Biologia molecolare

Biologia molecolare – Prof. Piaggi

Biologia molecolare un tempo era considerata una disciplina “di confine” che si sviluppò a partire dagli anni 30, in cui ancora non si conosceva la struttura del DNA e serviva a fare da tramite tra genetica e biochimica, poi successivamente divenne autonoma scienza che studia la struttura e la funzione delle macromolecole biologiche, le loro trasformazioni e reazioni nel metabolismo (acidi nucleici e proteine). Importante in molte discipline della medicina, farmacologia ecc…

Scoperta della molecola del DNA

La scoperta della molecola del DNA risale al 1869 con Miescher. Scopo della sua ricerca era di caratterizzare la funzione chimica delle cellule scegliendo come campioni i leucociti (prendeva dalle bende piene di pus del vicino ospedale). Mise a punto una procedura per lavare le bende senza danneggiare le cellule e poi cercò di isolare lipidi e proteine e tentando di farlo isolò una sostanza dalle proprietà chimiche peculiari → era acida, conteneva una grande quantità di fosforo (caratteristica mai trovata nelle proteine note a quei tempi) e per questo motivo pensò di aver identificato un altro tipo fondamentale di sostanza cellulare ovvero il DNA. Dimostrò che era contenuta nei nuclei (venne chiamata nucleina) e dimostrò che era presente in tutti i tipi cellulari di tutti gli organismi da lui analizzati; continuò a lavorare sulla nucleina formulando diverse ipotesi sulla sua funzione e osservò che:

• Aumentava quando le cellule erano in divisione
• Implicata nei processi di fecondazione (essendone gli spermatozoi particolarmente ricchi) ma non nella trasmissione dei caratteri acquisiti
• Nucleina di specie diverse aveva stesse proprietà chimiche quindi per lui non poteva dare le caratteristiche specifiche di ogni organismo

→ la sua scoperta fu importante, ma non ebbe un grosso scalpore nella comunità scientifica di allora (non era un buon comunicatore, non promosse mai le proprie scoperte e quindi pochi studenti sceglievano di frequentare il suo laboratorio).

Esperimento di Griffith

Nel 1928 Griffith stava studiando lo pneumococco con lo scopo di sviluppare un vaccino e lavorava con il ceppo liscio S (colonie a superficie liscia con capsula polisaccaridica, virulente) e ceppo ruvido R (cellule con superficie irregolare prive della capsula e non virulente).

Inoculò in alcuni topi pneumococchi S uccisi dal calore e quando somministrava una miscela di batteri R vivi e S uccisi al calore, gli animali contraevano comunque la polmonite e analizzando il sangue di questi animali lo trovò pieno di batteri vivi molti dei quali dotati delle caratteristiche del ceppo virulento S e concluse che alcuni dei R vivi in presenza dei S uccisi dal calore si erano trasformati nel ceppo virulento (e la trasformazione non dipendeva dal topo perché incubando in una provetta batteri R vivi e S morti dal calore si aveva la stessa trasformazione) → questo dimostrava che una qualche sostanza (all’epoca chiamata fattore di trasformazione) estratta da pneumococchi S morti poteva agire sulle cellule R provocando un cambiamento ereditario.

Esperimenti di Avery, MacLeod, McCarty, Hershey e Chase

Nel 1943 Macleod e Avery McCarty, l’esperimento di Griffith venne ripetuto separando proteine, lipidi, polisaccaridi e acidi nucleici dimostrando che il fattore trasformante era un acido nucleico (formato da fosfati, desossiribosio e basi azotate), ma l’esperimento non convinse gli scienziati dell’epoca perché tutti erano convinti che il materiale genetico dovesse essere di natura proteica (nel caso del DNA i monomeri sono solo 4 e non 20 come nelle proteine e quindi si dubitava che l’informazione genetica risiedesse in questi 4 monomeri) e ciò che veniva criticato nell’esperimento era la non completa purezza degli acidi nucleici (si pensava fossero contaminati da tracce di proteine e non dimostrava che il materiale genetico fosse effettivamente il DNA).

Solo nel 1952 Hershey e Chase, “esperimento del frullatore”, provarono in maniera definitiva che il fattore trasformante, il materiale genetico, era il DNA. Partirono dal presupposto che le proteine contengono zolfo e gli acidi nucleici fosforo, quindi li marcarono con isotopi radioattivi. Utilizzando il batterio Escherichia coli e il virus batteriofago T2 (passa il materiale genetico ma non le proteine) e lavorando alla teoria secondo la quale marcando con traccianti radioattivi, sia le proteine che gli acidi nucleici del fago i batteriofagi infettano i batteri e questi messi in un frullatore causa il distacco del virus dai batteri stessi e le parti del virus che penetrano nelle cellule sono sempre separate dalle altre e l’analisi dei batteri infetti dimostrava che il marcato al loro interno erano gli acidi nucleici e non le proteine.

