Biologia molecolare

Appunti di biologia molecolare della cellula biotecnologie

Cafarelli A.

Introduzione al corso

Professori: Calautti, Ghigo, Brancaccio.

Libro di riferimento: “Biologia molecolare della cellula”, Alberts.

Alla fine di questo file troverete una lista con i riferimenti alle pagine del libro per ogni argomento trattato. Non diffondere il file.

Cafarelli A.

Microscopi e introduzione al corso

• Microscopio elettronico a trasmissione (TEM): in 2D, taglio parallelo alla loro lunghezza, vari strati sovrapposti per immagine 3D.
• Microscopio elettronico a scansione (SEM): in 3D.

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• Doppia elica del DNA: nel 1953 Nobel Watson e Crick.
• Esperimenti di Meselson e Stahl nel 1958.
• Teoria cellulare:
  • Essere viventi sono diversi tra di loro, assumono materia dall’ambiente circostante per duplicarsi.
  • Viventi formati da una o più cellule, che sono le unità strutturali e funzionali derivanti da cellule pre-esistenti.
  • Virus non sono esseri viventi, perché non sono formati da cellule e non sono in grado di replicarsi autonomamente.
  • Contengono informazioni genetiche e la usano per riprodursi.
  • La cellula è la più piccola entità biologica capace di replicazione autonoma.
  • Adattamento all’ambiente e selezione naturale.
  • Possono prendere energia dall’ambiente circostante e utilizzarla per le proprie funzioni.
  • Utilizzano le molecole ottenute dall’ambiente esterno per sintetizzare nuove molecole biologiche.
  • Regolano il loro ambiente interno (omeostasi: equilibrio ottimale a cui l’organismo cerca di ritornare quando questo viene turbato).
• Un organismo pluricellulare si genera da divisioni cellulari di una singola cellula, lo zigote.

Struttura della cellula

• Origine della specie per selezione naturale di Darwin e Wallace (1859): concetto unificante di biologia, ogni membro di una specie è diverso, prole è sovrabbondante, competizione per risorse, trasmissione dei caratteri vantaggiosi.
• Cellula fatta per 70-80% di H₂O, il resto da atomi di C legati con O, H, N, S, P.
• Dogma centrale della biologia: flusso di informazioni dal DNA, all’RNA e alle proteine.
• Cellula eucariotica: ha nucleo con doppia membrana contenente DNA e mitocondri. È compartimentalizzata (organuli per diverse funzioni).
• Vantaggi della compartimentalizzazione: microambiente con cofattori concentrati (aumenta interazioni), controlla ambienti chimici, sostanze pericolose sequestrate in organuli. Però devono essere trasportati e le attività devono essere integrate.
• Procariote: membrana cellulare, nucleoide immerso nel citoplasma, flagelli, parete cellulare. Membrana esterna solo in alcuni batteri.
• Batteri GRAM positivi: parete singola fatta di peptidoglicano che trattiene il colorante blu.
• Batteri GRAM negativi: parete doppia fatta di fosfolipidi, non trattiene colorante blu.
• Globulo rosso maturo è anucleato.

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• 5 regni: funghi (con muffe e lieviti), piante, monere (unicellulari privi di nucleo come batteri e alghe azzurre), protisti (unicellulari o pluricellulari) e animali (eucarioti pluricellulari autotrofi). Sono esclusi i virus perché sono ospiti dell’organismo che attaccano).
• Dominio Archeae: procarioti che vivono in laghi salati e sorgenti termali calde.
• Cellula compie lavoro: meccanico, di trasporto, chimico. Usa ATP.
• ATP + H₂O = ADP + Pi + 7,3 Kcal.
• Mitocondri: membrana esterna e una interna, sono sede della respirazione cellulare. Hanno creste, matrice e spazio intermembrana. DNA in forma circolare codifica per 13 geni per produrre proteine specifiche. Deriva da endosimbiosi tra procariota aerobio ed eucariota anaerobio.
• Reticolo endoplasmatico: RER (Rugoso, contiene ribosomi sulla superficie) e REL (liscio, senza ribosomi, deposito di Ca). Concamerazioni e tubuli membranosi.
• Apparato del Golgi: faccia cis (verso interno) e trans, serie di vescicole piatte. Partenza per gemmazione, aiuta proteine a assumere la conformazione e la loro modificazione.
• Perossisomi: per redox.
• Involucro nucleare negli eucarioti o carioteca: doppia membrana con spazio perinucleare, membrana esterna continua con RE.

