Biotecnologia per la difesa delle piante - Appunti

Biotecnologie difesa piante

Prof. E. Stefani

Patologia vegetale e biotecnologie per la difesa

La patologia vegetale è una scienza che studia le malattie, studia quindi le interazioni tra bionti; lo scopo è quello di migliorare la sopravvivenza, la produttività in termini agronomici delle piante o dei sistemi agro-vegetali.

La patologia vegetale ha 2 ampi settori se andiamo a considerare la tipologia degli agenti patogeni: alterazione dovuta a fattori biotici ed alterazione dovuta ad agenti abiotici, fattori agro-ambientali sfavorevoli. Entrambe queste 2 aree possono essere di grande interesse per le biotecnologie per la difesa; pensiamo a tutti gli sforzi che i genetisti stanno facendo per sviluppare ibridi resistenti ad una elevata salinità, oppure alla siccità, soprattutto in ambienti estremi o ambienti che si stanno estremizzando.

Un altro argomento molto moderno riguarda interazioni con agenti abiotici e quello del molecular farming: sviluppo di produzioni vegetali modificando l’ambiente di produzione, quindi il suolo, in modo da ottenere particolari caratteristiche del prodotto o un miglioramento del terreno agricolo (bio remediation). Ad esempio, 10-15 anni di pesco in un’area rendono il terreno non più idoneo alla coltivazione del pesco perché vengono rilasciate delle sostanze che provocano quella che si chiama stanchezza del terreno; il molecular farming può servire per rimediare questo problema, quindi studiare delle rotazioni idonee per avere anno dopo anno una buona produttività e soprattutto per rimediare ai danni causati dalle colture precedenti.

Durante il corso verranno approfonditi tutti gli aspetti che interessano l’interazione ospite-patogeno, cioè pianta ospite e agente biotico patogeno.

Concetto di malattia

Bisogna definire quale è il concetto di malattia per individuare l’ambito in cui andiamo ad operare. Ce ne sono tante di definizioni non molto corrispondenti; io ne ho scelti 2 che non sono esattamente uguali.

Il primo, più comune e più antico, definisce il termine malattia quando le “normali” funzioni fisiologiche della pianta sono interrotte, alterate, inibite da fattori interni o esterni di origine biotica o abiotica. Ci sono cose che però questa definizione non riesce a spiegare; per esempio abbiamo casi in cui una malattia può rendere maggiormente prezioso un prodotto agricolo, abbiamo ad esempio alterazioni virali che danno valore a delle piante ornamentali.

Quindi altra definizione migliore: si parla di malattia quando la risposta e le cellule a stimoli di organismi patogeni o fattori agro-ambientali avversi alterano forma, vitalità, integrità della pianta e portano a uno squilibrio vegetativo o a morte. In questo caso non si parla di valore della produzione; certamente il valore della produzione è notevole.

Da non dimenticare tutte quelle alterazioni di piante spontanee che non interessano economicamente l’agricoltore, dimenticando molto spesso che agenti patogeni possono essere trasferiti da piante spontanee a piante coltivate e in virologia vegetale vedremo la grande importanza che hanno le piante serbatoio, piante spontanee di cui nemmeno si conoscono tutti i virus o fitoplasmi che possono ospitare. La loro importanza virosica è stata spesso sottovalutata ed è stata rivalutata ultimamente.

Noi abbiamo la possibilità di piante che possono ospitare patogeni, i più diversi, senza mostrare alcun sintomo di malattia. Questo è un altro problema di definizione. Abbiamo anche tutto il problema delle infezioni latenti, quindi tutto il problema di interazioni genetiche, molecolari tra un patogeno che è certamente patogeno perché ha dei geni di patogenicità o dei cluster particolari, ma all’interno di una pianta spontanea, di un chenopodium, un amarantus, una portulaca, infestanti, questi geni non vengono espressi: sono presenti, il patogeno è presente, vive, ma non esprime nulla.

Quindi l’importanza di queste piante spontanee e anche coltivate: ci sono piante coltivate che possono ospitare virus senza mostrare in tutta la loro vita dei sintomi ma servono da serbatoio e il patogeno, il virus, può essere tramite un insetto vettore trasportato da questa pianta serbatoio a una pianta di specie diversa su cui il sintomo, dopo un certo periodo di tempo, diventa visibile, perché questi geni di patogenicità, questi cluster riescono ad essere espressi. Vedremo dal punto di vista molecolare come si instaura una malattia dal punto di vista molecolare.

