiesto spesso all’esame

2 Spesso chiesta all’esame 3

La velocità di una reazione enzimatica si misura con la velocità con la quale si forma il prodotto o si consuma il substrato (es. molP/min) d[P] d[S] [ES]

V= =− = dt dt

Direttamente proporzionale alla quantità di complesso enzima/substrato

Fattori che influenzano la velocità di una reazione:

• Concentrazione del substrato enzimi non cooperativi e cooperativi
• Concentrazione totale di enzima
• Temperatura, pH, forza ionica
• Presenza di molecole effettrici

Uguale quantità di S, diversa quantità di E Velocità iniziale direttamente proporzionale alla quantità di enzima.

Anche se con diversa velocità tutte le reazioni raggiungeranno lo stesso punto di equilibrio finale (quantità di P formato).

Ad ogni tempo di reazione la velocità è rappresentata dalla tangente alla curva.

Uguale quantità di E, diversa quantità di S Velocità iniziale è proporzionale alla quantità di substrato.

Alla fine della reazione la quantità di prodotto formato dipenderà dalla quantità di substrato presente inizialmente.

Ad ogni tempo di reazione la velocità è rappresentata dalla tangente alla curva. ():

Attività enzimatica viene quantificata in Unità Internazionali 1 /

Per definizione 1 è la quantità di che produce (in condizioni sperimentali definite e controllate)

Attività specifica di una preparazione enzimatica corrisponde al numero di UI presenti per ogni unità di massa della preparazione stessa

/ = / ( × ) 4

Saggi enzimatici

24/11/2022

Esistono 2 diversi contesti per studiare gli enzimi

1. Quantificazione di un enzima (attività enzimatica):

• Misure cinetiche
• Enzima «protagonista»
• Permette di analizzare processi

2. Concentrazione del substrato della reazione catalizzata

• Utilizzo di enzimi per determinare la concentrazione di un analita (Analita = soggetto dell’analisi in corso, specie che andiamo a quantificare)
• Misure all’equilibrio
• Enzima «strumento»
• Permette la determinazione specifica di uno o più composti

Trattamenti termici ed enzimi

• Enzimi, essendo proteine, si denaturano nei trattamenti termici quando vengono trattate ad alte temperature

→ La denaturazione è processo cinetico quindi è importante studiare:

1. Cinetica di denaturazione termica di un enzima ad una data temperatura

→ Per trovare costante cinetica (permette studio di predittivo a diverse temperature)

2. Successivamente con l’elaborazione matematica delle informazioni trovati con i saggi enzimatici, Arrhenius, si studia di come varia la cinetica in funzione della temperatura

• Studio degli enzimi (attività enzimatiche) è strettamente correlato al trattamento termico attuato negli alimenti.

Le applicazioni nei controlli dei processi con analisi di tipo:

1. Analitico = Studio dell’attività residua di enzimi endogeni utile per verificare se un prodotto ha subito un trattamento termico

• Marcatori di qualità
• Studio di tipo analitico semplificato poiché non quantifico ma rilevo presenza o assenza

→ Risposta Si/No

• Esempio nel latte pastorizzato si valuta presenza di:
• Fosfatasi

3 Inattiva con trattamenti simili alla pastorizzazione

• Se inattivo sicuri che il trattamento è stato sufficiente per pastorizzare il latte.

→ Valutare la presenza di fosfatasi è un’analisi immediata e quindi efficace

• Perossidasi

4 Inattivo con trattamenti più drastici della pastorizzazione

• Se attiva ci garantisce che il trattamento non è stato così drastico da provocare un danno termico eccessivo.

→ Trattamento deve essere sufficiente per pastorizzare ma non troppo drastico in modo da garantire il maggiore grado nutrizionale possibile

2. Predittivo = Importante per definire il trattamento termico per inattivare enzimi utilizzati nelle trasformazioni alimentari

3 Pastorizzazione = Inattivazione degli organismi patogeni

4 Enzima endogeno 5

N.B. Posso usare saggi enzimatici in queste applicazioni perché li conosco bene avendoli trattati a monte attraverso gli studi di cinetica (punti 1 e 2)

Fattori che influenzano la velocità di una reazione:

• Concentrazione del substrato enzimi non cooperativi e cooperativi
• Concentrazione totale di enzima
• Temperatura, pH, forza ionica
• Presenza di molecole effettrici

→ considero pH e temperatura costanti 6

Quantificazione attività di un enzima

(1) Quantificazione attività di un enzima

Condizioni in cui operare: [Enzima]

Velocità di reazione dipenda solo dalla presente mantenendo costanti e controllati:

1. pH: Sistema tampone
2. Temperatura: Lavorare in modo termostatato, termostatazione
3. Concentrazione del substrato

• Virtualmente impossibile

→ Poiché substrato si trasforma in prodotto durante la reazione poiché diventa prodotto.

• 5 Per farlo devo misurare velocità di reazione iniziale

→ Perché in quel momento il substrato è ancora presente con la concentrazione stabilita

Saggi enzimatici

• Saggi enzimatici = Misure per quantificare attività enzimatica/ enzima presente
• Per misurare attività enzimatica si deve misurare la velocità di una reazione che in condizioni controllate

• Dipende dalla quantità di E presente.
• Permette la formazione del prodotto

• In base alla tecnica adottata per quantificare il prodotto formato, possiamo distinguere i saggi enzimatici in:

• Spettrofotometrici = Si utilizza spettrofotometro per quantificare il prodotto formato. Prodotto assorbe la luce ad una lunghezza d’onda caratteristica
• Fluorimetrici
• Calorimetrici
• Mediante pH-stat

Accorgimenti da attuare per il substrato

1. Concentrazione

• Deve avere una concentrazione tale da rendere meno problematica la naturale diminuzione di concentrazione che subisce nel tempo
• [] > 10 ∙ dell’enzima (consigliabile)

→ [] la diminuzione di non fa diminuire in modo significativo la velocità, di conseguenza si minimizzano errori sulla determinazione della velocità iniziale.

