Biochimica e analisi biochimica degli alimenti

Principi di spettroscopia UV-vis

La spettroscopia UV-visibile serve per quantificare quanto una luce viene in qualche modo assorbita da un campione. La luce è una radiazione elettromagnetica, descritta sia con una teoria ondulatoria di onda, che con una teoria corpuscolare di particelle. La radiazione elettromagnetica è descrivibile come una sinusoide che si propaga nello spazio. Questa onda è caratterizzabile da varie grandezze.

Caratteristiche dell'onda

Le grandezze che permettono di descrivere questa onda sono:

• Lunghezza d'onda λ si misura in nanometri (nm) [1 nm = 10^-9 m]. Per una radiazione elettromagnetica, in generale per un'onda, la lunghezza d'onda è la distanza tra due massimi oppure due minimi, la distanza è uguale. La lunghezza d'onda esprime la distanza percorsa dall'onda in un ciclo completo di oscillazione.
• Frequenza (v) è correlata alla lunghezza d'onda, e viene misurata in sec^-1. La frequenza esprime il numero di oscillazioni compiute in un secondo, cioè quante volte compie un ciclo completo di oscillazione in un secondo. Frequenza e lunghezza d'onda sono correlate matematicamente perché la frequenza è data dal rapporto tra velocità della luce e lunghezza d'onda.
• Velocità della luce → correla frequenza e lunghezza d'onda. La luce si propaga nello spazio con una certa velocità. Nel vuoto la velocità con cui si propaga la luce è di circa 300000 km/s.
• Intensità, sull'asse delle Y, è l'ampiezza della sinusoide. Quindi se la luce trasmessa ha intensità inferiore, quello che cambia è l'oscillazione della sinusoide che sarà più piccola. La lunghezza d'onda non cambia, la frequenza non cambia, ma cambia soltanto l'intensità, quindi l'ampiezza, della sinusoide.

Spettro elettromagnetico

La radiazione elettromagnetica è la luce caratterizzata dalla lunghezza d'onda. La lunghezza d'onda è fondamentale perché contraddistingue il diverso tipo di radiazione elettromagnetica. Si può costruire un vero e proprio spettro della radiazione elettromagnetica. Lo spettro riporta le diverse lunghezze d'onda da valori molto grandi a valori molto piccoli. Cambiando la lunghezza d'onda, cambia il tipo di radiazione elettromagnetica.

A valori molto bassi, circa 10^-10 m si hanno i raggi X. I raggi X hanno la stessa natura della luce visibile, e sono sempre una radiazione elettromagnetiche. Quello che cambia tra raggi X e luce visibile è la lunghezza d'onda.

Luce visibile

La luce visibile sono le radiazioni elettromagnetiche comprese in un preciso intervallo di lunghezze d'onda: comprese tra 400 e 700 nm di lunghezza d'onda. La luce è un intervallo di lunghezze d'onda: guardando nel dettaglio le lunghezze d'onda, si vede che a diverse lunghezze d'onda, corrispondono diversi colori della luce. [Quelli definiti colori sono in realtà radiazioni elettromagnetiche che hanno diverse lunghezze d'onda]. Lo spettro del visibile mostra come cambia il colore in funzione della lunghezza d'onda. Lo spettro della luce visibile va dal rosso a 700 nm fino al viola a 400 nm.

Luce ultravioletta e infrarossa

• La luce ultravioletta è la luce che ha lunghezze d'onda più piccole della luce visibile. Questa comprende radiazioni magnetiche che vanno circa da 350 a 10 nm. Queste lunghezze d'onda non si percepiscono con la vista. Si chiama ultravioletta perché sono quelle lunghezze d'onda che sono dopo il viola nello spettro del visibile.
• L'infrarosso invece è quella lunghezza d'onda non percepibile che sono più lunghe dello spettro del visibile: si trovano a sinistra rispetto allo spettro del visibile.

Luce bianca e colore

La luce bianca (tipo la luce solare) è la luce che contiene tutti i colori dello spettro del visibile: contiene tutte le lunghezze d'onda dello spettro del visibile. Vuol dire che questa luce contiene diverse radiazioni elettromagnetiche, con diverse lunghezze d'onda che coprono tutto lo spettro del visibile. Questa luce viene percepita dagli occhi come bianca. Quando questa luce incontra un oggetto, può essere che alcune lunghezze d'onda vengano assorbite; quindi solo alcune lunghezze d'onda hanno la capacità di venire assorbite.