Quindi ci sono molte definizioni ma parziali perché non si prende in considerazione tutta la flora spontanea o la flora coltivata che però non mostra sintomi, non viene infettata da questi agenti biotici.

Struttura del corso

Il corso viene concepito in tre parti. Nella prima parte vedremo di esaminare le interazioni, cioè gli agenti biotici con le piante e l’ambiente, capire in che cosa consiste una malattia. Quando avremo capito il vero significato delle interazioni e tutte le possibilità che queste interazioni hanno, andremo ad esaminare le basi molecolari delle malattie.

Nella terza parte faremo gli interventi biotecnologici per il controllo delle malattie ed il miglioramento della produttività vegetale con le varie tecniche che vanno dal silenziamento genico, all’uso di molecole segnale, etc.

Basi molecolari dell’interazione

Quindi vedremo per le basi molecolari, durante l’interazione, ad esempio un conidio fungino viaggia con l’aria e si posa su una foglia. Ad esempio, se si posa su una foglia di melo avremo lo sviluppo della malattia, se si posa su una foglia di susino no: perché in un caso sì o nell’altro no?

Perché ci deve essere un colloquio molecolare. Come fa il conidio a capire che è sulla foglia di melo? Certamente ci sarà una correlazione chimica, questo comporta la presenza di recettori specifici. Cosa è il recettore? Dove è il recettore? Che tipo di recettore è? Che tipo di molecola questo recettore sente? Una volta che l’ha sentito cosa fa il recettore? Deve trasmettere una informazione e la trasmette come, dove, ha intermedi? Se riusciamo a capire tutti questi eventi riusciamo ad intervenire.

Annotazioni storiche

Non possono mancare un paio di annotazioni storiche. Negli anni 50’ i primi ricercatori riescono a rigenerare in vitro intere piante; le colture cellulari furono già iniziate negli anni 30’, prima della guerra mondiale, ma si capì solamente negli anni 40’ e 50’ che si poteva da un lato rigenerare in vitro intere piante da apici meristematici, successivamente anche embriogenesi da cellule somatiche.

Queste tecniche permettevano il risanamento di piante ammalate e sono tecniche ancora oggi in uso. Ad esempio, si producono delle piante virus esenti o anche batteri esenti perché c’è il rischio che l’apice meristematico delle cellule in moltiplicazione siano cellule di norma non colonizzate dai patogeni, sia virali o batterici o fitoplasmi; quindi da lì si parte per lo sviluppo di piante esenti da malattie.

Però si facevano, ma non si capiva ancora nulla delle basi molecolari della malattia. Solamente negli anni 60’/70’ si è cominciato ad usare dei protoplasti per studiare i meccanismi di infezione virale. Sono gli anni in cui si scoprono le malattie virali e oggi sono diverse centinaia.

L’uso dei protoplasti permette di capire come i virus possono causare malattie, permettono di conoscere l’azione delle tossine. Batteri, funghi, virus producono delle tossine, delle sostanze ad azione velenosa, tossica per le piante e quindi queste tecniche permettono di generare ibridi con diversi gradi di resistenza ai diversi patogeni, più o meno negli stessi anni 70/90.

È stato approfondito lo studio sulla interazione piante-agrobatteri: sono batteri che provocano neoplasie, tumori nelle piante e lo studio dell’interazione molecolare ha permesso a qualcuno di utilizzare questo sistema per trasformare le piante. Gli agrobatteri hanno questa capacità di traslocare sequenze nucleotidiche all’interno della cellula vegetale dove vengono integrate nel genoma; si ha l’inizio per avere piante geneticamente modificate.

Anni 80/90: l’induzione di resistenza sistemica con molecole segnale. Quindi è possibile lavorare “immunizzando” le piante; le piante non hanno un sistema immunitario come gli animali, quindi non è possibile parlare di immunizzazione. Si parla di induzione di resistenza sistemica, quindi di indurre uno stato di sensibilizzazione della pianta in modo che quando arriva un patogeno compatibile questa pianta ha già attivato dei meccanismi locali o generali per contrastare l’infezione.

Questo lo si può fare con delle particolari molecole segnale che sono sia di produzione del patogeno che di produzione del vegetale stesso e si sta ancora lavorando sull’induzione della resistenza sistemica perché è una tecnica molto bella. Trovata la molecola non si fa altro che applicarla sulle piante e queste almeno per una certa fase della loro vita resistono meglio alle malattie, accettano, sopportano le aggressioni dei patogeni.