Scoperte sulla struttura del DNA

A questo punto l’ambiente scientifico era pronto ad accogliere l’idea del DNA come materiale genetico e da questo punto in poi iniziò la corsa alla comprensione della sua struttura tridimensionale e ci furono tutta una serie di scoperte:

• 1952 Mirsky → dimostrò che le cellule somatiche di qualsiasi specie contengono uguali quantità di DNA mentre i gameti contengono la metà di DNA presente nelle cellule somatiche;
• 1952 Chargaff → scoprì che la proporzione tra le 4 basi azotate è la stessa in tutti gli individui di una determinata specie, ma varia da una specie all’altra. Osservò che qualsiasi sia la fonte di DNA e nonostante la diversa composizione di basi veniva sempre rispettata una regola (regola di Chargaff), secondo la quale la percentuale di A è sempre uguale a quella di T e quella di G a quella di C (regola non valida per l’RNA).
• 1953 Watson, Crick e Wilkins Rosalind Franklin (manca -- fotografie a raggi X al DNA dimostrando che il modello del DNA era una doppia elica, in particolare è famosa la foto 51 scattata tramite diffrazione a raggi X del DNA) pubblicarono il primo articolo sulla struttura molecolare degli acidi nucleici e il suo significato nel trasferimento delle informazioni e anche il suo meccanismo di replicazione.
• 1959 Kornberg → progetto di ricostruire in vitro le fasi di sintesi del DNA a partire dai suoi costituenti dopo aver isolato il fondamentale enzima DNA polimerasi.
• 1993 Mullis = inventore della PCR (tecnica che permette di amplificare il DNA e può essere utilizzata per moltissimi scopi dalla diagnosi di malattie genetiche, di infezioni batteriche e virali ma non solo infatti è anche possibile clonare in tempi rapidi geni che permettono l’espressione di proteine con la produzione di grandi quantità di insulina, ormone della crescita, vaccini).
• 1996-2003 → sopravvivenza della pecora Dolly che fu il primo essere vivente ad essere clonato con successo da una cellula somatica
• 1990-2003 progetto genoma umano (Human Genome Project HGP) = si è cercato e ottenuto di sequenziare l’intero DNA umano e identificare e mappare i vari geni.

Dogma centrale della biologia molecolare

Il dogma centrale della biologia molecolare è che il DNA contiene l’informazione per sintetizzare le proteine, è stato però visto che alcune DNA polimerasi hanno attività di retrotrascrizione (= da RNA a DNA; è stato ipotizzato che servano per la riparazione di danni al DNA).

Il DNA negli eucarioti si trova nel nucleo cellulare (non nel nucleolo in cui si ha la sintesi di RNA ribosomiale e il nucleolo è una regione particolarmente densa di materiale genetico e proteico), mentre i procarioti non hanno nucleo e quindi il materiale genetico è libero nel citoplasma.

Acidi nucleici e nucleotidi

Gli acidi nucleici sono macromolecole polimeriche formate da monomeri (= nucleotidi) e ci sono due tipi di acidi nucleici che sono DNA e RNA. I nucleotidi sono formati da:

• Base azotata purinica o pirimidinica (adenina, guanina, citosina e timina e uracile al posto della timina nel RNA)
• Zucchero pentoso (nel DNA il desossiribosio e nell’RNA il ribosio)
• Gruppo fosfato

Per convenzione gli atomi di carbonio dello zucchero vengono nominati con un primo (1’, 2’, 3, 4’, 5’) per distinguerli dagli atomi di C presenti nelle basi azotate e lo zucchero è sempre un pentoso (5 atomi di carbonio numerati in senso orario) e c’è una differenza sostanziale tra DNA e RNA nella presenza/assenza dell’atomo di ossigeno posizione 2; infatti nel desossiribosio manca quell’ossigeno che è presente nel ribosio e quest’ossigeno in più è un punto che dà maggior reattività chimica al ribosio rispetto al desossiribosio DNA più stabile dell’RNA.

