2ª e ultima parte degli appunti di biochimica generale

Ciclo degli acidi tricarbossilici ciclo di Krebs

Il 1º destino che può avere l’Acetil-CoA catabolico nel quale viene consumato l’acetato, altro destino è quello di diventare corpo chetonico o c’è un destino anabolico che avviene in condizioni di abbondanza ed è quello di essere usato come precursore degli acidi grassi, quindi l’Acetil-CoA è punto di svolta del metabolismo. Si tratta di 2 atomi di carbonio che entrano nelle reazioni del ciclo e vengono liberati come CO2, si ha il consumo finale del carbonio, se ne va CO2 che verrà trasportata nel sangue fino arrivare ai polmoni e desalata. L’altro prodotto sono i coenzimi ridotti, l’energia liberata consente di avere i coenzimi ridotti i quali potranno portare i loro elettroni alla catena di trasporto degli elettroni per la sintesi di ATP.

Nel ciclo di Krebs non c’è sintesi di ATP, vi è una sola reazione nella quale viene sintetizzato un GTP ma la resa energetica del ciclo è la produzione dei coenzimi ridotti.

Se si guarda il salto energetico della piruvato deidrogenasi per la formazione di Acetil-CoA da piruvato è un bel salto ed è una reazione irreversibile, non solo perché presenta un salto elevato ma anche perché non ci sono altre vie negli animali che possono riportare l’Acetil-CoA a piruvato. Poi l’AcetilCoA entra nel ciclo di Krebs, l’Acetil-CoA non è un intermedio del ciclo ma porta l’acetato al ciclo di Krebs.

Se si guarda complessivamente il totale (-71,2 Kj/mole) si ha nell’insieme un salto energetico ΔG negativo, le reazioni che hanno un ΔG negativo trascinano le altre, complessivamente il ciclo è favorito dal punto di vista termodinamico e alcune reazioni sono fortemente esoergoniche, altre meno, alcune sono endoergoniche. Quando si verificano situazioni di accumulo perché è successa una regolazione particolare o si è in una situazione particolare della cellula, di regola sono presenti in quantità poco più che catalitica.

Reazioni del ciclo

→ 1ª reazione Acetil-CoA + ossalacetato = citrato e il CoA viene liberato, la reazione è catalizzata dalla citrato sintasi, termodinamicamente favorita ed ha un ΔG negativo perché nella reazione viene rotto il legame tioestereo che lega il CoA all’acetato, i legami tioesterei hanno libera idrolisi elevata usata per sintetizzare una molecola più grande rispetto all’altro substrato che è ossalacetato.

→ 2ª reazione ottenuto il citrato avviene l’isomerizzazione a isocitrato catalizzata dall’enzima aconitasi, è un’isomerasi il nome lo prende dal fatto che sull’enzima si forma l’intermedio che non si stacca poiché è abbastanza stabile, si forma aconitato sull’enzima e si forma per eliminazione di una molecola d’acqua poi un’altra molecola d’acqua viene utilizzata ma aggiungendo H e OH in posizioni diverse.

Il citrato è pro-chirale si lega in una situazione definita al sito catalitico, pur essendo una molecola con un C centrale simmetrico, il modo con cui si lega all’enzima predispone la formazione di un solo isomero, è l’enzima che legando in una configurazione il citrato, poi rimuovendo l’acqua fa sì che si ottiene solo isomero strutturale dell’isocitrato. L’aconitasi ha nel sito catalitico il gruppo prostetico formato da ferro e zolfo, una proteina ferro-zolfo c’è il ferro complessato con atomi di zolfo, alcuni legati ad una cisteina dell’enzima, altri proprio zolfo elementare. La formazione di tali strutture dipende anche dalla disponibilità di ferro nella cellula, l’aconitasi nel mitocondrio fa l’enzima ma vi è anche una forma citoplasmatica che svolge un ruolo di sensore della presenza o dell’eventuale carenza di ferro.

→ 3ª reazione isocitrato va incontro a una reazione di decarbossilazione con liberazione di una CO2, un gruppo carbossilico, ma si ha anche un’ossidazione, la reazione è catalizzata dall’isocitrato deidrogenasi, trasferisce elettroni dal substrato al NADH/NADPH e si ottiene alfa-chetoglutarato. Le molecole sono disegnate al contrario volutamente per mettere in evidenza il fatto che i C dell’ex acetato sono quelli che stanno sopra e le reazioni avvengono dall’altra parte, i C che escono non sono quelli che vengono messi nel citrato.

