Ecologia del microbiota umano

Ecologia del microbiota umano

Principi di ecologia

L'ecologia è lo studio scientifico delle interazioni tra gli organismi e il loro ambiente (include le interazioni che gli organismi hanno tra loro e con il loro ambiente abiotico).

Ecosistema: insieme di tutti gli organismi viventi e delle sostanze non viventi con le quali i primi stabiliscono uno scambio di materiali ed energia. L'ecosistema è l'unità fondamentale in ecologia.

Biota: complesso degli organismi viventi che occupano un determinato spazio.

Habitat: ambiente in cui vive una specie animale o vegetale. In un ecosistema ci sono habitat diversi.

Spazio occupato da una specie o da una popolazione all'interno del suo habitat, nicchia ecologica: inteso non come spazio fisico, ma come ruolo e funzioni che gli individui svolgono in un ecosistema, cui una specie utilizza le risorse dell'habitat in cui vive. In altre parole, la nicchia ecologica descrive come un organismo risponde alla distribuzione delle risorse e degli organismi competitori (ad esempio, proliferando quando le risorse sono abbondanti e quando predatori, parassiti e agenti patogeni sono scarsi) e come esso a sua volta altera quei fattori (ad esempio, limitando l'accesso a risorse di altri organismi, fungendo da fonte di cibo per predatori e consumatori di prede).

Ecologia microbica: studio del comportamento e delle attività che microrganismi svolgono nei loro ambienti naturali. Il termine ecologia microbica viene utilizzato in modo generale anche per descrivere la presenza e le distribuzioni di microrganismi in vari ecosistemi (per esempio, per rispondere alla domanda: "Quali microorganismi ci sono nell'intestino umano o sulla superficie cutanea?").

Microbiologia ambientale: si riferisce principalmente all'insieme dei processi microbici che si verificano in un ambiente (il suolo, l'acqua di un lago, un alimento, l'intestino umano) ed ha perciò un significato sovrapponibile a quello di ecologia microbica. La microbiologia ambientale, però, si occupa più nello specifico degli effetti su più ampia scala della presenza e delle attività microbiche.

Struttura di un ecosistema

• Le singole cellule crescono per formare popolazioni.
• Le popolazioni metabolicamente correlate costituiscono raggruppamenti chiamati corporazioni o gilde (guilds).
• Set di corporazioni che conducono processi fisiologici complementari interagiscono per formare comunità microbiche.

Le comunità microbiche interagiscono quindi con le comunità di macrorganismi per definire l'intero ecosistema. La distribuzione dei microrganismi nell'ecosistema naturale dipende dalle risorse (nutrienti) disponibili e dalle condizioni di crescita. Temperatura, pH, disponibilità di acqua, luce, ossigeno di un habitat definiscono la nicchia per ciascun microrganismo particolare.

Interazioni tra organismi viventi in un ecosistema

Neutralismo: copresenza di diverse specie senza che ci sia per esse danno o beneficio.

Commensalismo: interazione non obbligatoria fra due esseri viventi in cui uno approfitta del nutrimento o degli scarti dell'altro senza procurare danno o beneficio. Es: storno e nido abbandonato dal piccione.

Sinergismo: interazione non obbligatoria in cui entrambe le popolazioni traggono beneficio. Entrambe le popolazioni sono in grado di sopravvivere indipendentemente. Es: ape e polline del fiore.

Mutualismo o simbiosi: interrelazione obbligatoria tra due popolazioni che determinano beneficio per entrambe. Es: lichene, associazione tra un fungo e un'alga.

Antagonismo: interazione tra specie nella quale una o ambedue le specie in relazione subiscono un danno. Le principali relazioni antagonistiche sono:

• Antibiosi: inibizione della crescita e riproduzione di un microrganismo da parte di un altro.
• Parassitismo: interazione fra due specie, generalmente a natura trofica, in cui una (parassita) trae vantaggio a spese dell'altra (ospite), creandogli un danno biologico.
• Predazione: interazione in cui un organismo (predatore) usa come fonte di cibo un altro organismo, solitamente di specie differente (preda).
• Competizione: interazione che si verifica quando due popolazioni stanno cercando la stessa risorsa di nutrienti o habitat (per esempio per nutrienti o siti di adesione).

Che cosa sono i microrganismi?

