Biologia molecolare

Biologia molecolare

Cap. 1 I geni sono DNA

Il DNA è il materiale genetico

• Esperimento di Griffith 1928 e Avery 1944 tramite trasformazione batterica.
• Esperimento di Hershey e Chase 1952: trasformazione batterica in cellule.

Transfezione: aggiunta di un gene → eucariotiche, ma non chiamata così perché in quegli anni era presente già la trasformazione oncogena di una cellula.

L’unità fondamentale del DNA/RNA è il nucleotide, descrizione struttura: le basi sono presenti in quantità diverse nei DNA di specie diverse, G=C e A=T, filamenti appaiati con orientamento antiparallelo.

La doppia elica di DNA può avvolgersi su se stessa e cambiare la sua conformazione globale, o topologia, nello spazio. Superavvolgimento: può essere positivo se l’asse si avvolge nella stessa direzione della doppia elica, orario, e si ha come risultato più coppie di basi per giro d’elica e una doppia elica più compatta e difficile da aprire; mentre può essere negativo se l’asse si avvolge nella direzione opposta alla doppia elica, antiorario, e si ottiene una doppia elica meno compatta e facile da aprire con meno bp per giro d’elica.

In conseguenza ad un superavvolgimento positivo la DNA polimerasi o RNA polimerasi bloccano la loro attività e possono riprendere se interviene un enzima che taglia uno dei due filamenti per srotolarli e diminuire lo stress e poi richiudendolo ripristinando il legame fosfodiesterico. Il ripristino della topologia del DNA avviene tramite topoisomerasi.

• Replicazione semiconservativa con esperimento di Meselson e Stahl 1958.

Gli enzimi devono avere un’affinità molto alta per l’acido nucleico poiché devono rimanere attaccati fino alla fine del processo allo stampo: enzima processivo ad alta processività.

• Degradazione degli acidi nucleici: gli enzimi non sono molto processivi e sono chiamati randomizzati.

Endonucleasi sono DNasi per tagliare il DNA e possono essere specifiche per singolo filamento o per il doppio, oppure sono RNasi per tagliare l’RNA e possono essere specifiche per il singolo o per il doppio filamento.

Esonucleasi dove DNasi agiscono su singoli filamenti attaccando una estremità e stessa cosa le RNasi.

• Specificità di appaiamento delle basi: appaiamento intramolecolare con RNA o appaiamento intermolecolare tra RNA lunghi e corti, importante per l’espressione genica.
• Denaturazione e rinaturazione del DNA: avviene la rottura del legame idrogeno e la separazione dei filamenti, poi si riforma la doppia elica, DNA rinaturato. La denaturazione avviene con un riscaldamento, mentre un raffreddamento provoca la rinaturazione.

Ma qual è la temperatura con cui si separano i due filamenti? E quale quella per l’appaiamento? Dipende dal contenuto in G e C, più è alto più devo andare a temperature alte per separare i due filamenti; più è alto in A e T, più la denaturazione avverrà a temperature basse.

Assorbanza: ogni nucleotide ha un diverso spettro di assorbimento e lo spettro del DNA è la loro media. Una soluzione di DNA appare trasparente ad occhio nudo.

L’assorbanza comincia ad essere misurabile intorno ai 320 nm, ha un picco a circa 260 nm, seguito da un abbassamento tra 220 e 230 nm.

Una soluzione di DNA nativo, a doppio filamento, ad una concentrazione di 0,04 mg/ml ha un’assorbanza, o densità ottica, OD, di circa 1 a 260 nm.

Tm, temperatura di melting, fusione: valore caratteristico di ogni DNA → è il punto in cui il 50% delle molecole si è denaturata → equilibrio dipende dalla concentrazione delle basi GC e sarà alta Tm. Più è alta questa concentrazione tanto più sarà alta Tm, 40% GC Tm = 87°.

Quando i nucleotidi sono nella doppia elica, il DNA assorbe di meno.

Ipercromia: il DNA nella doppia elica assorbe circa il 40% in meno della stessa quantità di nucleotidi in soluzione.

A 80° l’assorbanza aumenta e significa che del DNA inizia a separarsi.

I meccanismi di denaturazione e rinaturazione sono alla base anche di molte metodologie utilizzate in laboratorio per studiare i geni e l’espressione genica.

