Biologia molecolare

Biologia molecolare II anno

Lezione 1

Cosa sono le biotecnologie?

Biotecnologie sono tutte le applicazioni tecnologiche della biologia. La biotecnologia è l’applicazione tecnologica che si serve dei sistemi biologici, degli organismi viventi o di derivati di questi per produrre o modificare prodotti o processi per un fine specifico. È un ramo della biologia che utilizza gli esseri viventi al fine di ottenere beni o servizi utili al soddisfacimento dei bisogni della società.

Dal DNA alle proteine passando per l’RNA. Il corso si occupa del flusso dell'informazione:

• Replicazione: è il processo secondo il quale da una molecola di DNA iniziale vengono fatte due molecole di DNA figlie identiche.
• Trascrizione: porta a una copia in RNA dell'informazione genetica contenuta nel DNA.
• Traduzione: consiste nella sintesi di una proteina a partire dall'informazione genetica contenuta nell'mRNA. Poiché le proteine sono fatte da amminoacidi, la traduzione comporta il trasferimento dell'informazione dagli acidi nucleici a una molecola completamente diversa.

Le proteine costituiscono circa i 2/3 del materiale organico di una cellula. Per spiegare i diversi argomenti è necessario capire come storicamente si è arrivati a queste conoscenze, quindi quali tecniche sono state utilizzate.

Argomenti in rosso (fatti in altri corsi ma da sapere), in verde si fanno durante il corso. DNA come principale depositario dell’informazione. Gli acidi nucleici trasmettono l’informazione genetica.

Esperimento di Griffith

Come abbiamo compreso che esisteva un materiale genetico, un principio trasformante, un’informazione che poteva essere trasferita da una cellula ad un’altra? L'esperimento di Griffith con lo Streptococcus pneumoniae (pneumococco) causa la polmonite. Il batterio esiste in due ceppi: S (capsula), colonie lisce, virulento, altamente infettivo e R (no capsula protettiva, viene riconosciuto e distrutto dal sistema immunitario), rugose e benigno.

Cosa rende il ceppo rugoso tale e il liscio altamente infettivo? Il ceppo di batteri S, smooth, possedeva un rivestimento costituito da una capsula polisaccaridica e se questo veniva iniettato in un topo riusciva ad evadere il sistema immunitario e il topo moriva. Se iniettato invece il batterio R, il topo viveva, combattendo l’infezione.

Controllo: Griffith prende i batteri S e li tratta con calore, per verificare di averli uccisi, vengono iniettati (es. 1/10) nel topo che sopravvive. Una stessa quantità (es. 1/10) viene miscelata ai batteri di tipo R, iniettati nel topo, questo muore. Analizzando i batteri presenti nel topo si vede che sono presenti batteri di tipo S. L’informazione che permette di costituire la capsula è passata dai batteri S uccisi dal calore dentro i batteri R. Ciò che permette questo trasferimento è il principio trasformante (oggi DNA), un’informazione che può essere trasferita da una cellula all’altra: primo organismo geneticamente modificato.

Cos’era? Oggi è definito come DNA ma in passato era difficile purificare le molecole di DNA in quanto molto lunghe, inoltre non si pensava che una molecola così semplice potesse contenere tante informazioni e renderci così complicati. Era già stato compreso però che le proteine erano composte da 20 aa diversi che potevano susseguirsi in ordine diverso, di conseguenza si pensò che l’informazione genetica risedesse in esse.

Lezione 2

Esperimento di Avery

Come abbiamo compreso che il DNA conteneva l’informazione genetica? L’informazione genetica risiede in un acido nucleico: Bomba di Avery. Avery lavora ancora con pneumococchi, cellule batteriche coltivabili sia in solido che in liquido (usato liquido) e studia in provetta la trasformazione da tipo R a S.

Vengono prese cellule di tipo S e sottoposte a lisi, venne separato, tramite centrifugazione, l’estratto cellulare. Questo venne incubato con una coltura di batteri vivi di tipo R e piastrato su un terreno di coltura. Batteri di tipo S comparvero nella piastra dimostrando l’esistenza del principio trasformante.

Per capire in quale componente risiedesse, una grossa quantità di coltura venne divisa in diverse aliquote in provette, ciascuna contenente una sola componente macromolecolare ottenuta usando trattamenti enzimatici per degradare le altre (preparata anche una provetta di controllo, tampone). Piastrato e analizzato il contenuto di ogni campione, si scoprì che solo in quello contenente DNA avveniva il trasferimento: miscela pneumococco R con DNA trasformazione in tipo S.