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• Citosol: parte non strutturata di citoplasma (acqua e componenti idrosolubili).
• Eterocromatina: addensata, non accessibile a trascrizione.
• Eucromatina: rilassata, accessibile a trascrizione.
• Nucleolo: comprende geni per rRNA, trascritti di rRNA, sintetizza ribosomi.
• Ribosomi: aggregati di RNA (4 rRNA) e proteine.

"Differenziamento cellulare: zigote 8 blastomeri totipotenti blastocisti cellule totipotenti.

Membrane cellulari

• Modello di Davinson-Danielli: doppio strato fosfolipidico tra due strati di proteine.
• Criodecappaggio: tecnica che usa il freddo per separare una membrana (7 nm).
• Fosfotidilcolina: fosfolipide della membrana con testa polare fatta di colina, 2 catene idrocarburiche e glicerolo fosfato. Doppio legame cis.
• Membrana cellulare asimmetrica: foglietto esterno e interno diversi.
• Fosfatidilserina e fosfatidiletanolammina: fosfolipidi sul lato negativo della membrana (interno).
• Fosfatidilcolina e sfingosina: fosfolipidi sul lato esterno della membrana.

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• Liposomi: sfere di fosfolipidi che tengono fuori H₂O.
• La sfera minimizza il rapporto tra area di superficie e volume.
• Colesterolo: 4 anelli condensati, struttura planare, testa polare e coda idrocarburica.
• Lipid rafts o zattere lipidiche: microdomini di membrana specializzati per compartimentalizzare funzioni, assemblando temporaneamente complessi proteici.
• Barili beta: proteine transmembrana multipasso (come porine).
• Proteine integrali di membrana: alfa elica destrogira idrofobica, porzione esterna glicosilata con ponti S-H e dominio citoplasmatico.
• Esperimento di Frye e Edidin: proteine mobili nella membrana.
• Cortex cellulare: intelaiatura proteica a cui sono attaccate proteine transmembrana (spettina nel cortex dei globuli rossi).
• Glicolipidi: catene di carboidrati + lipidi.

Trasporto attraverso le membrane

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• Diffusione: movimento casuale verso equilibrio.
• Trasporto passivo: secondo gradiente, non richiede ATP.
• Diffusione semplice: passiva, senza carrier, richiede ATP.
• Diffusione facilitata: passiva, richiede carrier e ATP.
• Gradiente elettrochimico: forza netta risultante del potenziale elettrico e del gradiente di concentrazione.
• Pompe di tipo P: tramite fosforilazione di ATP, trasporto di Na, K, Ca⁺⁺ e H.
• Pompe di tipo V: subunità diverse, trasferiscono H nei lisosomi e a organelli acidi.
• Trasportatori ABC: pompano piccole molecole.
• Pompe ATPasi invertite di tipo F (o ATP sintasi): per respirazione cellulare. Usano gradiente di H per sintetizzare ATP.
• Pompa ATPasi del Ca²⁺: il suo livello deve essere 10^-7 fuori dalla cellula e 10 alla -3 dentro.
• Pompa sodio-potassio: potassio va portato dentro, il sodio fuori. È elettrogenica (cioè crea potenziale elettrico, 3 Na fuori e 2 K dentro).
• CTRF: pompa della famiglia ABC, regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica. Mutazione del gene CTRF influenza trasportatore di ione Cl.