Le altre lunghezze d'onda, quelle che non vengono assorbite, possono venire riflesse o trasmesse: si distinguono a seconda se l'oggetto che si sta analizzando è trasparente oppure opaco.

• Un oggetto opaco non le trasmette, quindi riflette le lunghezze d'onda non assorbite.
• Un oggetto trasparente le trasmette, quindi non assorbe nessuna lunghezza d'onda. La luce colpisce il campione, alcune lunghezze d'onda sono assorbite, altre lo attraversano e vengono trasmesse. Il colore che si vede, è dato dalle lunghezze d'onda che vengono trasmesse o riflesse dall'oggetto. Praticamente il colore è dovuto dalle lunghezze d'onda non assorbite.

Il colore che si percepisce è dato dal fatto che alcuni colori vengono assorbiti: in realtà si vedono i colori non assorbiti, cioè quelle trasmesse o riflesse. Un oggetto bianco riflette tutte le lunghezze d'onda, mentre uno nero non ne riflette nessuna. Una soluzione trasparente non assorbe nessuna lunghezza d'onda.

Cromoforo

Si definisce cromoforo una molecola oppure un gruppo di atomi contenuto in una molecola in grado di conferire colore ad una sostanza. Il cromoforo è la molecola in grado di assorbire la radiazione elettromagnetica che ha delle specifiche lunghezze d'onda. Se assorbe la luce a determinate lunghezze d'onda, si vedrà la luce alle restanti lunghezze d'onda. Il cromoforo è in grado di assorbire specifiche lunghezze d'onda. In genere sono costituiti da molecole insature.

Ci sono diversi tipi di cromofori, in base al tipo di molecole, per esempio quello per le molecole con i doppi legami. I doppi legami sono dei gruppi chimici che sono in grado di dare delle proprietà di cromoforo ad una certa molecola.

Per esempio, il benzene. Più anelli ci sono, quindi più la molecola diventa grande, più la lunghezza d'onda assorbita diventa più lunga (più grande). Vuole dire che assorbono una luce che ha una lunghezza d'onda diversa e quindi un colore diverso. In genere, maggiore è il numero di doppi legami coniugati, maggiore sarà la lunghezza d'onda della luce assorbita.

Benzene, naftalene e antracene sono lunghezze d'onda che assorbono luce come gli ultravioletti → la soluzione non sembra colorata perché le lunghezze d'onda non appartengono allo spettro del visibile, quindi non si possono vedere. Viceversa, quando le lunghezze d'onda appartengono allo spettro del visibile (naftacene e pentacene) la soluzione appare colorata. Per esempio il beta-carotene dà colore al vegetale in cui è contenuto, perché contiene molti doppi legami.

Assorbimento e spettrofotometria

Misurare quanta luce assorbe un campione permette di calcolarne e determinarne la concentrazione. In laboratorio, quando si vuole misurare quanta luce assorbe un campione, si utilizza lo spettrofotometro.

Assorbanza

Lo spettrofotometro è uno strumento che permette di selezionare una luce che ha soltanto una lunghezza d'onda, e si può scegliere quale lunghezza d'onda selezionare. La luce che contiene solo una lunghezza d'onda è definita luce monocromatica, perché contiene soltanto una lunghezza d'onda e quindi solo un colore. Questa luce viene inviata sul campione e si può poi misurare quanto viene assorbita. Il campione, del quale si vuole misurare quanta luce viene assorbita, è contenuto in appositi contenitori chiamate cuvette (contenitori con forma di un parallelepipedo). In questi contenitori viene inserita una soluzione che al suo interno avrà disciolta la molecola che si vuole in qualche modo quantificare. Questa molecola deve essere un cromoforo, deve assorbire la luce che ha determinate lunghezza d'onda. Quando si fanno queste misure, sullo spettrofotometro si seleziona una delle lunghezze d'onda che viene assorbita dal cromoforo.

