Ecologia del Microbiota umano - Domande

Ecologia del microbiota umano (2020/2021) Simone Guglielmetti

Cosa è un ceppo?

Un ceppo è l’insieme di tutte le cellule microbiche teoricamente originate da una cellula progenitrice, quindi sono cellule che hanno idealmente un identico patrimonio genetico. Ogni specie possiede un ceppo type, ossia un ceppo di riferimento che riassume in sé tutte le caratteristiche genotipiche e fenotipiche dei ceppi della specie che rappresenta. Il ceppo type è utilizzato per l’identificazione tassonomica di un ceppo batterico: sono valutate le caratteristiche genotipiche e fenotipiche del ceppo che si sta studiando e poi sono confrontate con quelle del ceppo type, con il fine di attribuirgli un genere e una specie.

Cosa è una specie?

La specie in microbiologia è definita attraverso regole arbitrarie. La specie è l’insieme di ceppi isolati in habitat diversi e in tempi diversi che hanno tre caratteristiche:

• Un’elevata somiglianza fenotipica (metabolismo energetico, morfologia, tipologia di molecole prodotte, etc.) e almeno una proprietà distintiva nei confronti delle altre specie;
• Un’elevata omologia genetica (riassociazione molecolare DNA/DNA > 70%);
• Un’elevata omologia filogenetica (la sequenza di geni che codificano per il 16S RNA ha un’omologia > 98%).

Perché il gene che codifica per il 16S rRNA è chiamato "molecular clock"?

Il gene che codifica il 16S rRNA è posseduto da tutti i batteri ed è fondamentale per la sintesi proteica, dato che è un rRNA che costituisce la subunità minore (30S) dei ribosomi. Per svolgere la sua funzione (riconoscere l’mRNA e tradurlo) il 16S rRNA deve assumere una struttura tridimensionale chiamata stem-loop o a forcina. Se una mutazione modificasse anche solo un nucleotide nel 16S rRNA questo non riuscirebbe ad assumere la struttura tridimensionale e quindi non potrebbe svolgere la sua funzione. Di conseguenza il gene che codifica per il 16S rRNA (che fa parte dell’operone ribosomiale) non muta facilmente, poiché se subisse una mutazione questa non sarebbe trasferita alla progenie poiché l’individuo morirebbe. Per questo motivo il gene 16S rRNA è un gene altamente conservato.

I geni hanno predisposizioni differenti ad accettare le mutazioni: i geni che codificano per funzioni fondamentali per la vita accettano difficilmente le mutazioni, mentre i geni che codificano per funzioni non fondamentali le accettano più facilmente. Il gene che codifica per il 16S rRNA è costituito da tre diverse regioni:

• Regioni conservate, chiamate anche “panbatteriche”, che hanno la stessa sequenza in tutti i batteri;
• Regioni semiconservate, che hanno la stessa sequenza tra batteri dello stesso taxon (es. genere);
• Regioni variabili, che hanno la stessa sequenza tra batteri che appartengono alla stessa specie.

Perciò il gene che codifica per il 16S rRNA può essere utilizzato come orologio molecolare, ossia stabilire le distanze filogenetiche (evolutive) tra i diversi gruppi tassonomici batterici. In particolare, possono essere analizzate le regioni variabili per distinguere diversi generi e specie.

Cosa è la PCR (Polymerase Chain Reaction)?

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una riproduzione in vitro della duplicazione del DNA. La PCR ha lo scopo di amplificare i frammenti nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e finali (in questo caso il 16S rRNA). Per effettuare la PCR servono: DNA stampo (template), primer panbatterico (oligonucleotidi), DNA polimerasi (es. Taq polimerasi), desossiribonucleotidi (dNTP), termociclizzatore.

La PCR avviene in tre fasi:

• Denaturazione, a 94-96°C permette la separazione della doppia elica di DNA;
• Appaiamento (annealing), a 45-65°C (in funzione della temperatura di melting del primer) permette il legame del primer con il DNA stampo;
• Estensione, a 72°C permette la sintesi del DNA da parte della polimerasi.

Il primer panbatterico permette di amplificare una specifica regione del gene 16S rRNA (tra la valle V3 e V4) che comprende regioni variabili. Il primer panbatterico è comune a tutti i batteri.