Mitocondri

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• Mitocondri: organelli plastici e mobili, ereditano DNA materno (non secondo regole di Mendel). Sono presenti solo negli eucarioti (procarioti producono ATP su membrana cellulare).
• Mitocondri presenti anche in spermatozoi e (soprattutto) in cellule muscolari.
• Teoria endosimbiotica: batterio aerobio fagocitato da cellula eucariotica priva di membrane interne. Prova: mitocondri e cloroplasti contengono ATP.
• DNA mitocondriale: circolare, geni compattati, uso rilassato del codice, codice genetico variante (4 dei 64 codoni hanno significati diversi).
• Omoplasmia: genomi mitocondriali in individuo sono uguali.
• PEO: Oftalmoplegia esterna progressiva cronica, patologia che si verifica a causa di una delezione o duplicazione del DNA mitocondriale. Perdita di mobilità dei muscoli extraoculari, debolezza del muscolo della palpebra e ptosi (palpebra calante). Quando la malattia progredisce i muscoli diventano fibrotici e si arriva ad una completa paralisi dei muscoli oculari.
• LHON: neuropatia ottica ereditaria di Leber, patologia che si manifesta in individui omoplasmici, dovuta a mutazioni del mtDNA che alterano tre geni codificanti la subunità del complesso I della catena respiratoria. Fa perdere la vista improvvisamente in tarda adolescenza.
• ATP sintasi: F0/F1 sintasi, funziona mediante catalisi rotatoria, nella membrana interna dei mitocondri.

Tappe della respirazione cellulare

• C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ => 6 CO₂ + 6 H₂O
• In tutto si generano 36/38 ATP.
• 1) Glicolisi: genera dal glucosio 2 piruvato, 2 ATP (in realtà 2 per ogni gliceraldeide 3-fosfato, ma ne vengono usati 2) e 2 NADH (ridotto). Ha 5 tappe anaboliche (che consumano 2 ATP) e 5 cataboliche. Avviene nel citosol. Glucosio sempre nella forma D perché gli enzimi non riconoscono la L.
• ATP: Adenosin trifosfato, nucleotide. 3 gruppi fosfato legati a adenina (mediante 2 legami ad alta energia) e ribosio. La sua capacità di immagazzinare energia è dovuta alla presenza di 3 gruppi fosfato (carica negativa) legati tra di loro da legami anidrici. Ci sono 4 cariche negative e tutto ciò che potrebbe diminuire questa densità emette energia: 7 kcal/mol per ogni legame anidrico rotto.
• NAD, FADH e FADHP sono chiamati coenzimi. NAD: forma ossidata che si riduce a NADH. NADH: forma ridotta, sempre accompagnata da protoni H.

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Fermentazione

• 2A) Fermentazione: in assenza di ossigeno, accettore finale è NAD+.
• Fermentazione alcolica: genera dal piruvato (con una tappa intermedia che forma acetaldeide eliminando CO₂) etanolo, CO₂ di scarto e NAD+ ossidato (che verrà ridotto e riossidato di nuovo per far entrare altro glucosio nella glicolisi).
• Fermentazione lattica: genera dal piruvato lattato e NAD+. NADH fa da agente riducente.
• Fermentazione lattica può essere omolattica (unico prodotto che si forma è il acido lattico) o eterolattica (si formano acido lattico, etanolo e CO₂).
• Pasteur scopre che fermentazione è causata da lieviti a metà 800.

2B) Decarbossilazione ossidativa: da 2 piruvato si generano 2 Acetil-CoA, si liberano 2 CO₂ e 2 NADH. Avviene nel mitocondrio.

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• Da Piruvato (3 atomi di carbonio) a Acetil-CoA (2 atomi di carbonio).
• 3) Ciclo di Krebs o ciclo dell’acido citrico: catabolico, avviene nella matrice mitocondriale. In tutto (2 giri) si generano 6 NADH, 2 GTP (o 2 ATP), 2 FADH₂ (flavinadenina dinucleotide) e 4 CO₂.

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• 4) Fosforilazione ossidativa: formata dalla catena di trasporto degli elettroni e chemiosmosi. Genera 32/34 ATP.
• Catena di trasporto degli elettroni: Trasferimento di elettroni da NADH e FADH₂, genera H₂O e ATP. Avviene nella membrana interna del mitocondrio.