La luce monocromatica che è inviata sul campione viene chiamata luce incidente → luce con una certa intensità abbreviata I₀. Se questa luce ha una lunghezza d'onda assorbita dal cromoforo, la luce verrà in parte assorbita e in parte trasmessa. L'intensità della luce trasmessa, cioè l'intensità della luce che riesce ad oltrepassare il campione, sarà inferiore dell'intensità della luce incidente, perché parte di questa luce è stata assorbita dal cromoforo sciolto nella soluzione.

Trasmittanza

Viene definita trasmittanza (T) il rapporto tra l'intensità della luce trasmessa e l'intensità della luce incidente. La trasmittanza corrisponde alla frazione di luce incidente che riesce ad attraversare il campione. Il massimo valore che può avere è 1: quando il campione non assorbe la luce, quindi quando è trasmessa a intensità uguale alla luce incidente, la trasmittanza ha valore 1 e quindi passa il 100% della luce incidente. Quando la luce viene assorbita, la trasmittanza tende a valori più bassi.

La trasmittanza (la frazione di luce trasmessa) dipende da vari fattori, principalmente dipende dalla concentrazione c che ha il cromoforo in soluzione e dal cammino ottico, cioè dallo spessore che ha la cuvetta (e quindi la soluzione). Maggiore sarà la concentrazione del cromoforo, minore sarà la trasmittanza. Avendo più molecole di cromoforo in soluzione, la quantità di luce trasmessa sarà minore. Maggiore è il cammino ottico, e quindi lo spessore della soluzione attraversata, minore sarà la trasmittanza. Se la luce deve attraversare uno spessore di cammino ottico maggiore, statisticamente incontrerà più molecole di cromoforo e verrà assorbita in maggiore misura. Il cammino ottico è facile da misurare, perché è dato dallo spessore che ha la cuvetta, cioè il contenitore in cui si mette la soluzione. Quindi il cammino ottico si può facilmente controllare e cambiare. Invece, la concentrazione è il parametro che si vuole misurare.

Dal punto di vista pratico, non si lavora quasi mai con la trasmittanza, ma si utilizza l'assorbanza. L'assorbanza (A) è una rielaborazione matematica della trasmittanza. L'assorbanza corrisponde a Quando la luce non viene assorbita, quindi quando la trasmittanza ha valore 1, l'assorbanza vale zero. Quando la trasmittanza vale 0,1 l'assorbanza vale 1 → log(100/10) → log10=1.

L'assorbanza, rispetto alla trasmittanza, è più intuitiva: al crescere della luce assorbita, aumenta numericamente come valore. È una misura di quanto la luce viene assorbita e non trasmessa. È più comoda perché al crescere della concentrazione di cromoforo, cresce anche l'assorbanza perché cresce anche la quantità di luce assorbita.

Questi grafici mostrano come varia l'assorbanza o la trasmittanza in funzione della concentrazione di cromoforo presente in concentrazione.

• Trasmittanza: quando il cromoforo ha concentrazione zero, quindi quando la luce non viene assorbita dal cromoforo, la trasmittanza assume il suo valore massimo, cioè 1. Al crescere della concentrazione di cromoforo la trasmittanza decresce in modo esponenziale e tende asintoticamente a 0 per concentrazioni infinite di cromoforo.
• Assorbanza: correlazione lineare tra assorbanza della soluzione e la concentrazione di cromoforo in essa contenuto. C'è una proporzionalità diretta.

L'assorbanza è preferita alla trasmittanza proprio perché è direttamente correlabile alla concentrazione di cromoforo che si vuole quantificare. In realtà, questa correlazione diretta è valida solo fino a quando l'assorbanza ha complessivamente valori non superiori a 1. Infatti quando si lavora con lo spettrofotometro è normale preferire leggere assorbanze che siano inferiori o uguali a 1.

La legge di Lambert-Beer

Lo spettrofotometro seleziona una lunghezza d'onda monocromatica e la fa incidere sul campione e va a misurare quanta luce arriva al detector: misura l'intensità della luce trasmessa. Rapportando l'intensità della luce trasmessa si calcola la trasmittanza, si converte in assorbanza e si ottiene il valore di assorbanza della soluzione.

Questa correlazione è importante per identificare quanto cromoforo, quindi quanta molecola è presente in soluzione. Per quantificare la concentrazione che ha il cromoforo in soluzione, si utilizza la legge di Lambert-Beer che permette di correlare l'assorbanza che ha una soluzione alla concentrazione del cromoforo presente nella soluzione stessa.