→ 4ª reazione alfa-chetoglutarato va incontro a decarbossilazione ossidativa, una reazione simile a quella della piruvato deidrogenasi, catalizzata dall’alfa-chetoglutarato deidrogenasi, complesso formato da 3 enzimi E1, E2 e E3, diverso almeno in parte perché nel sito catalitico si lega alfa-chetoglutarato e non piruvato, E2 è diverso trasferisce la triidrossi succinilaldeide al CoA (E2 didrolipoil triidrossisuccinilasi) poi E3 deve ripristinare l’acido lipoico, ha come coenzima il FAD poi il NAD. Il risultato è che si ossida il gruppo chetonico a acido, il gruppo carbossilico se ne va come CO2 e viene formato il legame con CoA e si ottiene succinil-CoA. L’energia liberata dalla reazione viene immagazzinata sottoforma di equivalente riducente sottoforma di legame tioestereo tra succitato e CoA.

→ 5ª reazione sfruttare il legame tioestereo che si è formato e l’enzima catalizza l’idrolisi del legame accoppiata alla sintesi di una molecola di GTP, si forma un legame fosfoanidrinico, essa è catalizzata dal succinil-CoA sintetasi e si forma succinato.

→ 6ª reazione succinato ossidato a fumarato, rimozione di 2 idrogeni e formazione del doppio legame catalizzata dalla succinato deidrogenasi che ha come coenzima il FADH2 quindi deve essere collocata in una situazione particolare perché il FAD rimane legato al proprio enzima quindi bisognerebbe definirlo più appropriatamente gruppo prostetico. L’enzima è inserito nella membrana mitocondriale in contatto con proteine che possono farsi carico degli elettroni del FAD e riossidarlo senza che esca dall’enzima poiché ci sono proteine a contatto con esso che trasferiscono gli elettroni al coenzima Q, è un enzima stereospecifico perché degli isomeri che si possono avere, per formazione del doppio legame si forma fumarato e non malato.

→ 7ª reazione l’acido fumarico si trova con un OH aggiunto e un H dall’altra parte, il doppio legame se ne va, si ottiene solo uno dei possibili isomeri L-malato, la reazione è catalizzata dalla fumarasi.

→ 8ª reazione ossidazione malato ad ossalacetato catalizzata dalla malato deidrogenasi, una reazione dal punto di vista termodinamico con un ΔG positivo raffinata dal fatto che l’ossalacetato poi va incontro a una reazione favorita l’inizio del ciclo; il fatto che ci sia possibile conversione tra malato e ossalacetato dovuta a una relativa facilità di un eventuale riformazione del malato se l’ossalacetato aumenta un po’ di concentrazione: un idrossiacido convertito in alfa-chetoacido e viceversa. La malato deidrogenasi è mitocondriale ma ce n’è anche una citoplasmatica e l’azione di entrambe è importante.

Riassunto del ciclo e regolazione

Riassumendo: Acetil-CoA + ossalacetato = citrato, cis-aconitato, isocitrato, ossalsuccinato, alfa-chetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato, ossalacetato.

Nel ciclo si ottengono coenzimi ridotti i quali servono ad alimentare la catena di trasporto e consentire la sintesi ATP, il 1º ruolo del mitocondrio è fare da macchina energetica della cellula, il produttore di ATP.

• → Alto ATP rallentamento del ciclo;
• → Basso ATP (alto ADP) può influenzare positivamente il ciclo.

Se manca ATP si fa andare più velocemente il ciclo, i punti di maggiore regolazione sono la reazioni della citrato-sintasi, isocitrato-deidrogenasi e alfa-chetoglutarato-deidrogenasi.

• → Citrato sintasi risente della presenza dei suoi substrati: ossalacetato e Acetil-CoA, è cooperativo anche con relativa abbondanza di ATP e ADP la reazione avviene per buona sensibilità per i substrati;
• → Isocitrato deidrogenasi modulatore negativo ATP e positivo ATP, sono per lo più delle modulazioni allosteriche, il calcio ha un’azione positiva e il NADH è modulatore negativo: l’abbondanza di NADH è legata al rallentamento della catena di trasporto, se c’è tanto ATP, la sintesi ATP rallenta e se rallenta rallenta la catena di trasporto e si accumula NADH. Ciò vale sia per la isocitrato deidrogenasi che per l’alfa-chetoglutarato deidrogenasi, le forme cariche inibiscono mentre le forme scariche favoriscono.