C’è una cosa da dire rispetto a queste 2 tecniche: noi abbiamo nei sistemi agrari piante annuali, biennali o poliennali, quale tecnica si può scegliere per contrastare le malattie?

Certamente una vite deve andare avanti 30/40 anni; in questo caso una pianta trasformata va avanti fino a morte. In questo altro caso invece una induzione di resistenza è sempre limitata nel tempo. Parlare di induzione di resistenza di molecole segnale in vite vuol dire che devo sempre spruzzarle queste piante anno dopo anno con possibili effetti collaterali, come hanno dimostrato con le pomacee.

Però ci sono anche colture come il pomodoro che vanno avanti poche settimane, pochi mesi, ecco che lì una tecnica di questo tipo, quindi l’uso di molecole segnale, 2 trattamenti in serra, il pomodoro va a maturazione si raccoglie e si butta tutto il resto. Quindi è una tecnica che permette di contrastare alcune malattie in alternativa alla trasformazione delle piante che non è mai bene accetta dal consumatore.

Infine, alla fine degli anni 90’, il silenziamento genico. Il premio Nobel per la medicina per il 2006 è andato a 2 ricercatori americani per il silenziamento genico che molto onestamente hanno ringraziato chi ha scoperto il singolo gene, che sono stati 2 fisiologi vegetali alla Sapienza di Roma. Il merito di questi ricercatori americani fu quello di capire che queste potenzialità potevano avere un riscontro nel settore clinico, cosa che poi ha portato al premio Nobel.

Organismi che causano malattie delle piante

Categoria di organismi che causa malattie delle piante: sono categorie con delle piccole annotazioni. Ci sono anche in patologia clinica e veterinaria dei virus, dei micoplasmi, batteri, vari funghi o miceti, con la sola differenza che in patologia clinica e veterinaria non si conoscono viroidi. I viroidi sono specifici della patologia vegetale al momento.

Ci sono alcune malattie negli animali e nell’uomo causate da un agente che non è presente in questo elenco; l’elenco è completo tranne 1: i prioni al momento non si conoscono in patologia vegetale. Ci sono funghi patogeni vegetali che non sono micotossine ma potenti allergeni.

Ci sono ancora malattie ad eziologia sconosciuta; abbiamo il deperimento della quercia che sta causando notevoli problemi alle foreste del centro e nord Europa, nord America, l’eziologia è sconosciuta. Non sono molte le malattie sconosciute nonostante tutte le tecniche molecolari non si riesce a capire. È importante riprodurre una malattia perché in patologia vegetale è importante la verifica dei postulati di Koch.

Parassitismo e interazioni

Iniziamo il corso parlando del parassitismo, dell’interazione: si chiama parassitismo questa interazione perché i patogeni sono agenti biotici, quelli che noi trattiamo nel corso. Ci sono però diverse tipologie di interazione che a volte sono importanti per la patologia vegetale anche se non parliamo di parassitismo.

Io ho individuato tre possibili interazioni:

• Commensalismo, quindi piante che convivono con microrganismi, batteri, funghi, semplicemente condividono la fonte.
• Simbiosi.
• Parassitismo.

Simbiosi e parassitismo sono differenziati dalla utilità o dal danno, sono interazioni vere e proprie, sono interazioni molecolari. In un caso si parla di simbiosi e nell’altro di parassitismo perché l’uomo è profondamente utilitaristico; quindi in un caso l’interazione tra i 2 bionti è utile come ad esempio le micorrize, interazione che porta a una maggiore capacità nutritiva, metabolica delle radici.

Sono interazioni molecolari come se fossero malattie però, essendo il risultato utile economicamente all’uomo, si parla di simbiosi. Si preferisce limitare il discorso parassitismo quando c’è un danno economico principalmente e nel parassitismo riconosciamo 2 attori principali: un patogeno e un ospite.

Il parassitismo può essere caratterizzato ulteriormente in base all’ecologia, all’epidemiologia, al metabolismo dei patogeni. Come patogeni noi possiamo avere organismi biotrofici, necrotrofici o saprofiti. È importante avere presente queste categorie perché ogni categoria agisce dal punto di vista molecolare in modo diverso, usa delle armi diverse.

È chiaro che un organismo biotrofico ha la necessità di mantenere il tessuto vegetale vivo il più a lungo possibile per nutrirsi, mentre un patogeno necrotrofico per vivere deve cibarsi di qualcosa di morto, di una cellula già degenerata. Per esempio approfondiremo l’importanza degli enzimi pectolitici o cellulosolitici.