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• Complesso I: NADH ubichinone-ossidoreduttasi. NADH ossidato a NAD.
• Complesso II: Succinato deidrogenasi.
• Complesso III: Q-citocromo c ossidoreduttasi.
• Complesso IV: citocromo c ossidasi.
• Chemiosmosi: sulle creste mitocondriali. Accoppiata a ATP sintasi F0/F1 che sfrutta gradiente di H per generare ATP (3 per ogni rivoluzione). Il nome deriva dall’accoppiamento tra forza proton-motrice e la sintesi di ATP. Un ruolo importantissimo è ricoperto dall'ATP sintasi F0/F1, che sfrutta il gradiente di protoni per generare ATP (3 ATP generati a ogni rivoluzione). Infatti i protoni vengono pompati contro gradiente nello spazio intermembrana, poi tornano nella matrice del mitocondrio (che ha bassa concentrazione di H) secondo gradiente, passando attraverso l'ATP sintasi, che ruotando formerà ATP.

Biochimica nei mitocondri: definizioni

• Catabolico: esotermica (forma ATP), come respirazione cellulare.
• Anabolica: usa energia, come fotosintesi.
• 6CO₂ + 12 H₂O + Energia => C₆H₁₂O₆ + 6O₂ + 6H₂O (fotosintesi).
• Fosfofruttochinasi: nella glicolisi regola catabolismo a seconda della quantità di AMP o ATP prodotti. Se si alza AMP, stimola smantellamento di glucosio verso ciclo di Krebs.
• ATP sintasi (F0/F1 ATPasi): formata da testa globulare F1 (fatta di subunità alpha e beta), trasportatore di elettroni F0, rotore (fatto di subunità c identiche) e statore (che collega rotore a testa). ATP sintasi produce 3 ATP per rivoluzione.
• Gradiente elettrochimico: potenziale di voltaggio e di concentrazione.
• Termogenesi: disaccoppiamento tra catena di trasporto e chemiosmosi genera calore. (Nella respirazione cellulare vengono usati anche lipidi e proteine per produrre energia).

Bilancio energetico della respirazione cellulare nei mitocondri

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Fotosintesi nei cloroplasti

• Anabolico, per sintetizzare carboidrati.
• (Anche piante hanno mitocondri).
• Clorofilla assorbe nel visibile a due massimi: luce blu (440 nm) e luce rossa (680 nm).
• 6 CO₂ + 6 H₂O => C₆H₁₂O₆ + 6 O₂.
• Di notte viene prodotta solo CO₂ nelle piante verdi: viene consumata dal ciclo di Calvin, ma viene prodotta dalla respirazione cellulare nei mitocondri.
• Atomi che erano nello stato ridotto in H₂O vengono ossidati in O₂.
• 12 H₂O => 24 elettroni + 24 H + 6 O₂.
• Alcuni batteri svolgono la fotosintesi anossigenica, usano luce solare per trasformare CO₂ in molecole complesse, senza produrre O₂.
• Fotosintesi anossigenica: 6CO₂ + 12 H₂S => C₆H₁₂O₆ + 12S + 6H₂O.
• 2 fasi della fotosintesi (nel cloroplasto):
  • Luminosa: fase usa luce solare per trasformare ADP in ATP e per caricare di elettroni NADP+ (che diventa NADPH, ridotto). Nella membrana dei tilacoidi.
  • Della reazioni indipendenti dalla luce, ciclo di Calvin: fase usa ATP e NADPH per sintetizzare zuccheri partendo da CO₂. Nello stroma.

