Biologia molecolare applicata alla diagnostica

Biologia molecolare applicata alla diagnostica

Programma

• Transgenesi: esperimento in vitro e in vivo; aggiunta di un gene al genoma, costruzione gene transgenico, inserimento nella cellula e selezione cellulare; inibizione gene con ricombinazione omologa e non omologa; analisi molecolare dopo la ricombinazione; topi knockout condizionali e modello del fago.
• Trascrizione: fattori di trascrizione e domini; enhancer, geni omeotici, recettori nucleari, PCR e RT-PCR e geni reporter.
• Epigenetica: struttura nucleosoma, istoni, rimodellamento cromatina; immunoprecipitazione e EMSA.
• RNA: miRNA, siRNA, long non-coding RNA.
• Splicing alternativo: processo dello splicing alternativo, modello di CD44 e BCR con tumore alla mammella.
• Tumori: oncogeni e oncosoppressori; tumore al colon.
• Diagnosi prenatale: amniocentesi, villi coriali e prelievo di sangue materno.
• Fibrosi cistica e distrofia di Duchenne.
• MEN: neoplasie endocrine multiple.

Transgenesi

La transgenesi è lo studio delle funzioni dei geni all'interno di animali viventi. Un modello di studio più semplice è quello delle cellule adattate a crescere in un ambiente artificiale come le piastre di coltura, su queste piastre le cellule vengono fatte aderire e vengono fatte crescere: per farle crescere c'è bisogno di un ambiente sterile altrimenti si possono avere contaminazioni batteriche e di parassiti vari.

Si deve avere un terreno di coltura nel quale vi sono i fattori di crescita e nutrienti che possono variare in base al tipo di cellula che stiamo utilizzando. Solitamente si utilizza un liquido generico che è il siero bovino che è una miscela con tutti i nutrienti e i fattori di crescita, questo siero viene aggiunto in base al tipo di cellula con percentuali diverse.

Per permettere la crescita cellulare si ricopre la plastica della piastra con un collagene che permette quindi l'adesione delle cellule, altre cellule invece come le cellule del sangue non crescono in adesione ma crescono in sospensione nel mezzo di cultura. In questo modo si può quindi studiare ad esempio l'azione di un ormone +, di un fattore di crescita, o di un farmaco e vedere quindi la cellula come risponde a tale sostanza.

Questi studi vengono definiti in vitro ma, quello che succede in vitro è esattamente quello che succede anche nella cellula in vivo? Non sempre in quanto le cellule di molti tessuti hanno una polarità quindi hanno una parte apicale e poi delle parti baso-laterali, le cellule si vanno a disporre quindi una di fianco all'altra e a formare delle giunzioni in queste cellule ci sarà quindi una direzionalità del funzionamento delle molecole infatti in alcuni casi i nutrienti possono arrivare dal lato apicale oppure dal lato baso laterale, questo ci dice che c'è quindi un'organizzazione della cellula che non possiamo ottenere mettendo le cellule in coltura, vi sono quindi una serie di modelli in cui le cellule vengono forzate su dei substrati per cercare di andare a ricreare le stesse situazioni ma ci sono comunque dei limiti perché la risposta in questo caso potrebbe essere diversa da quella fisiologica, o ancora le interazioni cellulari che si vengono a creare in vivo non possono essere ricreate e quindi non possono essere studiate.

Si stanno quindi utilizzando dei modelli intermedi come, ad esempio quelli degli organi iperfusi che vengono utilizzati soprattutto per il metabolismo dei farmaci, ad esempio in un animale in cui si vuole studiare la quantificazione di un farmaco a livello del fegato, si considera la vena che porta il farmaco al fegato cioè la vena porta e poi la vena epatica che fa fluire il sangue dal fegato. Il farmaco viene quindi iniettato all'interno della vena porta, si lascia per un determinato tempo e poi si va ad aspirare il sangue dalla vena epatica e si va quindi a considerare la concentrazione di farmaco che rimane, se è diminuita effettivamente sta a significare che quel farmaco viene quindi assorbito a livello epatico.