• Si prevede spesso che tutte le colonie piastrate siano di tipo liscio, ci fu una trasformazione del batterio (preso DNA estraneo, in genere molecola plasmidica, capsula liscia e di conseguenza capacità di produrre batteri lisci). Evento raro in quanto le cellule tendono a difendersi da DNA estraneo (immagini dei libri di solito non corrette in quanto solo una colonia ogni tanto diventa di tipo liscio) e quindi dovrebbero essere presenti anche di tipo R.
• Controllo negativo e positivo. Un esperimento può avere artefatti. Per esempio, si può avere una contaminazione, quindi presenza di batteri dove non dovrebbero esserci. Controllo positivo controlla di saper ottenere sia crescita di cellule rugose che lisce senza alcun problema. Controllo negativo controlla tutti gli artefatti possibili, in questo caso la contaminazione di cellule lisce (un controllo per ogni campione, metto un’aliquota uguale di cellule rugose piastrato con tampone con proteine e con tutti gli altri tamponi, non deve venire il risultato aspettato). Se non c’è nessuna colonia liscia, corretto, altrimenti non affidabile.

Esempio: PCR. Serve per amplificare grossa quantità di DNA di nostro interesse. Si usano due primer presenti nel genoma del virus, aggancio DNA polimerasi, cicli di replicazione, grandi quantità di DNA iniziale. Paziente infetto di virus a DNA.

• Controllo negativo: non metto DNA (no DNA), non deve dare banda quando piastrato su gel di agarosio; usare DNA genomico di individuo sicuramente non infetto, sì banda primer non corretti.
• Controllo positivo: uso campione di DNA di individuo sicuramente infetto, deve risultare tale.

Prese cellule S che contiene anche CapS (gene per comporre la capsula), viene isolato il DNA frammentato. Alcuni di questi frammenti entrano in una cellula di tipo rugoso e si integrano (tutti eventi molto rari).

Trasformazioni batteriche: introduzione DNA esogeno. Se DNA aggiunto a cellule eucariotiche superiori animali o vegetali trasfezione.

Esperimento di Chase e Hershey

Nuovo esperimento che conferma il dato in quanto la comunità scientifica non è convinta: Esperimento di Chase e Hershey (usate cellule procariotiche in quanto quelle eucariotiche difficili da coltivare al tempo). Usati fagi e E. Coli. Vengono coltivate cellule di Coli in presenza di zolfo 35 (radioattivo) in quanto presente cisteina che contiene gruppi SH marcate proteine virali, in particolare capside. Vengono anche marcati acidi nucleici con fosforo radioattivo: fagi con DNA marcato.

Vengono presi i virus marcati nei due differenti modi e posti a contatto con cellule di Coli non radioattive, cresciute in ambiente normale. Si lascia iniziare l’infezione e poco dopo si mette la coltura in un frullatore (forza meccanica stacca virus, rompe cellule all’esterno e blocca l’infezione). Posto in provetta quello che è stato ottenuto, lo si pone in centrifuga a bassa velocità per separare Coli (pesa di più) da virus (sovranatante da gettare). Il pellet ottenuto dai due esperimenti viene verificato, quello radioattivo è quello in cui è stato marcato il genoma virale: DNA è il principio trasformante.

Trasformazione batterica (plasmide + batterio -cellula ospite- cellula ospite trasformata). Le cellule ospite vengono trattate per formare pori e facilitare l’entrata del DNA batterico.

• Sviluppo della fase di competenza
• Legame del DNA trasformante alle cellule competenti
• Ingresso DNA trasformante
• Integrazione del DNA (ricombinazione)
• Espressione del DNA trasformante

Struttura del DNA

Come è fatta una molecola di DNA? Gli acidi nucleici sono polimeri lineari di nucleotidi: base azotata + zucchero pentoso (ribosio RNA, in 2’ ossidrile; 2’-deossiribosio, DNA) + gruppo fosfato attaccato al C in 5’. Nucleoside, nucleotide senza gruppo fosfato (zucchero + base azotata).

Il DNA, senza gruppo ossidrile, rispetto all’RNA è molto più stabile, il gruppo inoltre occupa spazio e di conseguenza l’RNA non può stare in conformazione come il DNA a doppia elica.

Legame fosfodiesterico (5’-3’) tra gruppo fosfato in 5’ di un nucleotide e carbonio in 3’ dell’altro. Il P forma un legame estere con il 5’C di uno zucchero e uno con il 3’ dello zucchero successivo. Basi: A-C-T-G-U.

