Biologia Molecolare

Struttura e topologia di DNA e RNA

Le cellule sono costituite principalmente da DNA, RNA, proteine e metaboliti. Tutti gli organismi usano gli acidi nucleici come materiale genetico e tutti codificano la loro informazione genetica con le stesse modalità. L’insieme completo delle informazioni genetiche di un organismo è chiamato genoma, tutti i genomi sono codificati da acidi nucleici del DNA o RNA.

Molti biologi nella prima metà del XX secolo credevano che il materiale genetico delle cellule dovesse essere costituito dalle proteine per via della troppa semplicità del DNA, infatti gli acidi nucleici sono formati da polimeri relativamente semplici di sole 4 lettere, mentre le proteine sono polimeri molto più complessi composti da 20 aminoacidi diversi e quindi potenzialmente capaci di contenere più informazione. Quest’idea risale a uno scienziato chiamato Levene che propose una scorretta struttura del DNA, struttura tetranucleotide, secondo cui il DNA è costituito da quantità uguali di basi azotate.

Esperimento di Griffith

Griffith e Avery sono dei ricercatori chiave nella scoperta del DNA come materiale genetico, infatti nel 1928, in quello che è chiamato esperimento di Griffith, Griffith scopre che il DNA è il materiale genetico dei batteri: il batterio Pneumococcus uccide i topi causando la pneumonia, la virulenza del Pneumococcus è associata alla sua capsula polisaccaridica che permette al batterio di scappare dalla distruzione e non essere ucciso dall’ospite. I vari tipi di Pneumococcus hanno vari tipi di polisaccaridi divisi in due gruppi: S, da “smooth”, hanno la capsula, portano i topi alla morte solo se i batteri non venivano uccisi dal calore; R, da “rough”, non hanno la capsula, non portano i topi alla morte, non è virulento.

Mescolando batteri di tipo S uccisi dal calore a batteri di tipo R i topi morivano: qualcosa, potere trasformante, è passato dai batteri virulenti ma morti ai batteri non virulenti ma vivi. Il fattore trasformante era quindi materiale genetico in grado di resistere all’inattivazione al calore e trasferire informazione genetica dai batteri S a quelli; in questo modo i batteri di tipo R inglobano il DNA libero dei batteri di tipo S acquisendo la capacità di formare la capsula.

Esperimento di Avery

Esperimento di Avery, purificazione del DNA: Avery, MacLeod e McCarty ripetono 16 anni più tardi l’esperimento di Griffith ma questa volta non più con batteri inattivati al calore, ma con estratti delle molecole costituenti i batteri S. Capiscono che il materiale che causa la trasformazione è il DNA, tuttavia il DNA può essere contaminato da proteine. Per questo motivo nella ripetizione dell’esperimento usarono degli enzimi che distruggono le proteine, proteasi, l’RNA, RNAasi, ed il DNA, DNAasi, e solo nell'ultimo caso non succedeva nulla e capirono che era il DNA a essere responsabile del principio trasformante. Le proteasi non annullarono la trasformazione dei batteri di tipo R in batteri di tipo S, mentre le DNAasi annullarono la trasformazione dei batteri di tipo R in batteri di tipo S. In conclusione, il potere trasformante è il DNA perché fornisce i geni che codificano per gli enzimi che permettono ai batteri di tipo S di produrre la capsula.

La trasformazione è l’acquisizione di nuovo materiale genetico attraverso l’incorporazione di DNA in cellule procariotiche, batteri ma anche lieviti. Se invece una cellula eucariotica viene trasformata allora diventa tumorale.

La trasfezione è l’acquisizione di nuovo materiale genetico attraverso l’incorporazione di DNA in cellule eucariotiche.

Esperimento di Hershey e Chase

In quegli anni molti ricercatori si dedicano a studiare il ciclo replicativo dei fagi, Professor Hershey e studentessa Chase utilizzano i batteriofagi T2, virus che infettano i batteri, per chiarire definitivamente quale fosse il materiale genetico. Il genoma fagico è formato da DNA mentre tutte le altre parti del batteriofago sono di natura proteica. Il fago, virus, si attacca alla cellula, batterio, es. E. coli, iniettando al suo interno il proprio cromosoma, il cromosoma batterico si frammenta e quello fagico si replica. L'espressione dei geni del fago genera le sue componenti strutturali e le particelle della progenie fagica si assemblano. La parete batterica va incontro a lisi rilasciando la discendenza fagica.

Usando un frullatore essi separarono il rivestimento proteico dal nucleo dei batteriofagi, Fago T2. Per rintracciare le due componenti del virus lungo il suo ciclo vitale, i due ricercatori le marcarono con isotopi radioattivi selettivi.

