Biotecnologie genetico molecolari

Biotecnologie genetico-molecolari

Introduzione

Le metodologie genetico-molecolari sono indispensabili per una risposta rapida e sicura. Gli alimenti sono veicoli di microrganismi positivi e negativi e poterli riconoscere in tempi consoni con la filiera di distribuzione degli alimenti è fondamentale. Per poter dire quali microrganismi sono presenti utilizzando la metodologia tradizionale sono necessari più giorni perché è necessario isolare la colonia e identificare il microrganismo.

Lo sviluppo di queste tecniche permette di ottenere una risposta in tempi utili e bloccare la commercializzazione di un prodotto alimentare se viene considerato non sicuro; si ha quindi un vantaggio nel campo del controllo qualità. Anche l'innovazione di processo e prodotto deriva da studi fatti sui microrganismi: tutti i prodotti alimentari ottenuti con l'impiego di microrganismi specifici (colture starters) sono studiati per trovare nuove colture starters per ottenere nuove caratteristiche desiderate; queste nuove colture vengono studiate in dettaglio con queste metodologie perché lo studio del DNA permette di conoscere gli aspetti che non si conoscono con il fenotipo e si riesce a capire quali sono i meccanismi con cui i microrganismi intervengono nelle varie fermentazioni per portare al prodotto finito.

La cellula microbica

I batteri sono stati i primi modelli di studio della genetica microbica perché sono le cellule più semplici rispetto agli eucarioti quindi lo studio è più facile; il primo batterio è stato E. coli e poi sono stati fatti studi impiegando B. subtilis che è un Gram-positivo. Di entrambi i microrganismi si conoscono l'intero genoma e i processi con cui la cellula vive in un ambiente ed esprime le sue potenzialità.

La cellula batterica è semplice perché non possiede organelli specializzati quindi tutte le funzioni vengono svolte a livello della membrana cellulare che presenta tantissime funzionalità: oltre a regolare l'entrata e uscita di molecole, la membrana ha la funzione di essere il centro della respirazione per i microrganismi aerobi, o della fotosintesi e a questo livello vengono inoltre svolte le modificazioni di proteine e molecole.

Ciò che ha permesso di studiare i principi della genetica è il fatto che il genoma dei batteri è molto più semplice di quello degli eucarioti, che sono cellule diploidi 2n perché hanno una copia di cromosomi omologhi; la cellula batterica è aploide perché possiede un solo cromosoma e questo non vuol dire che ha meno possibilità di sopravvivenza perché si ha un unico cromosoma molto grande con tutte le informazioni necessarie per la cellula. Nella cellula eucariotica i cromosomi sono in filamenti e in numero diverso.

Si ha quindi un solo cromosoma che è una molecola di DNA a doppio filamento con la tipica struttura a doppia elica ma è circolare e che contiene più di un milione di paia di basi nucleotidiche in sequenze; di conseguenza, il cromosoma dovrebbe avere un diametro mille volte maggiore della cellula ed ecco perché si trova in una forma super avvolta che è una proprietà fondamentale del DNA batterico.

Al microscopio elettronico è visibile come un gomitolo super avvolto e l'avvolgimento non è casuale ma guidato da un numero elevato di proteine che sono deputate ad avvolgere e disavvolgere in modo corretto questa grande molecola di DNA cromosomale. Il cromosoma è impacchettato in una zona del citoplasma cellulare chiamata zona nucleare. Inoltre, i batteri possono possedere del DNA addizionale extra-cromosomale che è più noto con il termine di plasmide, ovvero molecole di DNA a doppia elica circolari e super-avvolte ma di dimensioni molto minori rispetto a quello cromosomale.

Non tutti i batteri posseggono plasmidi, alcuni hanno più copie, altri non ne hanno; i plasmidi sono delle frazioni di DNA che casualmente si sono staccate da DNA cromosomale e hanno circolarizzato con una vita propria perché posseggono le informazioni per autoreplicarsi indipendentemente dalla replicazione del DNA della cellula che li ospita.

Questi plasmidi non posseggono informazioni essenziali per la vita della cellula ma aggiuntive che possono aiutare la cellula a sopravvivere in habitat particolari non perfettamente idonei; a volte i plasmidi possono integrarsi nel cromosoma e vengono chiamati episomi. Sono dei vettori che si sfruttano per trasferire il DNA da una cellula all'altra.