Gli intermedi del ciclo sono presenti in quantità poco più che catalitica, ciclano. Siccome possono essere usati anche in altre vie e deviare si può avere momentanea insufficienza o carenza di qualche intermedio o si può avere una relativa aggiunta. Se viene sottratto ossalacetato perché c’è la gluconeogenesi nel fegato il ciclo non si ferma, la principale reazione che riequilibra gli intermedi è la reazione vista come 1ª della gluconeogenesi, reazione generale che avviene in tutti i mitocondri ed è definita anaplerotica, reazione di riempimento perciò una relativa carenza di ossalacetato che viene deviato in altre vie è riequilibrato con la reazione della piruvato carbossilasi. Nel fegato, quando attiva la gluconeogenesi ha significato più forte, perché tanto ossalacetato diventa malato, va nel citoplasma e viene trasformato in ossalacetato, in un modo nell’altro viene sottratto al ciclo ma viene riempito dalla piruvato carbossilasi.

Diversi amminoacidi possono arrivare ad alfa-chetoglutarato, si possono avere amminoacidi che nelle vie degradative arrivano a succinil-CoA, altri a fumarato, aspartato che arriva ad ossalacetato. Il citrato viene rappresentato come punto di partenza di acidi grassi e colesterolo, perché il citrato che si forma nel mitocondrio in certe situazioni può uscire andare nel citoplasma ed essere trasformato in ossalacetato e Acetil-CoA per biosintesi di acidi grassi e colesterolo, il ciclo ha un ruolo nel catabolismo ma anche in diverse vie anaboliche.

La reazione della piruvato carbossilasi è un punto di regolazione indiretta poiché ha come modulatore positivo Acetil-CoA, tanto Acetil-CoA non riesce ad entrare nel ciclo per essere demolito e per essere consumato e entrare nel ciclo c’è bisogno di ossalacetato. L’Acetil-CoA che aumenta di concentrazione va a segnalare alla piruvato carbossilasi la necessità di fare ossalacetato così da poter essere consumato ed entrare, tale regolazione ha senso ovunque ma ha un significato particolare nel fegato dove avviene la gluconeogenesi, cioè l’ossalacetato del fegato è usato per la gluconeogenesi.

I coenzimi ridotti vanno alla catena di trasporto degli elettroni quindi non si ha sintesi di ATP nel ciclo di ma avviene la formazione di un GTP che equivale ad un ATP, da ogni mole di NADH che entra nella catena di trasporto è possibile ottenere 2,5 moli di ATP e da ogni molecola di FADH2 che entra nella catena di trasporto è possibile ottenere 1,5 moli di ATP. Da un giro di ciclo, se tutto va bene, e i coenzimi entrano nella catena di trasporto degli elettroni si possono ottenere 10 ATP.

Via del gliossilato

Prima della fosforilazione ossidativa bisogna fare un commento sulla via del gliossilato, via presente nei vegetali dove ci sono i gliossisomi, ha il significato di poter ottenere in modo netto del malato dall’Acetil-CoA, ci deve essere una contestuale presenza del ciclo del gliossilato e del ciclo di Krebs però ci sono 2 enzimi: isocitrato liasi e malato sintasi che non ci sono negli animali, grazie a ciò si può aggiungere ad Acetil-CoA il gliossilato e ottenere malato e dal malato avere ossalacetato. Da Acetil-CoA è possibile ottenere intermedi per fare glucosio, è possibile fare gluconeogenesi anche dall’Acetil-CoA. Per nessun animale è possibile ottenere glucosio in modo netto da Acetil-CoA, visto che Acetil-CoA è il principale prodotto della demolizione dei grassi, semplificando si può dire che dei grassi noi non otteniamo glucosio mentre le piante possono tenere glucosio dei grassi.

Fosforilazione ossidativa

Con fosforilazione ossidativa si intende l’intero processo che si può considerare diviso in 2 parti: catena di trasporto degli elettroni e sintesi di ATP. Fosforilazione intesa come sintesi di ATP da ADP e fosfato che se è ossidativa avviene con la presenza e necessità di ossigeno, indiretta: non è un accoppiamento diretto tra una reazione in cui è coinvolto l’ossigeno e sintesi di ATP, ci sono tanti step, contrariamente a quello che avviene nelle fosforilazione a livello del substrato catalizzate da un enzima che accoppia la sintesi di ATP con una reazione esoergonica. È importante la grande selettività della membrana mitocondriale interna, quasi tutte le molecole/ioni non passano se non hanno un trasportatore specifico. La membrana mitocondriale esterna è molto più permeabile e meno selettiva, l’interna è più estesa dell’esterna perché le formazioni membranose all’interno del mitocondrio sono costituite da membrana interna mentre quella esterna avvolge il mitocondrio. Molto di ciò che accade nella catena di trasporto degli elettroni si gioca a cavallo della membrana interna ed ha un ruolo su ciò che accade nello spazio intermembrana.