La classificazione dei viventi

Gli organismi viventi vengono classificati secondo la classificazione di Whittaker a cinque regni:

• Monera: procarioti unicellulari (batteri, archeobatteri e cianobatteri o alghe azzurre).
• Protista: eucarioti unicellulari (alghe e protozoi).
• Fungi: eucarioti unicellulari e pluricellulari (lieviti, funghi filamentosi e muffe).
• Piantae: eucarioti pluricellulari.
• Animalia: eucarioti pluricellulari.

I microrganismi si trovano nei primi tre regni, non ci sono in quello delle piante e degli animali. Sono considerati microrganismi anche i virus, i quali possiedono uno stato di esistenza biologica come parassiti obbligati di cellule e costituiscono uno stato non-vivente (stato cristallino) quando sono liberi nell'ambiente.

La classificazione è la collocazione degli organismi viventi all'interno di gruppi tassonomici (i taxa, taxon al singolare) sulla base di similarità o relazioni.

La tassonomia è la scienza che ordina gli organismi in un sistema di classificazione composto da una gerarchia di taxa. La nomenclatura è l'assegnazione dei nomi ai gruppi tassonomici nel rispetto di specifiche regole. L'identificazione è il processo che stabilisce a quale taxon appartiene un nuovo isolato microbico.

La filogenesi o filogenia è il processo evolutivo degli organismi viventi dalla loro comparsa a oggi.

La nomenclatura binomiale fu ideata da Carlo Linneo nel XVIII secolo (1753). Essa è basata sul concetto di specie (unità tassonomica fondamentale), intesa come l'insieme degli individui che presentano un elevato numero di caratteristiche comuni e di somiglianze a livello anatomo-morfologico e, più in generale, fisiologico: tali caratteristiche differenziano gli individui di una specie da quelli di tutte le altre. La nomenclatura binomiale prevede l'utilizzo di due termini latini o latinizzati. Il primo è l'epiteto generico in corsivo maiuscolo, spesso abbreviato alla prima lettera, il secondo è l'epiteto specifico corsivo, minuscolo.

I gruppi tassonomici principali sono Regno, Phylum, Classe, Ordine, Famiglia, Genere, Specie. Per quanto riguarda il ceppo non ci sono regole precise, di solito si tratta di una sigla (es: L. rhamnosus GG). Un ceppo è l'insieme di tutte le cellule microbiche teoricamente originate da un'unica cellula progenitrice e quindi idealmente aventi un identico patrimonio genetico. Il ceppo non ha alcun tipo di tassonomia, si tratta di biodiversità all'interno della specie con grande valore sia in ambito medico che microbiologico.

L'identificazione batterica

L'unità tassonomica di base è la specie, che è definibile nell'ambito della batteriologia come una collezione di ceppi simili che differiscono sufficientemente da altri gruppi di ceppi da giustificare il riconoscimento come unità tassonomica a sé stante.

NB: ogni specie batterica possiede un ceppo type, cioè un ceppo di riferimento che riassume in sé tutte le caratteristiche fenotipiche e genotipiche dei ceppi della specie che rappresenta. I ceppi type si trovano nelle "ceppoteche", cioè nelle collezioni di colture cellulari.

L'identificazione tassonomica di un ceppo batterico consiste nell'assegnazione di genere e specie e si basa sulla valutazione delle caratteristiche fenotipiche e genotipiche e sul confronto di queste caratteristiche con quelle dei ceppi type.

• Caratteristiche fenotipiche: morfologiche, fisiologiche, colturali, nutritive, biochimiche, biostrutturali. Lo studio delle caratteristiche fenotipiche per l'identificazione di un batterio è la via tradizionale seguita da decenni da quella che è definita microbiologia classica.
• Caratteristiche genotipiche: analisi degli acidi nucleici. Approccio più recente basato sulle tecniche di biologia molecolare, che prevede lo studio di DNA e RNA.

Il concetto di specie batterica

Negli organismi superiori le specie sono definite come gruppi di individui interfecondi, ossia potenzialmente in grado di accoppiarsi in natura e dare origine a prole fertile, e che sono ben distinti dagli altri gruppi per quanto concerne l'attività riproduttiva.

Nei batteri la specie è definita come un insieme di ceppi isolati in habitat diversi ed in tempi diversi che possiedono (regole pratiche):

• Una elevata similarità fenotipica, con almeno una proprietà distintiva rispetto alle altre specie;
• Una elevata omologia genetica (riassociazione molecolare DNA/DNA >70%);
• Una elevata omologia filogenetica (omologia di sequenza del gene codificante il 16S rRNA maggiore del 98%).