Tratto finale (alte concentrazioni) velocità varia di poco al variare della concentrazione del substrato

2. Substrato quando diventa prodotto deve essere in grado di assorbire la luce ad una determinata lunghezza d’onda in modo da poterlo quantificare
3. Tipologie

• Naturale
• Sintetico

= maggiore parte dei saggi enzimatici fatta su substrati sintetici

5 Velocità di reazione = quantificare velocità con cui si forma prodotto, oppure si consuma substrato 7

Esempio di un substrato naturale

NAD(P) ossidato non assorbe lunghezze d’onda a 340 nm

NAD(P)H ridotto assorbe luce a 340 nm.

Con la formazione del prodotto NAD(P)H si può monitorare velocità di formazione del 6P-gluconato attraverso lo spettrofotometro misurando di continuo l’incremento di assorbanza a 340 nm.

Cofattore e prodotto sono stechiometrici, quindi conoscendo il NAPDH conosco anche 6P gluconato

Esempi di un substrato sintetico

1. P-nitrofenilfosfato

• Paranitrofenilfosfato ha caratteristiche chimiche idonee a renderlo substrato dell’enzima

→ Enzima lo scambia come un substrato naturale e lo utilizza per catalizzare la sua reazione.

• Fosfatasi:

1. Stacca il gruppo fosfato
2. Produce paranitrofenolo che è colorato di giallo in ambiente basico = Assorbe luce ad una specifica
3. Prodotto ha caratteristiche spettroscopiche idonee per essere quantificato con lo spettrometro

2. BAPA o BAPA permette di misurare il prodotto che si forma dall’attività della tripsina (= proteasi)

1. Tripsina idrolizza legame peptidico adiacente ad amminoacidi basici ≠
2. Alcuni substrati sintetici hanno colore del prodotto dipende dal pH (P-nitroaniline colorata di giallo quindi si può misurare concentrazione allo spettrofotometro) 8

Tipologie di dosaggi

• Continuo: senza arresto della reazione grazie allo spettrofotometro

• Assorbanza aumenta nel tempo poiché il prodotto si sta formando
• Consente di verificare se la velocità enzimatica rallenta per effetto della diminuzione del substrato.

• Discontinuo: con arresto della reazione

• Con il dosaggio discontinuo è possibile commettere errori

→ Perché non possiamo sapere se la velocità che stiamo misurando realmente corrisponde a o Per minimizzare errori:

• [] []> 10 ∙ : la diminuzione di non fa diminuire in modo significativo la velocità
• Fare incubazioni per diversi tempi andando a costruire in modo discontinuo la curva di dosaggio continuo N.B Dato che nei saggi discontinui sono meno affidabili si usano generalmente nelle condizioni in cui la reazione deve essere arrestata per forza.

Es: lavoro con un enzima che ha un determinato ottimo di pH ma il prodotto ottenuto invece è quantificabile ad un ≠

In questo caso all'inizio per far avvenire la reazione userò l'ottimo di pH dell'enzima ma in seguito cambierò il pH per poter quantificare il prodotto.

Quando però misuro l’assorbanza e la conseguente velocità (= pendenza) non posso stabilire con certezza che sia uguale a poiché la curva a quel determinato tempo potrebbe già aver potrebbe il suo andamento

• Semplice

Reazione catalizzata dall’enzima produce direttamente un prodotto facilmente quantificabile.

B* molecola che assorbe la luce ad una certa lunghezza d’onda

• Accoppiato

1. Enzima da dosare non produce nessun prodotto facilmente quantificabile
2. Si aggiunge secondo enzima = Enzima ausiliario (non è la specie da quantificare)

→ in largo eccesso rispetto all’enzima da dosare

3. Enzima ausiliario trasforma prodotto della prima reazione (B) in un prodotto quantificabile cromoforo (C) → ) → )
4. In questo modo calcolo velocità di formazione di C ( e non di B ( → = →
5. Operare in modo di rendere la velocità di

→ Per ottenere velocità uguali devo porre enzima C in grande eccesso.

6. Se l’enzima ausiliario è presente in largo eccesso appena si forma B lo catalizza in C:

[] []= N.B. 2 enzimi compatibili come ottimo di pH e di T, in quanto le 2 reazioni devono essere contemporanee 9

Decadimento termico delle proteine

30/11

Denaturazione

• Proteine esposte a temperature elevate si denaturano = perdita struttura nativa = perdita attività biologica
• “Decadimento” termico

• Processo cinetico cioè avviene nel tempo con una certa velocità
• Equazioni che descrivono decadimento termico delle proteine = equazioni inattivazione termica dei:
• Microrganismi (processo di risanamento termico, pastorizzazione)
• Nutrienti (danno termico).

• 6 Un dato trattamento (t e T ) provoca la denaturazione di una data % delle molecole presenti in forma nativa all’inizio del trattamento stesso.

Esempio processo simulato