Il ruolo dei plasmidi

Nella foto si può vedere il DNA cromosomale che è uscito da una cellula lisata la cui parete cellulare è stata disgregata, è quasi un ricamo con superavvolgimenti. Nella foto si vedono diverse molecole di plasmidi che hanno dimensioni molto più piccole rispetto al DNA cromosomale; i plasmidi sono stati suddivisi in varie categorie in funzione delle informazioni principali che portano: solitamente codificano per fattori di virulenza perché portano le informazioni necessarie per la formazione dei pili che sono organi di adesione; ad esempio, nel caso di un microrganismo patogeno il primo step dell'infezione è dato dalla capacità del patogeno di aderire alle cellule dell'ospite.

I plasmidi sono anche codificanti per adesine, batteriocine e soprattutto per geni che codificano per l'antibiotico-resistenza; i principali responsabili della trasmissione dell'antibiotico-resistenza sono i plasmidi. I plasmidi vengono definiti elementi genetici mobili perché attraverso diversi meccanismi una cellula può essere in grado di acquisire un plasmide e una volta che ritiene che le informazioni trasmesse non servono lo espelle dalla cellula; i plasmidi sono quindi sono elementi genetici mobili che possono essere acquisiti o persi e di conseguenza possono essere veicoli di trasmissione da una cellula all'altra.

In sintesi

Il contenuto genetico di una cellula batterica è dato da un'unica molecola di DNA super-avvolta circolare e da uno o più plasmidi che codificano per informazioni non essenziali ma possono aiutare la cellula in particolari condizioni. Il fatto di essere mobili fa capire che la cellula nell'evoluzione non ha trasferito le informazioni fondamentali per la vita su un plasmide perché questi possono essere persi e contengono quindi solo le informazioni aggiuntive che possono facilitare la vita della cellula in particolari condizioni. Ad esempio, una cellula in presenza di un antibiotico non ha la capacità di resistere e va incontro alla morte, mentre se possiede il plasmide per l'antibiotico resistenza sopravvive in quel particolare ambiente; questo può essere un problema per l'uomo.

Per i procarioti, il fatto di essere delle cellule semplici non vuol dire avere meno possibilità di sopravvivenza rispetto a una cellula eucariotica in quanto possiedono una capacità di adattamento molto più veloce; l'albero filogenetico rappresenta tre domini della vita: due di questi tre sono relativi alla cellula batterica, ossia bacteria e archea, mentre eukaria è l'ultimo.

Gli archeo-batteri sono cellule procariote ma con una composizione strutturale diversa perché sono estremofili in grado di crescere in ambienti che normalmente non consentono la vita di nessuna cellula e sono stati scoperti più recentemente.

La cellula ancestrale primordiale

La cellula ancestrale primordiale, che è una cellula molto semplice e che ha avuto origine durante il big bang, nel corso di milioni di anni trovandosi in ambienti diversi è riuscita a cambiare ed evolversi e ad arrivare alle cellule procariote; secondo la teoria dell'endosimbiosi evolutiva si è avuta la fusione di due cellule procariote che condividevano lo stesso habitat non più idoneo.

Queste cellule si sono unite per aiutarsi a vicenda dando origine alla cellula eucariotica; la cellula piccola si è specializzata a compiere la respirazione o la fotosintesi (mitocondri e cloroplasti) per recuperare energia. Questa teoria è stata confermata da evidenze scientifiche perché studiando i mitocondri e i cloroplasti si è visto che questi contengono un DNA proprio e ribosomi che sono correlabili a quelli dei batteri confermando la teoria e permettendo di studiare l'evoluzione e la costruzione degli alberi filogenetici perché sono state messe a confronto delle sequenze che erano presenti in tutti i microrganismi conosciuti a partire dal progenitore ancestrale grazie alla capacità di estrarre il materiale genetico dai fossili antichi.