Al fine di identificare un ceppo batterico a livello di specie si utilizzano i geni conservati (geni che mutano molto lentamente nel corso dell'evoluzione, perché generalmente le mutazioni sono letali). Il più noto di questi geni è quello codificante la sub-unità ribosomiale 16S del rRNA. È considerato un ottimale "molecular clock", un orologio molecolare, cioè è adatto per stabilire le distanze filogenetiche (evolutive) tra i diversi gruppi tassonomici batterici.

Il gene che codifica per il 16S rRNA è un gene appartenente all'operone ribosomale batterico, insieme a quelli che codificano per il 23S e al 5S, che sono separati da regioni dette spaziatrici. Il numero 16, 23 o 5 rappresenta la velocità di sedimentazione di ciascuna sub-unità nel momento in cui avviene una centrifugazione.

Il 16S rRNA codifica non per una proteina ma per l'rRNA, che dopo la trascrizione assume una struttura secondaria specifica affinché essa possa essere riconosciuta dai recettori. Il trascritto del gene è l'rRNA, il quale si autoassembla e assume una struttura tridimensionale che gli permette di svolgere la sua funzione.

N.B.: diverse regioni del DNA possiedono una diversa predisposizione ad "accettare" le mutazioni; così, per avere un elevato potere discriminante, utile a distinguere tra due organismi strettamente correlati tra loro (ad esempio appartenenti ad una stessa specie), sceglierò regioni a più alta variabilità (meno conservate) come ad esempio la regione ITS, o il gene LDH, codificante la lattato deidrogenasi (usato per lattobacilli e bifidobatteri).

Oltre a regioni estremamente conservate, il gene codificante il 16S rRNA contiene regioni variabili che possono rappresentare delle sequenze di riconoscimento di tipo specie specifico, utili per l'identificazione dei batteri. Per questo la determinazione della sequenza del gene codificante il 16S rRNA è diventata molto diffusa in microbiologia come un'alternativa rapida ed accurata ai metodi di identificazione batterica basati sul fenotipo. L'analisi della sequenza del gene codificante il 16S rRNA, quindi, può fornire informazioni per diversi livelli tassonomici, fino al livello di specie, e permette di tracciare relazioni filogenetiche tra i microrganismi.

Sulla base delle sequenze note del gene codificante il 16S rRNA, sono stati preparati degli oligonucleotidi definiti primer universali (o meglio "pan-batterici"), che permettono di amplificare via PCR questo gene virtualmente da tutti i batteri.

Nella sequenza del gene codificante il 16S rRNA si riconoscono diverse regioni:

• Regioni conservate, dette universali o panbatteriche: hanno la stessa sequenza in tutti i batteri;
• Regioni semiconservate: hanno la stessa sequenza tra batteri di uno stesso taxon (ad esempio batteri di uno stesso genere);
• Regioni variabili: hanno la stessa sequenza solo tra batteri appartenenti alla stessa specie.

I picchi del grafico rappresentano le regioni conservate, mentre i minimi sono le regioni variabili.

Il gene codificante per il 16S rRNA, ha il vantaggio di poter essere amplificato usando due soli primer che sono universali o pan-batterici. I primer pan-batterici agiscono nei picchi (regioni conservate) e permettono l'amplificazione dell'intero gene che comprendono all'interno delle regioni variabili, dalle quali si può risalire alla specie. Se due batteri sono della stessa famiglia, come Escherichia coli e Salmonella typhi hanno delle sequenze simili nelle zone variabili, rispetto ad un batterio che appartiene ad un'altra famiglia. In questo modo si può capire anche quanto due batteri siano imparentati tra loro.

Lo studio della filogenesi batterica

Confrontando la sequenza del gene codificante 16S rRNA dei diversi batteri è possibile quantificare la distanza filogenetica, cioè determinare a che punto dell'evoluzione due specie batteriche si sono differenziate. Algoritmi matematici allineano le sequenze dei geni codificanti il 16S rRNA e ne determinano il grado di similarità, che viene espresso attraverso un dendrogramma di similarità o albero filogenetico. N.B.: due ceppi appartenenti alla stessa specie devono possedere una % omologia 16S rRNA > del 98%.