Un altro metodo è quello di considerare degli organi ed effettuare una serie di piccoli pezzettini in modo tale da generare dei cubi di tessuto che sono stati poi adattati su una piastra, su questo tessuto sono stati fatti poi una serie di esperimenti in questo modo andavamo quindi ad avere tutte quelle determinate cellule che vanno a costituire quel determinato tessuto e quindi tutte le risposte che derivano dai vari esperimenti, questo è un metodo che fa uso degli organoidi.

Con questo sistema si possono anche utilizzare dei substrati di tipo organico come i polimeri sul quale vengono fatte attecchire le cellule in modo tale che si vadano a formare delle strutture tridimensionali, in questo modo si vanno a stabilire anche i contatti tra le cellule che si stabiliscono all'interno di un tessuto, questi polimeri vengono ad esempio utilizzati anche per la medicina rigenerativa infatti, ad esempio nel caso di un osso rotto si vanno a utilizzare dei polimeri speciali in maniera tale che quando questi polimeri vengono ricoperti dagli osteoclasti, vanno a mimare l'osso che può essere quindi sostituito a quello malato.

Una delle prime cose che si va a studiare sugli animali interi, sono i farmaci infatti sappiamo che un farmaco prima di essere messo in commercio deve subire una serie di prove, con le quali si deve verificare l'efficacia del farmaco e soprattutto si deve verificare che quest'ultimo non è tossico. Questo lo si può fare sulle cellule, ma comunque si deve effettuare una verifica anche sugli organismi viventi, in quanto molte volte i vari farmaci possono avere un'efficacia elevata e una bassa tossicità in vitro, in vivo sugli animali da laboratorio, ma poi sull’uomo possono avere gli effetti sperati.

Può essere utilizzato anche per studiare la funzione di un gene, infatti si può andare a modificare il patrimonio genetico dell'animale e questo prende il nome di transgenesi o anche definiti come organismi geneticamente modificati (OGM). Ma si può manipolare il genoma anche andando a togliere un gene, in questo caso si parla di animali nulli o knock-out, in cui il gene è stato reso nullo, infatti le due coppie alleliche non funzionano più.

Aggiunta di un gene

Esperimento del salmone: è stato generato un salmone transgene, è stato modificato andando ad aumentarne la crescita; hanno preso il gene dell'ormone della crescita del salmone che come negli altri pesci l'ormone della crescita non è prodotto in maniera continua tutto l'anno ma solo in determinati periodi che sono quelli dell'estro quindi in primavera ed in autunno, hanno quindi preso il gene dell'anguilla che ha una produzione costante dell’ormone, e hanno così generato un salmone che cresce in maniera continua, si è visto che in condizioni normali in circa 800 giorni il peso massimo che un salmone può acquisire è di circa 4 kg, mentre invece con il salmone modificato in circa 700 giorni si vanno a raggiungere 6 kg.

Con i vari studi quello che si è capito è che se vado ad operare alla fine del periodo di gestazione avrò che solo nel punto in cui ho posizionato il mio gene aggiuntivo questo viene espresso quindi, non avrò un animale geneticamente modificato ma avrò modificato soltanto quel determinato tessuto.

Questo ci fa quindi capire che bisogna andare ad operare in una fase molto più precoce dell’embriogenesi, quando quindi abbiamo ancora che fare con una fase di totipotenza delle cellule cioè quando le cellule non sono ancora differenziate perché solo in quel momento il gene che viene acquisito diventa patrimonio della cellula in cui si andrà ad esprimere.

Con la fecondazione noi abbiamo che la cellula uovo viene raggiunta dallo spermatozoo che si attacca ad essa e va a rilasciare il pronucleo maschile, e quindi in un primo momento andremo ad avere questi due pronuclei che poi si vanno a fondere e vanno a generare un nuovo animale: inizialmente quindi si agiva sul pronucleo maschile in quanto è più grande e quindi molto più semplice da raggiungere, si utilizzava quindi una tecnica detta microiniezione in cui la femmina viene trattata con estrogeni in modo tale da produrre una grande quantità di cellule uova, gli ovociti vengono prelevati e vengono fecondati questo viene effettuato in vitro per poter seguire il momento in cui i due pro nuclei si fondono, osserveremo quindi tutto al microscopio al quale sono collegati dei bracci mobili che a loro volta sono collegate a delle micropipette molto sottili che hanno all'interno il DNA del gene che vogliamo inserire.