Per costruire la storia evolutiva si è dovuta cercare una macromolecola informazionale che fosse distribuita in tutte le cellule dal progenitore comune con una funzione analoga e che nel corso degli anni ha subito poco variazioni di sequenza in modo tale che possa essere comparata fino alle cellule più evolute permettendo agli studiosi di correlare il numero di variazioni di sequenza alla misura della distanza evolutiva. Ciò che conta è che stata scelta come macromolecola informazionale (orologio molecolare) il RNA ribosomiale 16S che si trova nei ribosomi batterici perché tutte le cellule contengono RNA; la cellula ancestrale probabilmente era costituita solo da RNA e solo in un secondo tempo le cellule si sono evolute con il DNA e dando al RNA altre funzioni.

Inoltre, secondo teoria evolutiva i mitocondri e i cloroplasti possiedono cromosomi simili a quelli batterici permettendo così il collegamento. L'RNA ribosomiale è 16S e S sta per unità Stedberg che è un ricercatore che per primo con l'ultracentrifugazione ha misurato la densità dei diversi ribosomi, i quali possiedono due subunità con densità diversa e nella subunità più piccola è presente 16S che è stato preso come orologio molecolare (evoluzione curiosità). Questo orologio è importante perché il gene che codifica per questo prodotto è uno dei geni più utilizzati nelle tecniche genetico-molecolari in quanto ha una sequenza che è variata pochissimo nel tempo e permette di essere comparata tra specie batteriche diverse e svolgere una corretta individuazione tassonomica dei batteri.

Scambio di energia e materia

La cellula scambia energia e materia con l'ambiente per riprodursi, quindi lo scopo principale è di riprodursi per colonizzare l'ambiente, ma a volte la cellula deve evolversi per le condizioni ambientali in cui si ritrova a vivere; i primi processi di evoluzione batterica sono quelli che vengono chiamati processi di ricombinazione genica che sono compiuti in natura con una frequenza molto bassa, solo quando si ha una difficoltà per la sopravvivenza perché gli esiti dei processi di variabilità non sono noti e possono essere positivi o negativi per cui la cellula rischia di cambiare quando le condizioni non sono più adeguate; se le condizioni sono idonee la cellula usa tutta l'energia per la propria riproduzione.

I processi di ricombinazione sostituiscono nei batteri la riproduzione sessuale dove si ha crossing-over, ma rispetto a questi sono uni-direzionali quindi c'è una cellula donatrice e una ricevente con scopi diversi, sono sempre parziali. La cellula batterica è semplice, non acquisisce porzioni grandi di DNA di un'altra cellula altrimenti non si avrebbe l'equilibrio intra-cellulare quindi il contatto tra cellule è limitato per limitare l'acquisizione di materiale genetico esterno e sono eventi occasionali perché avvengono solo quando cellula ha bisogno di cambiare in un ambiente in quanto non conosce l'esito finale.

Processi di ricombinazione genica

I tre processi studiati a fondo (ma non unici) sono trasformazione, coniugazione e trasduzione; la trasformazione è un’acquisizione di DNA libero all’esterno senza un contatto reale tra una cellula e l’altra, il DNA deriva da cellule lisate che l’hanno liberato e si ha una cellula che riceve parte di questo DNA libero. La coniugazione è un trasferimento di DNA attraverso un contatto tra due cellule con diverse modalità. Infine, la trasduzione è un trasferimento di DNA nella cellula mediato da un fago che nel ciclo precedente ha sbagliato. Sono stati i primi processi studiati in dettagli relativi alla variabilità genica mettendoli poi appunto in vitro per migliorare un ceppo in studio, si differenzia da riproduzione sessuale perché sono unidirezionali, occasionali e unici.

La trasformazione: non tutti batteri sono in grado di compierla, ci sono batteri naturalmente trasformabili perché posseggono dei geni specifici deputati a raggiungere uno stato di competenza, cioè devono avere la capacità di assorbire dall'esterno del materiale genico libero che si trova nell'ambiente. Questa capacità viene indotta da condizioni ambientali non favorevoli che portano la cellula a decidere di cambiare se nell'ambiente circostante sono presenti frazioni di DNA che derivano dalla lisi di cellule che condividevano lo stesso ambiente. La cellula ha bisogno di acquisire il DNA dall'esterno ed attiva una serie di geni (40) che codificano per proteine ed enzimi deputati a questo processo; il primo stadio della trasformazione è di adsorbire sulla superficie della cellula il DNA libero presente all'esterno in quanto ci sono delle proteine in grado di legare a livello della parete cellulare il DNA esterno.