Le proteine contengono zolfo, negli amminoacidi cisteina e metionina, un elemento che non compare nel DNA. Lo zolfo presenta un isotopo radioattivo, ³⁵S. Hershey e Chase fecero sviluppare il batteriofago T2 in una coltura batterica contenente ³⁵S, in modo da marcare con questo isotopo radioattivo le proteine delle particelle virali risultanti.

Il DNA è ricco di fosforo, nell’ossatura desossiribosio-fosfato, un elemento normalmente assente nelle proteine. Anche il fosforo presenta un isotopo radioattivo, ³²P. Così i ricercatori fecero sviluppare un altro lotto di T2 in una coltura batterica contenente ³²P, in modo da marcare con questo isotopo radioattivo il DNA virale.

Iniettando acido nucleico nella cellula batterica trovarono che era l'acido nucleico in sé e non la proteina che causava la trasmissione di informazioni genetiche e conclusero che i geni sono formati dagli acidi nucleici del DNA.

Quello che successivamente si è scoperto è che i batteri sono anche in grado di difendersi dalle infezioni dei fagi ed è proprio grazie a questi studi che si sono identificati gli strumenti che si usano nella moderna biologia.

Dogma centrale della biologia

Il dogma centrale della biologia afferma che l’informazione genetica non può essere trasferita dalle proteine agli acidi nucleici, ma soltanto dagli acidi nucleici ad altri acidi nucleici e proteine, il processo è unidirezionale.

• DNA → proteina.
• RNA → proteina.
• DNA → RNA.
• RNA → DNA.

L'informazione in un acido nucleico può essere trasferita o tramandata ma essa è irreversibile in un polipeptide. Nel genoma umano si hanno circa 6 miliardi di caratteri.

Ogni cellula umana ha:

• 46 cromosomi.
• 2 metri di DNA.
• 3 miliardi di nucleotidi.
• Circa 20.000 geni codificano per proteine che svolgono la maggior parte delle funzioni vitali. Il DNA è sempre legato a proteine, se non è legato a proteine allora è un artefatto.

Basi azotate e zuccheri

Il DNA contiene quattro tipi di basi azotate:

• Adenina (A), purina.
• Guanina (G), purina.
• Citosina (C), vi sono anche 5-metilcitosina (5mC) e 5-idrossimetilcitosina (5hmC), pirimidina.
• Timina (T).

L’RNA contiene l’uracile (U) al posto della timina.

N.B: si parte a numerare gli atomi dell’anello da un atomo di azoto che ha quindi il numero 1. Adenina e guanina sono purine, hanno un doppio anello eterociclico, citosina, timina e uracile sono pirimidine, hanno un singolo anello eterociclico.

Il DNA contiene il 2-desossiribosio, con un atomo di idrogeno (-H) legato in posizione 2’. Ciò rende la molecola stabile, durata di tutta la vita. L’RNA contiene il ribosio, con un gruppo ossidrile (-OH) legato in posizione 2’. Ciò rende la molecola molto instabile, durata da pochi minuti a massimo venti ore, con eccezioni di pochi giorni. N.B: gli atomi di carbonio di ribosio e 2-desossiribosio si chiamano 1’, 2’, 3’... per distinguerli dagli atomi di carbonio delle basi azotate.

Nucleosidi e nucleotidi

Un nucleoside è formato da una base azotata legata alla posizione 1’ di uno zucchero pentoso. In particolare, ci sono:

• Adenosina = adenina + zucchero. Il legame è tra l’azoto 9 della base azotata ed il carbonio 1’ dello zucchero.
• Guanosina = guanina + zucchero. Il legame è tra l’azoto 9 della base azotata ed il carbonio 1’ dello zucchero.
• Citidina = citosina + zucchero. Il legame è tra l’azoto 1 della base azotata ed il carbonio 1’ dello zucchero.
• Timidina = timina + zucchero. Il legame è tra l’azoto 1 della base azotata ed il carbonio 1’ dello zucchero.
• Uridina = uracile + zucchero. Il legame è tra l’azoto 1 della base azotata ed il carbonio 1’ dello zucchero.

Un nucleotide è formato da un gruppo fosfato legato alla posizione 5’ o 3’ dello zucchero e da una base azotata.

Esistono nucleotidi monofosfati, un gruppo fosfato, difosfati, due gruppi fosfati, trifosfati, tre gruppi fosfati. Nelle cellule i nucleotidi trifosfati sono i più comuni.