Sotto il controllo del microscopio si muove il braccio che attraversa la parete dell'ovocita e se arriva sulla parete del pronucleo maschile all'interno del quale viene inserito il DNA del gene, e poi si aspetta che i due pronuclei si fondono e si genera l'embrione, il prodotto ottenuto si va ad impiantare in un topo di sesso femminile che deve essere già stato trattato con ormoni in maniera tale che è già pronto per un'eventuale gravidanza, in questo modo si genera il fondatore transgenico.

Questi esperimenti però non vennero fatti soltanto sui topi ma anche su altre specie come bovini, suini ed ovini e si è visto che avevamo il 100% di iniezione in quanto potevamo seguire l'inserimento del gene all'interno del pronucleo maschile di tutte le specie, ma già con l'impianto andavamo ad avere una diminuzione della percentuale, infine la percentuale arrivava a circa il 20% per i topi nati vivi dei quali però i topi transgenici erano circa l’1%, considerando quindi l'efficacia molto bassa questa metodologia nel tempo è stata abbandonata.

Si è quindi utilizzato una seconda strategia con la quale andavamo a prendere le cellule uovo molto più avanti nello stato di embriogenesi e infatti si aspettava la fusione dei due pronuclei, la formazione della blastocisti fino ad avere una struttura di circa 32 cellule e solo a livello di queste cellule si andava a fare l'iniezione del transgene, con questa modalità la percentuale di topi vivi e transgeni saliva al circa il 10%, questa efficienza era migliore rispetto alle precedenti ma comunque non era particolarmente elevata. Quindi cosa è stato pensato di fare, la cellula ottenuta con il transgene la vado a selezionare e la vado ad isolare e faccio in modo che questa cellula continua a crescere.

Costruzione gene transgenico

I geni degli eucarioti sono organizzati in esoni ed introni, la superficie del DNA che è occupata da un gene è molto grande la grandezza dipende dalle dimensioni della proteina che quel gene andrà codificare, ci possono essere geni che sono composti anche da un numero di basi maggiore di un milione.

Per introdurre un frammento di DNA così grande all'interno di un vettore bisogna utilizzare i vettori di clonaggio che sono dei frammenti di DNA che possono accomodare frammenti di DNA esogeno e consentono quindi la propagazione di questi frammenti di DNA, questi vettori possono ad esempio essere plasmidi o fagi. Ognuno di questi vettori ha una propria capacità, quindi possono accomodare frammenti di DNA di una certa dimensione.

Si vanno ad utilizzare questi vettori e quando si introduce questo costrutto nelle cellule eucariotiche possono insorgere delle modifiche come delle delezioni, quindi il DNA viene frammentato perché troppo grande e in questo modo frammenti più piccoli sono più gestibili. Ci si può però trovare in una condizione in cui ci sono una serie di frammenti che possono perdere una delle due estremità, come 5’ e 3, per evitare questa cosa si è pensato quindi di andare ad utilizzare il cDNA che è il DNA complementare all’mRNA, questo perché l’mRNA non contiene gli introni, quindi risulta essere molto più piccolo del DNA che corrisponde al gene.

Il cDNA che viene prodotto deve essere completo, cioè di lunghezza intera deve infatti cominciare dal cap e finire con la coda poliA, questo perché si devono avere tutte le informazioni sia per la parte codificante ma anche per le regioni all'estremità che possono essere delle sequenze che possono avere un ruolo di regolazione.

Bisogna poi inserire il cDNA all'interno di un vettore che sono tutti capaci di crescere all'interno di un batterio. Per poter crescere però devono avere una serie di caratteristiche, devono infatti contenere l'origine di replicazione altrimenti il DNA non si replica, e poi deve avere un gene per la resistenza ad un antibiotico, inoltre sappiamo che il cDNA porta solo le sequenze ma per avere la trascrizione di un gene dobbiamo avere anche un promotore che viene inserito al 5’ del cDNA, i promotori possono essere di vario tipo infatti possiamo avere promotori semplici, complessi, con la TATA box, senza la TATA box, promotori ubiquitari o promotori cellule specifici.

La scelta del promotore bisogna essere seguita in base alle esigenze sperimentali infatti se si vuole inserire una proteina che deve essere espressa in tutte le cellule dell’organismo, allora bisogna utilizzare un promotore ubiquitario se invece si vuole trascrivere solo all'interno di un determinato tipo di cellula o di tessuto allora si dovrà utilizzare un promotore tessuto specifico. Il promotore scelto deve essere fuso con il cDNA in modo tale da mantenere una cornice di lettura capace di produrre l'esatta proteina.