Come si identifica un batterio singolo (metodo molecolare)

• Campione ambientale;
• Isolamento su piastra;
• Batterio in coltura pura;
• Estrazione del DNA;
• Amplificazione del 16S rRNA;
• Sequenziamento del gene 16 rRNA;
• Confronto della sequenza con quelle contenute in GenBank;
• Allineamento e costruzione dell'albero filogenetico.

La PCR è una tecnica che si basa sulla riproduzione in vitro di quella che è la duplicazione del DNA.

Il rapporto tra i microrganismi e l'uomo

Secondo Koch nel 1890 il microrganismo era sinonimo di patologia. Il primo a mettere in evidenza il fatto che i microrganismi non avessero solo funzione patogena fu Metchnikoff: egli capì come i batteri intestinali fossero fondamentali per la longevità dell'individuo e come essi agissero anche come protezione nei confronti di alcune patologie.

I postulati di Koch

• Il microrganismo deve essere sempre presente negli animali che manifestano la stessa malattia, ma non in quelli sani.
• Il microrganismo deve essere isolato da un animale malato e fatto crescere in coltura pura.
• Il microrganismo isolato deve causare la malattia quando inoculato in un animale suscettibile.
• Il microrganismo deve essere isolato una seconda volta dall'animale sperimentalmente infettato.

Tuttavia, questi postulati hanno un grosso limite, solo pochi batteri sono sempre patogeni, mentre alcuni possono essere opportunisti e provocare patologie solo in determinate circostanze. Molti microrganismi, invece, possono instaurare relazioni benefiche con l'ospite.

L'essere umano è un superorganismo, o olobionte, questo significa che per capire come funziona un organismo superiore è imprescindibile considerare anche i microrganismi che vivono associati ad esso. Dunque, l'olobionte è l'insieme dell'ospite e di tutti i microrganismi commensali/simbiotici ad esso associati. La composizione e le funzioni del microbiota sono così cruciali per la vita degli animali e delle piante ai quali sono associati che è stato proposto di considerare gli ospiti e i loro microbiota come una unità ecologica singola: l'olobionte.

Tutti i microrganismi che vivono associati ad un ospite sono il frutto di una co-evoluzione, non sono "scelti" a caso e questo permette di introdurre il concetto di filosimbiosi: ogni ospite è perfettamente adattato al proprio microbiota. I microrganismi di ognuno sono stati "portati dietro" per tutta la vita. L'ologenoma è la somma delle informazioni genetiche dell'ospite e di tutti i microrganismi ad esso associati.

La teoria olobiontica (Margulis L. 1993) sostiene che tutti gli animali e le piante ospitano costantemente una abbondante quantità di diversi microrganismi e afferma che questi microrganismi commensali/simbiotici influenzano in modo molto importante le prestazioni dell'intero olobionte.

La teoria ologenomica di evoluzione considera l'olobionte, con il suo intero ologenoma, come una unità di selezione nel processo evolutivo.

N.B.: sebbene gli ecosistemi microbici associati all'uomo non comprendano solo i batteri, ma anche membri del regno Fungi (lieviti e muffe) e Protista (protozoi), la maggior parte sono batteri, ed al momento la maggior parte delle conoscenze scientifiche riguardano i batteri.

I microrganismi associati all'uomo: terminologia

Quattro categorie fondamentali di microrganismi vivono nel e sul corpo umano: batteri, archea, eucarioti (Fungi e Protisti) e virus. La parola "microrganismi" è usata per riferirsi a tutte le categorie. I microrganismi nel e sul corpo umano adulto medio comprendono l'1%-3% della massa corporea, con i batteri che superano ampiamente gli altri tipi di microrganismi. Stime recenti indicano che il rapporto tra cellule batteriche e cellule umane è di circa 1,3 a 1 (Sender R et al. 2016). L'insieme dei microrganismi che vivono in un qualsiasi habitat è ora indicato come microbiota (singolare o plurale), sinonimo della parola microflora, il cui uso è ora sconsigliato.

La parola microbioma invece ha due significati:

• Il primo significato si riferisce ad un intero habitat in cui risiedono i microrganismi e comprende i microrganismi, i loro genomi e l'ambiente circostante;
• Il secondo significato, più ristretto, è riferito solo ai genomi dei microrganismi presenti in un determinato habitat.