Le basi azotate sono composti eterociclici azotati:

• Pirimidine = citosina, timina e uracile sono a singolo anello eterociclico
• Purine ovvero guanina e adenina a doppio anello eterociclico

Basi + pentoso = NUCLEOSIDE

Nucleoside + fosfato = NUCLEOTIDE

Se osserviamo la struttura delle basi azotate e pensiamo a come si appaiono ci rendiamo conto del motivo per cui non è possibile fare appaiamenti diversi in quanto la distanza tra le due eliche non sarebbe eterogenea, infatti le basi azotate si connettano tra di loro con legami a ponte a idrogeno: guanina e citosina hanno un triplo legame, mentre adenina e timina un doppio legame (importante perché il triplo legame necessiterà di una forza maggiore per essere rotto, rispetto al doppio). Invece nell’RNA troviamo l’uracile al posto della timina probabilmente perché la timina per la sua struttura garantisce maggiormente la fedeltà della replicazione rispetto all’uracile (è rimasto nell’RNA perché questo non deve trasmettere l’informazione genetica ma è solo una molecola transitoria), ma comunque noi sappiamo che il DNA è soggetto a mutazione (per esempio a causa di una lenta deaminazione la citosina può trasformarsi in uracile → non essendo presente l’uracile nel DNA quando c’è la deaminazione viene riconosciuta e la mutazione non viene replicata ma riparata).

Struttura primaria del DNA

I vari monomeri si legano tra di loro con un legame fosfodiesterico che conferisce una polarità alla catena polinucleotidica che ha due estremità diverse, una con il 5’ libero e il carbonio 3’ impegnato nel legame e l’altra ha il carbonio 5’ impegnato nel legame e il 3’ libero (significa che non è impiegato in un legame fosfodiesterico) conferendo alla catena una direzionalità (5’ → 3’): il monomero dal quale avviene la sintesi della catena non è direttamente il nucleotide con un gruppo fosfato ma il nucleotide trifosfato infatti il legame fosfodiesterico si forma per una reazione con attacco nucleofilo da parte del gruppo ossidrile 3’ del nucleotide all’atomo di fosforo alfa di un nucleoside 5’-trifosfato, causando il rilascio del pirofosfato e la formazione del legame (reazione catalizzata dalla DNA polimerasi); i nucleotidi di DNA e RNA sono uniti tra loro da legami covalenti tra gruppi fosforici (in cui il gruppo OH 5’ di un’unità nucleotidica è unito al gruppo OH 3’ di quella successiva formando un legame fosfodiestereo) e per convenzione un polinucleotide si scrive col carbonio terminale 5’ a sinistra e il 3’ a destra (direzione 5’-3’).

Struttura secondaria del DNA

Le due catene interagiscono grazie a legami a idrogeno, due tra adenina e timina e 3 tra guanina e citosina (maggior energia per denaturarle e le sequenze particolarmente ricche di citosina e guanina nella PCR avranno bisogno di temperature di distacco maggiori), è un legame molto più facilmente spezzabile rispetto al fosfodiesterico e questo è essenziale per il processo di replicazione di DNA o la trascrizione di RNA in cui è necessario che le due eliche si distacchino; inoltre le due catene sono antiparallele (uno è orientato in direzione 5’-3’ e l’altro 3’-5’) e la doppia elica è destrorsa, inoltre i due filamenti sono complementari e data la sequenza di un filamento è possibile determinare esattamente la sequenza del suo complementare.

La posizione del legame delle basi con gli altri zuccheri è spostata rispetto all’asse centrale delle basi appaiate e questo crea un’assimetria della molecola generando due solchi di dimensioni diverse: c’è un solco maggiore e un solco minore che sono molto importanti per il riconoscimento delle sequenze del DNA infatti il solco maggiore ha molti più atomi che possono essere donatori o accettori di legami a H (il linguaggio presentato da questa zona è più ricco del solco minore) e infatti l’alfa elica di molte proteina ha le dimensioni giuste per interagire direttamente con il solco maggiore; ci sono 10 paia di basi per ogni giro di elica. La stabilità della doppia elica si deve alla sua composizione, infatti, si crea un interno della molecola un core idrofobico (dove sono rivolte le basi apolari) e l’impacchettamento che si forma è così forte che crea un ambiente idrofobico interno e un esterno (con gruppi fosfati) fortemente polare

In realtà il DNA può assumere diverse forme a elica:

• DNA A (destrorsa ma le coppie di basi hanno una maggiore angolatura rispetto alla doppia elica, forma un po' più tarchiata, ci sono 11 coppie di basi per ogni giro di elica)
• DNA B (quella di WeC)
• DNA Z (sinistrorsa, tipica di regioni metilate, ha una struttura più magra e allungata)