A = ε ∙ c ∙ l

• c = concentrazione del cromoforo in soluzione → concentrazione che si vuole calcolare [M].
• l = cammino ottico, cioè spessore della cuvetta e quindi della soluzione [cm]. Di solito è di 1 cm.
• ε = coefficiente di estinzione molare, parametro che per ogni singolo cromoforo correla l'assorbanza misurata alla sua concentrazione. Questo ε è una proprietà specifica di ogni singolo cromoforo. Questo coefficiente, per ogni cromoforo cambia in funzione della lunghezza d'onda, perché alcune lunghezze d'onda le assorbe mentre altre no. Dal punto di vista numerico, ε è il valore teorico che l'assorbanza dovrebbe assumere quando il cromoforo è concentrato 1 M e il cammino ottico vale 1 cm.

Quindi: A = ε È un valore teorico, perché in realtà è sempre un valore più grande di uno. Come unità di misura ε è M^-1 ∙ cm^-1. L'assorbanza è adimensionale, quindi anche la trasmittanza è adimensionale.

Richiamo di enzimologia

Un enzima non altera gli equilibri di una reazione, ma riduce l'energia di attivazione. La presenza di un enzima permette di raggiungere più velocemente lo stato di equilibrio di una reazione. Lo stato di equilibrio è una proprietà di ogni singola reazione e può essere più o meno spostato verso i prodotti. La velocità di una reazione enzimatica si misura con la velocità con la quale si forma il prodotto o si consuma il substrato, ed è direttamente proporzionale alla quantità di complesso enzima/substrato.

La velocità che assume una reazione, in vitro, dipende da:

• Concentrazione del substrato e di enzimi non cooperativi e cooperativi.
• Concentrazione totale di enzima.
• Temperatura, pH, forza ionica → si possono variare in laboratorio.
• Presenza di molecole effettrici.

Queste curve sono state disegnate considerando uguale quantità di enzima e diversa quantità di substrato. A parità di quantità di enzima, la velocità di reazione dipende dalla concentrazione del substrato. Soprattutto per gli enzimi non cooperativi, la correlazione velocità/verso/substrato è decritta da Michelis-Menten. Considerando queste curve, però, la velocità non è costante nel tempo. Per queste curve la velocità è la tangente di un punto. Alla fine sono delle linee orizzontali: la velocità in una reazione varia con il tempo. Se la velocità varia con la concentrazione di substrato, la velocità che si deve considerare per fare l'equazione di Michelis-Menten è la velocità iniziale. Si riporta una curva che riporta la velocità verso la concentrazione di substrato. Man mano che la reazione procede, il substrato si consuma, diminuisce di concentrazione, la reazione rallenta e cambia la pendenza della curva.

Volendo correlare la velocità di una reazione alla quantità di substrato presente, quando si fa la misura sperimentale, si deve tenere conto della velocità iniziale che ha quella reazione perché solo in quel punto, la concentrazione di substrato è ancora quella che è stata decisa e quindi messa nella provetta [man mano che il tempo passa la concentrazione diminuisce].

Quando cambia la concentrazione di substrato, a parità di enzima, cambia la concentrazione iniziale. Però quando la reazione è terminata (cioè quando ha raggiunto il suo equilibrio), la concentrazione finale che avrà il prodotto dipenderà dalla concentrazione iniziale che aveva il substrato. Più substrato c'era, più prodotto si forma alla fine.

Queste curve mostrano delle curve dove varia la quantità di enzima presente e resta uguale la concentrazione del substrato. Tutte queste curve tendono alla concentrazione finale di equilibrio. Essendo uguale il substrato all'inizio, la concentrazione di prodotto che si forma sarà uguale in tutte e tre le situazioni. Quello che cambia è quanto velocemente si raggiunge il punto di equilibrio. Più enzima c'è, più velocemente si raggiunge il punto di equilibrio. Si arriva allo stesso punto di equilibrio, ma in tempi diversi. La velocità iniziale delle curve dipende da quanto enzima è presente. A parità di concentrazioni di substrato, la velocità è direttamente proporzionale a quanto enzima è presente. L'attività enzimatica viene quantificata in Unità Internazionali (UI): per definizione 1 UI è la quantità di energia che produce 1 μmole P/minuto (in condizioni sperimentali definite e controllate).