Spiegare la teoria olobiontica e cosa è l’ologenoma umano

La teoria olobiontica è stata teorizzata da Lynn Margulis e sostiene che l’essere (organismi superiori) è un olobionte. Questo significa che gli organismi superiori non sono solo l’insieme delle cellule che li compongono, ma sono l’unione tra le cellule dell’organismo e tutte le cellule microbiche commensali e simbiotiche che vivono a contatto con l’organismo. L’olobionte è quindi un superorganismo non scindibile, ossia l’organismo superiore non è in grado di svilupparsi e funzionare in assenza del microbiota. L’ambiente ha agito attraverso le pressioni selettive, sia sull’ospite che sul microbiota, determinando il processo di evoluzione dell’intero complesso, l’olobionte. L’ologenoma è l’insieme delle informazioni genetiche dell’ospite e del microbiota.

Cosa sono il microbiota e il microbioma?

Il microbiota è l’insieme dei microrganismi che vivono in un habitat. Il microbioma può avere due possibili significati:

• Le informazioni genetiche dei microrganismi che fanno parte di un microbiota;
• L’intero habitat, ossia i microrganismi, i loro genomi, i loro prodotti e l’ambiente.

Cosa sono la microbiomica e la metagenomica?

La microbiomica studia il microbiota di un habitat e fornisce informazioni riguardanti quali microrganismi sono presenti e in quali proporzioni. La microbiomica è condotta attraverso il 16S rRNA gene profiling, che prevede l’amplificazione e il sequenziamento di una regione del gene che codifica per il 16S rRNA.

La metagenomica studia il genoma di tutti i microrganismi presenti in un habitat e fornisce informazioni riguardanti quali geni sono presenti (quindi le loro funzioni putative) e la loro abbondanza. La metagenomica è condotta attraverso metagenome shotgun sequencing, che prevede la rottura in piccoli frammenti del DNA, il sequenziamento e l’attribuzione di una funzione putativa.

In cosa consiste il 16S rRNA gene profiling?

Il 16S rRNA gene profiling ha l’obiettivo di identificare quali e quanti batteri sono presenti in un campione, quindi studia il microbiota. Per prima cosa si deve prelevare il campione, estrarre il DNA, purificare e amplificare tramite PCR. Si è sicuri di amplificare solo genoma batterico perché si utilizza un primer panbatterico che ad una regione specifica del gene che codifica per il 16S rRNA. Dalla PCR si ottengono gli ampliconi, tutti della stessa lunghezza ma con sequenze nucleotidiche differenti. Gli ampliconi sono sequenziati con tecnologie di sequenziamento next-gen. Le sequenze ottenute sono chiamate read. Le read sono gestite come delle pipeline, ossia delle procedure bioinformatiche e statistiche che permettono di assegnare ad ogni read un nome tassonomico. Le pipeline raggruppano le read con similarità del 97% in OTU (Operational Taxonomic Unit). Le pipeline prendono una sequenza rappresentativa di ogni OTU e le confrontano con sequenze presenti in specifici database. Al termine di questa operazione si ottiene la OTU table, ossia una tabella in cui ogni OTU ha una designazione tassonomica e un dato di abbondanza espresso in numero di read che la costituiscono.

Il 16S rRNA gene profiling solitamente fornisce informazioni fino al genere del batterio non alla specie poiché le OTU sono formate da read che hanno similarità del 97%, mentre un individuo per appartenere ad una specie deve avere omologia filogenetica maggiore del 98%. Oltretutto quando si inseriscono le read rappresentative delle OTU nel database questo fornisce risultati di similarità con più specie.

In cosa consiste il metagenome shotgun sequencing?