Nel DNA i nucleotidi prendono il nome di deossiadenosina 5’-monofosfato (dAMP), deossiguanosina 5’-monofosfato (dGMP), deossitimidina 5’-monofosfato (dTMP), deossicitidina 5’-monofosfato (dCMP).

Il cAMP, adenosina monofosfato ciclico, non ha funzione di contenere l’informazione genetica per il fatto che 5’ e 3’ sono legati a gruppo fosfato e quindi impegnati, pertanto la molecola non può entrare nel DNA o RNA, ma è una molecola segnale. L’enzima adenilato ciclasi è in grado di rimuovere da una molecola di adenosina 5’-trifosfato (ATP) due gruppi fosfato mentre due atomi di ossigeno del rimanente gruppo fosfato sono legati al carbonio 3’ e al carbonio 5’ del ribosio formando un ciclo. L’enzima fosfodiesterasi è in grado di demolire il ciclo formando AMP semplice.

Molecole adiacenti di ribosio o 2’-desossiribosio, all’interno di una catena polinucleotidica, sono unite per mezzo di un gruppo fosfato tra il carbonio 3’ di uno zucchero e il carbonio 5’ dello zucchero successivo, sono entrambi legami fosfodiestere. Per convenzione, si scrive la molecola di DNA iniziando con un carbonio 5’ e finendo con un carbonio 3’.

N.B: il primo nucleotide ha un gruppo fosfato libero legato al carbonio 5’, l’ultimo nucleotide ha un gruppo ossidrile libero legato al carbonio 3’.

Struttura del DNA e modello a doppia elica

La struttura del DNA venne inizialmente studiata da Rosalind Franklin, l’esperimento consisteva nella cristallizzazione del DNA sottoponendolo ai raggi X, da questa interazione si crea uno spettro con ombre a raggi X degli atomi, questo spettro viene interpretato. Il DNA purificato è strutturato in forma ordinata formante un cristallo per cui si può usare la diffrazione per comprendere la struttura.

Rosalind Franklin non fornì un modello di struttura adeguato, infatti pensava che il DNA fosse a singola elica, ma per mezzo delle macchie fotografate provò a risalire alla struttura del DNA. Nel 1953 Watson e Crick pubblicarono un modello della struttura a doppia elica, una emielica è lo stampo dell’altra, del DNA, tutto ciò grazie alle fotografie di Rosalind Franklin e alla conoscenza del fatto che c’è lo stesso numero di adenine e timine e lo stesso numero di citosine e guanine. Hanno quindi scoperto la complementarietà: all’interno di una molecola di DNA l’adenina è sempre appaiata con la timina e la citosina è sempre appaiata con la guanina. Gli organismi che vivono a temperature più alte sono più ricchi di citosina e guanina, tre legami idrogeno, gli organismi che vivono a temperature più basse sono più ricchi di adenina e timina, due legami idrogeno.

La struttura secondaria del DNA è formata da due filamenti polinucleotidici avvolti l'uno intorno all'altro: si tratta quindi di una doppia elica. I legami tra zucchero e fosfato sono situati nella parte esterna dell'elica, mentre le basi sono allineate al suo interno; i due filamenti polinucleotidici corrono in direzioni opposte, ossia antiparalleli.

Il DNA è formato da una struttura tridimensionale a doppia elica, poiché le basi azotate di una emielica formano legami idrogeno con le basi azotate dell’altra emielica, in questo modo le adenine formano legami idrogeno doppi con le timine e le citosine formano legami idrogeno tripli con le guanine, le basi azotate giacciono perpendicolarmente all’asse della doppia elica. La seconda forza che tiene uniti tra loro i due filamenti del DNA è l'interazione tra le basi adiacenti, che contribuisce a stabilizzare la molecola dell'acido deossiribonucleico non richiedendo che una determinata base segua a un'altra; pertanto la sequenza delle basi nella molecola è libera di variare, consentendo al DNA di contenere le informazioni genetiche.

Solco maggiore e solco minore

L’angolo di legame tra le basi e lo zucchero determina uno spazio più ampio su una delle superfici delle molecole che esteso a tutte le molecole determina quello che chiamiamo solco perché forma un vero e proprio solco da una parte e dall’altra della catena di DNA; la doppia elica ha un solco maggiore e un solco minore, ciò accade per via dei differenti angoli di legame tra le basi azotate e le molecole di zucchero.