Si parla anche di forme in divenire infatti grazie a una potente tecnica di microscopia elettronica e simulazioni con super computer i ricercatori del Baylor College of Medicine di Houston e dell’università di Leeds hanno dimostrato che in realtà il DNA ha una struttura e natura molto dinamica, quindi inquadrarlo nel rigido schema della doppia elica è riduttivo perché il DNA è una molecola che subisce delle modifiche per cui per esempio possiamo avere delle strutture alternative in base alle sequenze che sono coinvolte:

• Struttura scivolata = con anse di compensazione nei due filamenti a livello di ripetizioni in tandem
• Struttura cruciforme = con formazioni di anse-stelo appaiata a livello di una ripetizione invertita
• Tripla elica di DNA = a livello di un tratto di purine-pirimidine contenente una ripetizione speculare

Superavvolgimenti

I due filamenti di DNA sono avvolti a formare una doppia elica e entrambi i filamenti ruotano attorno ad un asse, avvengono solo su molecole chiuse di DNA (circolari o lineari che comunque non sono liberi e quindi si comportano come strutture chiuse), quindi se stringiamo o allentiamo la doppia elica attorno al proprio asse avremo un superavvolgimento positivo (se avviene secondo il senso dell’elica) o negativo (se allena la doppia elica ovvero la torsione avviene in senso opposto a quello destrorso dei due filamenti → è un’operazione che avviene sempre quando il DNA viene replicato o trascritto); i superavvolgimenti inducono un cambiamento conformazionale nel DNA e la presenza di un superavvolgimento aumenta l’energia della molecola quindi il superavvolgimento è da considerarsi come una riserva di energia

A introdurre i superavvolgimenti negativi è la topoisomerasi che rilassa la molecola di DNA e a parità di peso molecolare il DNA rilassato ha una mobilità elettroforetica inferiore rispetto al superavvolto

Struttura terziaria del DNA

La lunghezza del DNA supera il metro quindi per entrare in una cellula è necessario uno stivaggio compatto che costituisce la struttura terziaria, il DNA si avvolge intorno a proteine istoniche a formare il primo livello di compattazione denominato come filo di perle (le perle sono i nucleosomi) poi si ha la formazione del solenoide (da 11 a 30 nm) e dopodichè si ha una compattazione estrema fino ad arrivare ai cromosomi; il DNA viene compattato approssimativamente di 6 volte tramite l’assemblaggio di nucleosomi ma è un passaggio necessario per tutti i livelli successivi di compattazione; il nucleosoma è l’unità fondamentale della cromatina ed è costituito da un centro proteico (formato da 8 proteine istoniche) attorno al quale si avvolge il DNA infatti ogni centro nucleosomico contiene 2 istoni H2A, 2 H2B, 2 H3 e 2 H4.

Gli istoni sono proteine fortemente basiche che si associano al DNA e formano il nucleosoma (organizzati in ottameri) e intorno a questo gruppo di proteine si avvolgono circa 146 paia basi per quasi 2 giri; gli istoni sono proteine contenenti molti aa carichi positivamente, più del 20% sono residui di lisina e arginina.

Nel primo livello di compattazione il DNA tra un nucleosoma e l’altro è detto linker (è variabile tra le 20 e le 80 paia basi) e l’ulteriore grado di compattazione è il solenoide in cui entra in funzione un quinto istone ovvero l’H1 che accorpa i nucleosomi sovrapponendoli a due a due (fibra cromatinica) o raggruppandoli in gruppi di 6 ciascuno (solenoide).

L’associazione del DNA con gli istoni è mediata da legami a H (espressione genica è l’epigenetica, più il DNA è compattato meno possibilità ci saranno per proteine e fattori di trascrizione di riuscire ad avere accesso alle sequenze che devono riconoscere mentre più il DNA è rilassato più sarà facile riconoscere e trovare queste sequenze specifiche quindi ciascun istone del core possiede code N-terminali che sono le modificazioni responsabili dell’epigenetica come acetilazione, fosforilazione e metilazione) e la formazione e la compattazione del nucleosoma impedisce alle molecole coinvolte nella trascrizione del DNA di avere accesso ai geni contenuti nei loci intorno al core (specifici processi di regolazione e modulazione del grado di avvolgimento rappresentano uno dei sistemi primari di regolazione dell’espressione genica).

Ma le proteine istoni