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Fase luminosa della fotosintesi

• Sulla membrana del cloroplasto.
• Clorofilla a e b ad anello. Assorbono lunghezze d’onda del blu e del rosso. Al centro un atomo di Mg. Coda idrocarburica.
• Pigmenti accessori: assorbono i fotoni tra il rosso e il blu. Carotenoidi (blu e blu-verde) e ficobiline (giallo-verde, giallo e arancione).
• Spettro d’azione: grafico della velocità della fotosintesi operata da un organismo alle diverse lunghezze d’onda alle quali è esposto.
• Fotosistemi: strutture per organizzare i pigmenti.
• Sistema antenna (immerso nella membrana del tilacoide) e centro di reazione.
• Trasferimento da pigmenti che assorbono lunghezze d’onda minori verso i pigmenti che assorbono lunghezze d’onda maggiori.
• Fotosistema I (clorofilla a, clorofilla P700) e fotosistema II (clorofilla b, P680).
• Schema Z (per la differenza tra i livelli di energia lungo il percorso).

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• 2H₂O + 2 NADP + 8 fotoni => O₂ + 2 NADPH + 2H.
• Anche nei cloroplasti ATP si ottiene per chemiosmosi (alla base per fotofosforilazione) nei cloroplasti.
• Nei cloroplasti l’accettore degli elettroni è NADP, non l’ossigeno.

Fase oscura della fotosintesi: ciclo di Calvin

• Chiamata fissazione del carbonio.
• Nello stroma del cloroplasto.
• Nobel per Calvin e Benson nel 1961. Marcarono molecole di CO₂ sostituendo alcuni atomi di 12-C con 14-C.
• Prima molecola che si forma è 3-fosfoglicerato (3PG) a 3C.
• 3 fasi del ciclo di Calvin:
  • Fissazione del carbonio catalizzata da Rubisco: ribulosio-CO₂ si lega con molecola a 5 atomi di C che fa da molecola accettore, il 1,5-bifosfato (RuBP). Si forma un composto a 6 C che si scompone subito in 2 molecole di 3-fosfoglicerato (3PG, a 3 atomi di carbonio). Enzima che catalizza la sintesi è RubisCO.
  • Riduzione di 3PG a gliceraldeide 3-fosfato (G3P): una fosforilazione (usa ATP di fase luminosa) e una riduzione (usato NAPDH formato nella tappa luminosa).
  • Rigenerazione del RuBP, l’accettore di CO₂: Una parte di G3P viene convertita in RuBP. Ogni giro del ciclo fissa un CO₂ e rigenera un RuBP.
• G3P viene usata per:
  • Formare piruvato per la respirazione cellulare, è prodotto intermedio tra ciclo di Calvin e glicolisi.
  • Formare amido per riserva di energia.
  • Formare saccarosio, che si scinde in glucosio e fruttosio.

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Fotorespirazione

• Consuma O₂, NADPH e ATP per produrre CO₂.
• RuBP + O₂ => fosfatidilcolato + 3PG.
• RubisCO.
• 3 fattori: affinità di rubisCO è 10 volte maggiore per CO₂ rispetto a O₂ ; temperatura alta (stomi si chiudono per non perdere acqua), concentrazione di O₂ e CO₂.
• Piante C3: liberano gliceraldeide 3-fosfato. A temperatura alta favoriscono fotorespirazione. Come soia o rosa.
• Piante C4: mais e sorgo. Enzima PEP carbossilasi lega CO₂ al fosfoenolpiruvato (PEP, a 3 C), formando ossalacetato (a 4 C).

Riassunto dei prodotti della fotosintesi

• In assenza di luce si possono produrre NADH, FADH₂ e NADP+. Invece in presenza di luce si producono ATP, NADPH+ e H+.
• Equazione finale del Ciclo di Calvin: 6CO₂ + 18 ATP + 12 NADPH + 12 H + 12 H₂O => glucosio + 18 ADP + 18 fosfato inorganico + 12 NAPH.

Enzima PEP carbossilasi usato anche dalle piante CAM

• CAM: metabolismo acido delle crassulacee.
• Durante notte aprono stomi formando ossalacetato che poi si trasforma in malato (4C).
• Durante giorno stomi si aprono e malato viene trasferito ai cloroplasti. Viene decarbossilato per produrre CO₂ per il ciclo di Calvin.

Cafarelli A.

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Smistamento di proteine

Compartimenti topologicamente distinti.