• Purine (2 anelli aromatici A-G)
• Pirimidine (1 solo anello aromatico C-T-U)

Per capire se si tratta di un nucleotide di DNA o RNA, per il primo si scrive dAMP… Il nucleotide trifosfato è il precursore degli acidi nucleici. Per convenzione i fosfati sono chiamati alfa (primo, legato allo zucchero), beta (intermedio), gamma. Quando si utilizzano nucleotidi marcati per creare acidi nucleici marcati radioattivamente è necessario conoscere questa dicitura.

Esperimento di Chargaff

L'esperimento di Chargaff specifica la composizione nucleotidica del DNA. Prende cellule di DNA di diversi organismi e lo purifica. Lo riduce tutto a nucleotidi con fosfodiesterasi. Separa i diversi nucleotidi con cromatografia su strato sottile e scopre che i 4 nucleotidi non sono presenti in ugual quantità nel genoma (diversi anche tra specie, anche se tutte li contengono) vero principio trasformante. Spot di A=G e di T=C rapporto purine-pirimidine uguale a 1. Il DNA dello stesso organismo ha sempre la stessa composizione in basi.

Struttura del DNA

Struttura DNA: doppia elica destrorsa formata da un’ossatura esterna o scheletro data dall’alternanza zucchero-fosfato e carica negativamente (resta sempre un fosfato libero in 5’ e un OH in 3’), all’interno presenti le basi (idrofobe) che formano legami a idrogeno. I due filamenti sono antiparalleli.

La doppia elica è estremamente stabile per gli innumerevoli legami deboli che si formano (come quelli a idrogeno). Esiste una sola forza di repulsione che è la carica negativa dei fosfati che tendono ad allontanarsi tra loro (importante quando si curva il DNA: nucleosoma, questi si avvicinano molto). Possibili solo due appaiamenti A-G, C-T il diametro doppia elica costante (circa 2 nm o 20 Å) (base piccola-base grande), se non regolare il legame, il diametro cambia e interviene un controllo.

In un giro completo della doppia elica sono presenti circa 10,5 paia di basi. Si formano un solco minore e uno maggiore (uno dei punti preferenziali di ingresso delle proteine che devono interagire con DNA), sono cavità.

La doppia elica non contiene solo l’informazione genetica ma anche la capacità di duplicarsi (complementarità garantisce la duplicazione) se viene aperta, si denatura, in un punto per copiarla, entrambi i filamenti possono fare da stampo per la molecola di nuova sintesi e si formano due molecole di DNA figlie identiche. La struttura descritta è quella di Watson e Crick ed è la conformazione B, non sempre è quella favorita.

Esistono anche il DNA-A (se DNA-B messo in soluzione alcolica prende questa conformazione se non precipita) e DNA-Z (levogiro e scoperto in vitro, in dubbio se esistente in natura).

Il DNA-A presenta coppie di basi più angolate rispetto al piano perpendicolare all’asse della doppia elica; presenta 11 coppie di basi per ogni giro d’elica; passo 25 Å e diametro 23. In vivo è tipica di etero duplex RNA/DNA o duplex RNA/RNA (RNA presenta raramente strutture a doppia elica difficili da formare in quanto l’ossidrile non lo permette, se riesce forma un ibrido).

Il DNA-Z presenta un’elica sinistrorsa; diametro 18 Å e passo di 46. Scoperta studiando DNA sintetici in cui G e C si alternano lungo la sequenza. Oggi ci sono prove sperimentali che esista una piccola frazione di DNA in vivo in forma Z e ci sono delle proteine che legano DNA Z.

Esistono delle rare basi del DNA: la 5-metil-citosina (informazioni di tipo regolativo) e la 5-idrossi-metil-citosina, ottenute tramite la modifica da parte di alcuni specifici enzimi.

Lezione 3

RNA

Singolo filamento (forma anche regioni a doppio), contiene uracile al posto della timina e ribosio al posto del deossiribosio. Molecole molto più corte di quelle di DNA, portano l’informazione di uno o pochi geni. Sono molecole molto instabili e contengono spesso delle basi insolite, modificate e non presenti nel DNA. Esistono genomi a RNA a doppio o singolo filamento come nel caso dei virus.

Generalmente la molecola di RNA non rimane a singolo filamento ma assume strutture secondarie per permettere l’ingresso, ad esempio, dei substrati nel sito catalitico. Si formano delle zone in cui l’RNA si appaia tramite legami a idrogeno tra le basi e forma un doppio filamento antiparallelo dove le basi, che sono in ambiente acquoso e idrofobiche, cercano di stare all’interno. Queste zone a doppio filamento vengono definite duplex o stelo, forcina… Quando l’RNA è a singolo filamento le basi idrofobiche cercano di essere il più possibile lontane dall’ambiente acquoso. Può assumere anche una struttura terziaria.