Il metagenome shotgun sequencing ha l’obiettivo di identificare quali geni sono presenti nel campione e quali funzioni biologiche hanno, quindi permette di studiare il microbioma. Per prima cosa si preleva il campione, si estrae il DNA, si purifica e si effettua una fase di shotgun, ossia di frammentazione meccanica del genoma presente nel campione. Lo shotgun permette di ottenere dei frammenti piccoli, circa 100 pb. I frammenti sono sequenziati tramite le tecnologie di sequenziamento next-gen, ottenendo le short reads. Le short read sono gestite come delle pipeline, ossia delle procedure bioinformatiche e statistiche che permettono di assegnare ad ogni read una funzione biologica. Le read subiscono una fase di assembling, ossia il software compara tutte le read fino a trovare delle uguaglianze e le ri-assembla formando una sequenza chiamata consensus contig. Il contig rappresenta la sequenza precedentemente rotta con lo shotgun. I contig ottenuti sono sottoposti ad annotation (annotazione funzionale), ossia gli viene attribuito un significato biologico. Il significato biologico è attribuito attraverso le ORF (Open Reading Frame) che permettono di capire quale regione del contig potenzialmente corrisponde ad un gene. Il software confronta i geni ottenuti con quelli presenti nel database e fornisce una tabella in cui sono presenti i pathway metabolici da cui derivano i geni e l’abbondanza di ogni gene in termini di numero di read. È possibile stabilire per i geni dei livelli come i livelli tassonomici, utilizzando per esempio i livelli KEGG (es. livello 1 metabolismo, livello 2 catabolismo energetico, livello 3 glicolisi, etc.).

Cosa sono le OTU e che significato hanno?

Le OTU (Operational Taxonomic Unit) sono delle unità tassonomiche fittizie create per un fine pratico raggruppando le sequenze del gene che codifica per il 16S rRNA usando una soglia di similarità del 97%. Le OTU servono per assegnare un nome tassonomico alle read di batteri appartenenti allo stesso genere o livelli tassonomici superiori e per identificare la quantità, ossia per capire la proporzione dei vari batteri presenti all’interno del campione.

Cosa sono le read?

La read è una sequenza nucleotidica unica corrispondente ad un frammento di DNA sequenziato. Quindi le read si ottengono dal sequenziamento degli ampliconi (nel caso del 16S rRNA gene profiling) e dei frammenti di DNA (nel caso dello shotgun sequencing).

Cosa sono richness, evenness e abbondanza relativa?

Richness è la misura del numero di unità tassonomiche diverse presenti in un habitat. Evenness è la misura della distribuzione dell’abbondanza relativa delle unità tassonomiche. L’abbondanza relativa è la misura del numero di ciascuna unità tassonomica rispetto al numero totale. Queste sono le tre componenti che permettono di descrivere la biodiversità di un microbiota.

Cosa è l’alfa-diversità e cosa sono le curve di rarefazione?

L’alfa-diversità esprime la diversità intra-campione e può essere descritta attraverso degli indici che tengono conto in modo differente della richness e della evenness, e attraverso le curve di rarefazione. Gli indici che descrivono l’alfa diversità sono:

• Chao-1, tiene conto solo della richness tassonomica del campione;
• Shannon e Simpson, tengono conto sia della richness che della evenness del campione;
• Faith’s PD, tiene conto della richness e del rapporto filogenetico tra le unità tassonomiche.

La rarefazione è una tecnica per valutare la ricchezza tassonomica dai risultati di diversi campionamenti di un ecosistema ed è basata sulla costruzione delle curve di rarefazione. Le curve di rarefazione sono un diagramma del numero di unità tassonomiche diverse in funzione del numero di individui. Le curve di rarefazione inizialmente crescono velocemente, poiché si trovano molte specie, ma poi raggiungono un plateau poiché sono ancora da campionare le specie più rare. Gli ecosistemi composti da poche specie sono facilmente saturabili, mentre quelli composti da più specie necessitano di più tempo per la saturazione. Le curve di rarefazione hanno anche la funzione di mostrare se l’analisi di microbiomica è stata in grado di rappresentare tutta la biodiversità del microbiota, ossia se la profondità del sequenziamento è sufficiente per saturare la diversità del campione. Un microbiota composto da molte unità tassonomiche necessita di un numero alto di reads per la sua descrizione.

Cosa è la beta-diversità?

La beta-diversità descrive la diversità inter-campione, ossia descrive le differenze o similitudini esistenti nella composizione tassonomica di due ecosistemi microbici. La beta-diversità è determinata utilizzando due categorie di algoritmi:

• Algoritmi non filogenetici, che non tengono conto della distanza filogenetica tra i gruppi tassonomici, e comprendono l’analisi delle componenti principali (PCA) e l’analisi delle coordinate principali (PoCA);
• Algoritmi filogenetici, che tengono conto della distanza filogenetica tra i gruppi tassonomici, il più utilizzato è UniFrac. UniFrac può essere unweighted, ossia non considera l’abbondanza relativa del taxon (considera solo la presenza e assenza) e weighted, ossia considera sia la presenza o assenza del taxon che la sua abbondanza relativa.