La catena di trasporto degli elettroni è costituita da diversi complessi e ciascuno è costituito da molte proteine che hanno la possibilità di cambiare conformazione, possono consentire reazioni e il passaggio degli elettroni.

La reazione che comprende tutta la catena di trasporto degli elettroni da NAD a ossigeno è:

→ NADH + H+ + 1/2 O2 → NAD+ + H2O

Complessivamente è un passaggio spontaneo, va secondo gradiente elettrochimico, gli elettroni vanno da una specie meno affine per gli elettroni (NADH) ad una più affine (O2). I complessi mitocondriali sono complessivamente transmembrana eccetto quello della succinato deidrogenasi rivolto verso la matrice. Da NADH sono coinvolti il complesso 1, il 3 e il 4. I passaggi degli elettroni sono secondo gradiente, ma sono su tanti gruppi prostetici, coenzimi e alcuni trasportatori degli elettroni sono fissi altri mobili. Sono trasportatori collocati nei complessi e consentono il passaggio degli elettroni ma non diffondono da una parte all’altra della membrana/mitocondrio.

Trasportatori mobili

• → NADH diffonde dentro la matrice, è mobile e una volta ridotto sull’enzima che ha catalizzato la reazione di ossidazione del substrato diffonde;
• → Ubichinone (coenzima Q) non è tanto solubile e non sta nella matrice ma nella membrana, essendo un chinone che può essere ridotto i 2 CO dell’anello possono diventare OH e possono prendersi un idrogeno con l’elettrone alla volta, ma questo anello oltre a tali sostituenti piccoli ne ha uno lungo: una catena di tipo terpenico con un N, tale gruppo è ripetuto molte volte ed è una porzione idrofobica che rende l’intera molecola idrofobica, può diffondere ma diffonde in mezzo ai lipidi di membrana;
• → Citocromo C proteina adesa alla membrana dalla parte verso lo spazio intermembrana è mobile.

I trasportatori mobili possono diffondere e andare in un punto all’altro del mitocondrio mentre i fissi sono sono gruppi prostetici che stanno dentro i complessi, sono parte della proteina e sono necessariamente presenti perché i gruppi R degli aa non potrebbero ossidarsi o ridursi con facilità, la pena è la distruzione della struttura dell’aa, le proteine che li contengono sono: flavoproteine, proteine ferro-zolfo, citocromi e cuproproteine,

→ Flavoproteine FAD e FMN la parte che reagisce è la stessa che si possono scambiare sia 2 elettroni alla volta che 1 come fa l’ubichinone, può essere un utile intermedio fra il NAD e il resto dei trasportatori.

→ Citocromi proteine che hanno un gruppo eme che di base è formato dall’anello porfirinico, i 4 pirroli legati insieme; ciò che cambia nei tipi di eme e che caratterizza i diversi tipi di citocromi sono i sostituenti dell’eme: eme B uguale all’eme dell’emoglobina, il C è legato covalentemente al citocromo alla parte proteica, hanno degli spettri di assorbimento diversi quindi hanno colorazioni diverse per questo motivo vengono indicati con un numero che rappresenta la lunghezza d’onda del picco di assorbimento.

Nel complesso 1 si hanno flavoproteina e proteine ferro-zolfo, 2 si hanno proteine ferro-zolfo i citocromi e nel 4 si hanno cuproproteine e altri.

Nel corso della catena, gli elettroni passano dal NADH sul 1º gruppo che si affaccia nel mitocondrio che FMN che può prendersi entrambi gli elettroni del NAD e cederli poi uno alla volta ai centri ferro-zolfo, passano grazie al fatto che il ferro ha 2 stati di ossidazione (2-3) può passare dall’uno all’altro senza distruggere l’architettura del complesso. Quindi si ha il 1º passaggio di elettroni da NADH a FMN e poi gli elettroni sono ceduti uno alla volta su un ferro 3+ che diventa 2+, poi sul gruppo prostetico vicino fino ad arrivare all’ubichinone. Sull’ubichinone arrivano gli elettroni della succinato deidrogenasi (complesso 2) e altri enzimi della membrana che usano FAD. Esso è mobile dentro la membrana e porta gli elettroni al c