Poi entrano in gioco altri enzimi, solitamente nucleasi, perché la cellula preferisce inserire all'interno una porzione di DNA a singolo filamento, che rompono i legami H che tengono uniti i due filamenti e ne permettono solo a uno l'entrata. Con le proteine di trasporto il filamento entra e poi intervengono altre proteine che sono in grado di riconoscere il filamento e di creare il legame per impedire l'avvolgimento su sé stesso (altrimenti difficile incorporazione). A questo punto, si ha l'intervento di una proteina specifica chiamata proteina REC-A che riconosce a livello del DNA cromosomale dei siti dove le sequenze sono omologhe a parte delle sequenze presenti sul DNA esogeno per permettere l'incorporazione.

La proteina REC-A ha la possibilità di leggere sia sul DNA cromosomale che esogeno e riconosce le sequenze in comune in quanto il DNA può integrarsi solo se trova delle complementarità delle basi; se la proteina trova le sequenze porta il DNA esogeno a livello del sito di integrazione e permette l'inserimento del filamento nuovo. Non è detto che la complementarità sia al 100%, quindi si modifica il codice di lettura e non si sa se si ottengono nuove informazioni geniche o solo una modifica di quelle precedenti. L'attacco è a livello del sito di integrazione che si divide in due e all'interno del sito di omologia si inserisce il filamento nuovo.

Se questa omologia non è presente, la trasformazione non avviene e il filamento esogeno viene degradato e i nucleotidi usati in un secondo momento dalla cellula per il turn-over. Si tratta di un processo semplice per i batteri che hanno lo stato di competenza perché attivano i geni necessari per produrre le proteine e gli enzimi che sono indispensabili per il riconoscimento, l'entrata e l'incorporazione; questa porzione integrata può più o meno contribuire a dare variabilità alla cellula a seconda della sequenza che viene incorporata, l'esito non è noto quindi è possibile che non porti a nulla o conseguenze negative.

Dove c'è l'integrazione si possono avere delle variabilità, mentre senza integrazione il DNA esogeno viene degradato. Questo stato di competenza può essere attivato anche quando all'esterno si ha un plasmide, è un evento più raro perché il plasmide è più grande e deve essere linearizzato per poter entrare all'interno della cellula; questo processo si sfrutta in laboratorio per l'ingegneria genetica perché il plasmide è un'unità autoreplicante e una volta entrato nella cellula non ha bisogno di un sito di integrazione ma può replicarsi in modo autonomo e se porta informazioni utili alla cellula si riesce ad avere una cellula trasformata con caratteristiche addizionali che prima non aveva.

La coniugazione è più conosciuta nei batteri gram-negativi perché molti posseggono il plasmide coniugativo detto anche plasmide F o sessuale perché codifica per la produzione di un pilo F (pilo coniugativo) con cui si riesce ad avere un contatto tra cellula donatrice e ricevente formando un ponte coniugativo. La cellula con il plasmide viene chiamata F+ e quella che non lo possiede viene chiamata F-. Quando il pilo prende contatto si ha il processo della coniugazione: il pilo F ha una struttura cava attraverso cui può passare solo uno dei due filamenti del plasmide F, il quale rompe i legami di un filamento e permette lo srotolamento.

Il filamento passa nella cellula ricevente, secondo il rolling circle e il tempo di contatto è tale da permettere che l'intero filamento passi all'interno della cellula F-. A questo punto, in entrambe le cellule si ha la sintesi del filamento complementare e la ricostituzione del plasmide F nella sua forma nativa quindi la cellula F+ con il ponte coniugativo trasforma la cellula F- in F+. Questo è il processo più semplice che non dà luogo a una grande variabilità genetica perché si acquisisce solamente la capacità di formare il pilo F.

L'evento che causa variabilità in questo processo è quando il plasmide F all'interno della cellula che lo contiene si inserisce nel DNA cromosomale sotto forma di episoma, ovvero si ha un plasmide integrato perché a livello del DNA esiste un sito di riconoscimento per l'integrazione. Queste cellule vengono dette HFR ad alta frequenza di ricombinazione perché quando avviene il contatto tra cellula F+ e F- e si forma il ponte coniugativo tra le due cellule. La formazione del ponte induce il plasmide F, anche se è incorporato, a rompere il filamento e a fare lo srotolamento che avviene a partire da un punto specifico.