Inoltre, per la costruzione del vettore transgene abbiamo bisogno del gene della resistenza alla neomicina, che in un terreno ricco di neomicina fa sì che la cellula sopravvive; accanto al gene della resistenza alla neomicina si va poi ad inserire un altro gene, è un gene che codifica per un carattere fenotipico morfologico, il gene è più semplice da utilizzare e il gene agouti che codifica per un particolare tipo di pelo, infatti il Topolino classico di laboratorio ha un pelo liscio di colore bianco o grigio, questi peli agouti sono invece ispidi e neri. Se si introduce questo gene all'interno del Topolino questo andrà conferire il pelo scuro al manto del topo. Quindi già visivamente possiamo vedere se il topo esprime il transgene se va ad avere quindi il manto aguti.

Inserimento del materiale genetico esogeno all'interno della cellula

Questo processo prende il nome di trasfezione e abbiamo quattro tecniche diverse:

1. Calcio fosfato Ca2PO4: si forma questa molecola che tende a precipitare, se la formazione di questa molecola la si fa avvenire a contatto con le cellule andremo ad avere che le cariche negative della molecola vanno ad interagire con le cariche positive dei fosfolipidi di membrana e si vanno quindi a formare delle interazioni abbastanza forti. Quando si forma questa molecola essa è in grado di formare delle reti tridimensionali, un vero e proprio reticolo nel quale si dispone il DNA. Questi reticoli attraverso le cariche del fosfato prendono contatto con la membrana e la membrana va quindi incontro alla formazione di una serie di pori attraverso i quali le molecole di calcio fosfato entrano all'interno della cellula trascinando con sé il DNA esogeno.
2. Lipidi cationici: il lipide più utilizzato è la lipofectamina, che forma delle vescicole dove all'interno si va a depositare il DNA esogeno. Questi lipidi interagiscono con le cariche della membrana facendo quindi entrare il DNA all'interno della cellula, la densità di carica è molto più alta e la quantità di DNA che riescono ad inglobare è maggiore, dunque l'efficienza di questa tecnica risulta essere più alta.
3. Liposomi: sono strutture a doppio strato lipidico, quindi simile alle membrane per questo vanno a generare delle vescicole ricoperte appunto da questo doppio strato lipidico, all'interno delle quali si va a depositare il DNA. Vengono quindi messe a contatto le due membrane che vanno a fondersi e si ha in questo modo il rilascio all'interno della cellula del DNA esogeno.
4. Elettroporazione: si introduce il DNA all'interno della cellula sottoponendola a uno shock elettrico, le cellule sono disposte in una cuvetta, ai due lati della cuvetta sono disposti due poli elettrici attraverso i quali si fa passare la corrente elettrica che va provocare una rottura del potenziale di membrana e fa quindi entrare il DNA.

Con le prime tre tecniche il DNA entra all'interno della cellula in grande quantità e va a formare degli ammassi che prendono il nome di concatenameri, cioè dei polimeri concatenati uno dopo l'altro. L'elettroporazione invece consente di introdurre all'interno della cellula singole copie di DNA nel caso della transgenesi però è indifferente che ci siano una copia di DNA, anzi maggiore è il numero di copie maggiore sarà l'efficienza.

Si possono andare ad utilizzare anche i vettori virali, in particolar modo si utilizzano i retrovirus che sono dei virus ad RNA e hanno delle regioni che prendono il nome di LTR, che vanno ad avere delle sequenze che codificano per una serie di proteine: si sostituiscono alcune di queste sequenze con il gene di interesse e si va a generare una struttura simile a quella del retrovirus, ma questi vettori virali non possono essere perché possono interagire con pseudo sequenze virali che possiamo avere all'interno del nostro genoma, vanno quindi a riarrangiarsi e possono portare alla formazione di nuovi ceppi virali e quindi a nuove infezioni. Si è passato quindi a adenovirus che sono dei virus a DNA e vanno ad avere una minore capacità di riarrangiamento, anche se hanno delle caratteristiche che possono portare alla generazione di alcuni tumo