N.B: le dimensioni del solco maggiore sono tali da far entrare una proteina ad alfa-elica che interagisce con il DNA riconoscendone la sequenza, se invece tale proteina dovesse entrare nel solco minore allora dovrebbe deformarlo. Le dimensioni di un’alfa elica delle proteine entrano perfettamente nel solco maggiore per cui il DNA viene “letto” da alfa eliche che si inseriscono preferenzialmente nel solco maggiore del DNA e grazie alla successione di interazioni deboli tra gli aminoacidi delle proteine e le basi azotate si formano dei legami non covalenti che permettono alle proteine di legarsi specificamente a sequenze del DNA dette DNA binding sites o consensus sequences per una data proteina.

Forme del DNA

Il DNA e l’RNA possono formare diversi tipi di strutture. La più comune è la forma B, ma possono formarsi anche strutture diverse e persino triple eliche contenenti una molecola di DNA ed una di RNA o di DNA a singola elica. La doppia elica di DNA è solitamente destrogira, B-DNA, e forma più del 99% del DNA presente nelle nostre cellule.

La struttura tridimensionale di Watson e Crick è definita DNA-B, essa si manifesta quando una grande quantità d'acqua circonda la molecola e non è presente alcuna sequenza insolita di basi nel DNA, contraddizione, condizione comune nella cellula. La forma B del DNA è la più stabile nel caso di una sequenza casuale di nucleotidi in condizioni fisiologiche, e gran parte delle evidenze indica che è quella predominante nella cellula.

• Il DNA-B è un'alfa-elica, il che vuol dire che presenta una spirale che assume un andamento destrogiro. Esso possiede circa 10 bp ogni 360° di rotazione dell'elica; in questo modo ogni coppia ruota di 36° rispetto alle basi adiacenti. Il DNA-B evidenzia una struttura relativamente snella e allungata.
• Il DNA-A è presente quando il contenuto in acqua è inferiore. Analogamente al DNA-B, anche la forma A è un'alfa-elica ad andamento destrogiro ma è più corta e ampia rispetto alla forma B e le sue basi si scostano dall'asse principale della molecola.
• Il DNA-Z forma un'elica sinistrorsa. In questa forma lo zucchero-fosfato assume un andamento serpeggiante. Le strutture di DNA-Z possono essere presenti sia in condizioni fisiologiche sia quando si rilevano particolari sequenze di basi. Alcune porzioni di determinati geni attivi assumono la forma Z, indicando che quest'ultima può giocare un ruolo nella regolazione della trascrizione genica.

Il DNA a tripla elica è formato dalle interazioni di Hoogsteen le quali fanno sì che molecole di RNA a singola elica siano in grado di legarsi al DNA formando una struttura a tripla elica. Si formano ulteriori legami deboli in cui una U o T forma due legami deboli su un adenina che forma la doppia elica con la timina e la C che forma legami deboli con la guanina impegnata in un legame con la citosina nella doppia elica.

Topologia e superavvolgimento

Il diametro della doppia elica di DNA è costante ed è di 20 Armstrong. Compie un giro completo ogni 34 Armstrong, con 10 paia basi ad ogni giro. Esistono condizioni in cui il DNA è più compresso per cui il giro completo avviene con meno di 10 basi ed in quel caso il DNA è definito supercoiled o supercoiled positivamente, se invece un giro completo si ottiene con più di 10 basi allora il DNA è più rilassato e si può anche definire supercoiled negativo. Quando il DNA si trova in questa situazione di maggior o minor compattezza viene definito topoisomero.

Visto che la molecola di DNA tende ad avere solo 10 basi per giro nel caso in cui è rilassato tenderà ad aprirsi con regioni avvolte con 10 basi per giro e regioni aperte. Nelle nostre cellule la maggior parte del DNA è superavvolto negativamente, perché se fosse superavvolto positivamente allora sarebbe più difficile essere denaturato, separare le due emieliche, e ri-naturato, riunire le due emieliche, durante il processo di duplicazione. Attraverso la denaturazione gli avvolgimenti sono zero poiché vi è uno srotolamento del DNA come avviene nella duplicazione, nel resto della molecola aumentano gli avvolgimenti per permettere lo srotolamento in un’altra zona, vi è una diversa distribuzione degli avvolgimenti. Non è possibile denaturare ulteriormente poiché si creerebbe un problema di tipo fisico e sterico.

Se il DNA è circolare o è fissato alle estremità, allora il numero di avvolgimenti non può cambiare, di conseguenza se una porzione di tale DNA è superavvolto negativamente, allora un’altra porzione di DNA è superavvolto positivamente. In particolare, se è in una regione è molto superavvolto positivamente allora in un’altra regione le due emieliche risultano addirittura separate.

Il bromuro di etidio rende visibile il DNA, poiché diventa fluorescente se sottoposto a r