Questa struttura è resa possibile dall’arrangiamento tridimensionale di blocchi di strutture secondarie. Le basi possono ruotare e ripiegarsi liberamente intorno al legame fosfodiesterico e ai legami che lo legano al ribosio e possono anche impegnarsi in appaiamenti non di tipo Watson-Crick. L’ossidrile in 2’ impedisce la formazione di una doppia elica di tipo B, favorendone una di tipo A con il solco maggiore più stretto e profondo e quello minore più largo e accessibile.

L’RNA contiene un elevatissimo numero di nucleotidi modificati (fino a 100) che ne aumentano di molto la variabilità strutturale.

Denaturazione e ibridazione degli acidi nucleici

La stabilità della doppia elica è determinata dai legami deboli che si possono formare se viene utilizzata energia dal sistema. Denaturare significa separare i due filamenti del DNA e ci sono due metodi per farlo, il primo è fornire calore per rompere i legami a idrogeno, il secondo (solo per il DNA) è alzare il pH per esempio con della soda. La denaturazione termica, con calore, necessita circa 95/100 °C, la temperatura precisa dipende dal numero dei legami a idrogeno presenti nella molecola e quindi dal numero di paia di basi (lunghezza campione). Fino a 100 °C il DNA si denatura e non c’è possibilità di fare legami a idrogeno.

Se la provetta in questione viene lasciata a temperatura ambiente i legami si riformano raggiungendo la situazione più stabile ed energeticamente favorita, quella in cui le basi si appaiano come erano all’inizio, ricostituendo la doppia elica. L’assorbanza alla fine tornerà uguale a quella iniziale.

Se la provetta denaturata viene messa in ghiaccio (crollo vertiginoso di T) le molecole non hanno tempo di ritrovarsi, i moti browniani sono pochissimi e i singoli filamenti tendono ad appaiarsi con sé stessi ed eventualmente appaiarsi in modo sfalsato in alcuni punti: molecole a gomitolo statistico (doppio filamento intra-molecola o inter-molecole).

Rinaturazione. Per rinaturare il DNA (poche molecole), il tempo necessario affinché torni al suo stato iniziale dipende molto dalla concentrazione. Quando la temperatura della soluzione di DNA viene abbassata lentamente i singoli filamenti si riappaiano con quelli complementari, ricostituendo una doppia elica regolare. Quando invece viene abbassata rapidamente (ghiaccio) si forma un cosí detto gomitolo statistico, prevalentemente dato da legami a idrogeno intramolecolari.

Per misurare la concentrazione del DNA si usa lo spettrofotometro (per misurare la quantità di luce assorbita a ciascuna lunghezza d’onda), lo strumento si usa anche per capire se il DNA si è denaturato o no. Sono le basi che assorbono le onde, se queste non sono appaiate possono assorbire meglio rispetto a quando sono a doppio filamento. Quando ci si trova a 100 °C, l’assorbanza è massima.

Se il DNA viene ridotto solo alle basi, l’assorbanza è maggiore di quella del DNA con scheletro “completo” e raggiunge una concentrazione maggiore del DNA denaturato. Per verificare quindi di avere ancora tutte le componenti del DNA, RNA è necessaria l’elettroforesi. Dentro lo spettrofotometro una luce, della lunghezza d’onda adeguata, entra all’interno della cuvetta contenente il campione e il detector legge la luce assorbita. Per tarare lo strumento è necessario, sempre, usare un bianco (DNA 260 nm). DNA minima assorbanza, RNA maggiore assorbanza.

Effetto ipercromico: grande aumento nell’assorbimento della luce a 260 nm che si verifica quando il DNA a doppia elica si svolge (fonde). Quando l’agitazione termica supera la forza dei legami a idrogeno, delle interazioni idrofobiche e delle altre forze che stabilizzano la doppia elica, la molecola fonde e la separazione dei filamenti modifica l’assorbimento della luce ultravioletta a 260 nm.

Se in una provetta ho solo filamenti di un tipo (rosso) e aggiungo una grande quantità di un solo filamento singolo ma identico ad uno dei due filamenti rossi (verde), come si appaieranno tra loro? È molto più probabile che i filamenti verdi si appaiano tra loro piuttosto che con i filamenti rossi, a causa della concentrazione relativa e della cinetica del processo di ibridazione.