Quali sono le caratteristiche generali dei microbiota associati all’uomo?

I microbiota associati all’uomo presentano una elevata variabilità tra i diversi siti del corpo (sono nicchia specifici): ogni habitat associato al corpo umano possiede dei taxa specifici e varia molto anche la biodiversità. La variabilità inter-soggetto è maggiore della variabilità intra-soggetto nel tempo, ossia il microbiota di due individui differenti varia di più rispetto al microbiota di un singolo individuo nel tempo. Questo suggerisce che l’unicità del proprio microbiota è stabile nel tempo e che questa stabilità sia associata alla salute. L’ultima caratteristica dei microbiota associati all’uomo è la stabilità funzionale, ossia è elevato il numero di taxa che si devono perdere/perturbare prima che sia persa/perturbata la funzionalità dell’ecosistema. Questo significa che il microbiota mantiene le sue funzioni nonostante le perturbazioni. La grande variabilità a livello tassonomico non è rispecchiata a livello funzionale. Questa caratteristica è collegata alla ridondanza funzionale, ossia diversi batteri metabolicamente attivi sono in grado di svolgere le stesse funzioni all’interno di individui differenti (microrganismi differenti sono in grado di svolgere le stesse funzioni).

Descrivere la stabilità di un ecosistema microbico

Le comunità microbiche che risiedono in un ecosistema associato all’uomo sono costantemente sottoposte a perturbazioni. Nonostante questo, gli ecosistemi microbici sono in uno stato di equilibrio. Gli stati di equilibrio stabili che possono raggiungere gli ecosistemi sono limitati e possono essere eubiotici e disbiotici. Alcuni ecosistemi microbici possono assumere degli stati di equilibrio instabili o di transizione, per esempio in conseguenza allo stato fisiologico dell’ospite, oppure in conseguenza ad una perturbazione. Le perturbazioni sono degli eventi esterni che provocano una netta pressione selettiva sull’ecosistema microbico. Le perturbazioni possono essere di due tipi:

• Pulse perturbation, ossia perturbazioni presenti per un periodo di tempo limitato (es. ciclo di antibiotico);
• Press perturbation, ossia perturbazioni presenti per un periodo di tempo prolungato (es. cambiamento permanente della dieta).

Un ecosistema stabile può essere definito se, in seguito ad una perturbazione, mantiene o ritorna allo stato iniziale (sia in termini di stabilità tassonomica che funzionale). Perciò un ecosistema microbico può modificarsi nel tempo (fluttuare) ma ritorna al suo stato iniziale se non ha subito una grave perturbazione. Per questo motivo la stabilità del microbiota è una stabilità dinamica. Un ecosistema resistente è se, durante una perturbazione, è in grado di rimanere invariato; è definito resiliente se, in seguito ad una perturbazione drastica, è in grado di recuperare la sua composizione tassonomica o funzionale iniziale. Lo stato di equilibrio stabile eubiotico è anche chiamato ecosystem service, questo termine descrive i vantaggi del mutualismo microbiota-ospite per i suoi membri individuali. In particolare, solitamente si parla dei vantaggi generati dal microbiota per l’ospite. Lo stato di equilibrio stabile disbiotico è chiamato disbiosi, questo termine descrive uno stato della comunità microbica che è stata alterata e che ha un rapporto causale con uno stato di disfunzione o malattia. Un microbiota disbiotico è correlato ad una bassa biodiversità.

Descrivere il microbiota cutaneo in termini di alfa e beta-diversità

Il microbiota cutaneo è uno dei microbiota associati al corpo umano più alfa-diverso, ossia è costituito da molti taxa batterici poiché è a diretto contatto con l’ambiente. In particolare, le fosse antecubitabili (interno del gomito), essendo una zona umida, sono particolarmente adatte alla crescita di microrganismi, in particolare di quelli ambientali. La superficie cutanea si può distinguere in tre aree principali in funzione delle loro caratteristiche specifiche:

• Aree sebacee, ricche di ghiandole sebacee;
• Aree umide, come le fosse antecubitabili;
• Aree secche, con meno ghiandole e minor umidità.