È chiaro che un patogeno necrotrofico si baserà nelle sue strategie di lotta su un corredo enzimatico distruttivo per la cellula vegetale, mentre un organismo biotrofico deve penetrare all’interno dell’ospite nel modo più “soft” possibile e cibandosi della cellula vegetale convivendo con la cellula.

Gli organismi saprofiti sono organismi che vivono a spese del tessuto vegetale sia esso vivo, sia esso morto; sono importanti ecologicamente perché sono anche chiamati agenti di degradazione.

Parassitismo e sviluppo delle malattie

Una malattia può essere rappresentata graficamente come una piramide, si chiama modello piramidale delle malattie, o triangolo delle malattie. È una rappresentazione grafica per avere sotto gli occhi una quantità di malattia.

La piramide può avere una forma diversa a seconda di come variano gli spigoli; il modello piramidale prende in considerazione una piramide i cui spigoli sono gli attori che intervengono nello sviluppo della malattia: il patogeno, l’ospite, l’ambiente. C’è una quarta variabile che alcuni autori non considerano, che è l’altezza della piramide, ed è il tempo, il tempo inteso come durata dell’interazione.

È chiaro che variando queste quantità la piramide può avere un volume più o meno grande o una forma più o meno strana. Le variazioni di questi 4 fattori, patogeno, ospite, ambiente e tempo di interazioni, mi determinano con delle formule molto precise la quantità di malattia intesa come incidenza e/o severità. Sulla conoscenza di questi 2 aspetti andiamo a lavorare con il miglioramento genetico.

Incidenza è intesa come numero di individui malati su una popolazione totale, quindi può essere 10 spighe di grano su 100, una percentuale. Severità è una parola italiana che a me piace, deriva dall’inglese severity, severità mi descrive la gravità del sintomo.

Ad esempio, prendiamo 2 malattie che voi conoscete: la ticchiolatura del melo e il giallume della vite. Abbiamo un fungo da una parte che è Venturia inaequalis che colpisce diverse varietà di melo; dall’altra parte abbiamo alcuni fitoplasmi che causano questa alterazione che sono i giallumi della vite.

Se tu avessi un meleto preferisci elevata incidenza e bassa severità nella ticchiolatura o bassa incidenza ed elevata severità? È importante perché questo è uno dei punti cruciali della ricerca biotecnologica per quanto riguarda la patologia vegetale. Se voi non sapete se agire sull’incidenza o sulla severità non ha senso fare biotecnologie.

Abbiamo detto che incidenza rappresenta una percentuale di individui ammalati su una totalità di individui, come severità intendiamo la gravità del sintomo. Dipende chiaramente dal modello piramidale, gli attori in un contesto o nell’altro reagiscono in un modo diverso.

Io sto cercando di capire il nemico, il patogeno, come agisce per individuare la strategia di intervento. Questo patogeno mi va ad agire sull’incidenza o sulla severità? Il mio materiale genetico, i miei genotipi mostrano più debolezza nell’aspetto incidenza o nell’aspetto severità?

Se ho un genotipo altamente suscettibile posso avere elevata incidenza ed elevata severità chiaramente, però questi sono 2 genotipi come ad esempio chardonnay, alta severità e bassa incidenza. Avete un meleto con elevata incidenza e bassa severità: io ho bisogno di avere il numero minore di mele possibile con delle macchie, quindi entra in gioco un aspetto commerciale.

Quindi mi serve un genotipo non che sia tollerante, ma che sia resistente. Di quello tollerante non mi interessa niente perché mi arriva il patogeno e mi fa una macchia su tutte le mele che non vendo oppure vendo a basso prezzo.

Mentre per la vite preferisco una elevata incidenza perché mi concede di avere un raccolto. La vite tollera, quindi un genotipo tollerante mi dà una elevata incidenza ma siccome l’organo principale infetto è la foglia e solo in subordine quando la severità è molto elevata viene infettato anche il grappolo, io vado a vedere magari una elevata incidenza però con bassa severità raccolgo più o meno la produzione normale. Questi sono aspetti che il biotecnologo deve conoscere.

Le quattro variabili

Vediamo le 4 variabili: variabile patogeno, è variabile perché i patogeni si differenziano non solo per specie e genere ma ciascuna specie o ciascun taxon sub-specifico si differenzia per delle peculiarità biologiche, ecologiche, genetiche, fenotipiche, la