Esperimento di ibridazione

Esperimento di ibridazione per determinare se un gene è presente nel genoma di un individuo, quando viene espresso, dove viene espresso e quanto viene espresso.

Si estrae l’RNA da una cellula, lo purifico, ma insieme a quello che mi interessa c’è tutto l’RNA cellulare. Ho anche il DNA del gene che sto studiando e posso farli ibridare; se il DNA e l’RNA ibridizzano significa che il DNA trova il suo complementare nell’RNA e si forma una doppia elica ibrida.

Per visualizzarli uno lo tratto in modo freddo, cioè senza marcatori, mentre l’altro lo tratto in modo caldo quindi in modo radioattivo, marcandolo. Questo perché il DNA non si vede ad occhio nudo e bisogna attuare una strategia per renderlo visibile e misurabile. Devo stare attento per la radioattività, ma ora posso seguirlo.

Quindi ho il gene che sto caratterizzando in laboratorio, quindi so quanto è lungo e so per cosa codifica e mi chiedo se questo gene è presente nel genoma di un cane, ad esempio. Marco questo gene con un isotopo radioattivo P32.

Poi si ha la frammentazione del DNA del cane, blu, la denaturazione e l’assorbimento su filtro di nitrocellulosa, deve avere qualcosa che si appai non l’altro, più si ha la denaturazione del DNA che conosco, marcato con l’isotopo P32 in soluzione. Il filtro di nitrocellulosa trattiene il DNA a singolo filamento, l’RNA a singolo filamento e le proteine. Immersione del filtro in un tampone, soluzione di sale, a pH neutro, più aggiungo l’altro DNA denaturato. Faccio avvenire la reazione alla temperatura di melting, calcolata sul DNA noto, per favorire l’incontro delle molecole. Ibridazione degli acidi nucleici in vitro → identificazione del DNA complementare legato al filtro tramite l’esposizione a lastra radiografica, dove c’è il segnale diventa nera, altrimenti è grigia. Quindi alla fine posso sapere se c’è e quanto ce n’è di materiale radioattivo, e quindi posso conoscere l’efficienza dell’ibridazione.

La complementarietà delle basi deve essere al 100%? No possono esserci delle regioni che non si appaiano: se per il 70% sono simili e possono creare appaiamenti si può creare ibridazione.

Problema: la nitrocellulosa può trattenere il singolo filamento di DNA, non la doppia elica. I punti non toccati possono essere legati al filamento in soluzione, rosso, ma non voglio che questo si leghi alla nitrocellulosa, deve legarsi solo al filamento complementare. Soluzione: aggiungo una soluzione di latte in polvere che è ricco di proteine che vengono legate da tutti i punti della nitrocellulosa che non avevano partecipato ai legami con il DNA, quindi in questa condizione l’unico modo per il filamento di DNA marcato di essere trattenuto sul filtro è quello di legarsi al filamento complementare.

Deve essere fatto alla temperatura di melting del DNA, perché se lo faccio a una bassa temperatura, favorisco un’ibridazione non specifica, poiché in un genoma possono esserci delle regioni che sembrano simili ad un altro DNA e quindi si formano interazioni che falsano il risultato. Devo aumentare la stringenza, specificità della reazione, e favorire solo le interazioni specifiche e al di sopra della temperatura di melting.

Posso anche chiedermi, sapendo che il gene c’è, se è espresso, non è detto. Anziché utilizzare una doppia elica del DNA conosciuto, utilizzo l’RNA di questo gene in provetta, posso sintetizzarlo avendo il gene, un promotore, l’RNA polimerasi, e lo marco, rimuovo il fosforo al 5’ e ne aggiungo uno radioattivo. Se si forma un ibrido RNA-DNA significa che il gene è espresso.

Prelevo campioni di RNA a tempi diversi, da un organismo, e li ibridizzo ad una sonda fredda, non marcata, che è stata depositata sul filtro. Dove vedo lo spot nero c’è stata una forte ibridazione; se sto analizzando invece un genoma posso dire che c’è omologia in quello dove c’è lo spot nero.

L’RNA è la sonda per capire se c’è trascrizione e quindi se un gene è espresso.

Il DNA è la sonda per capire se c’è il gene.

Quindi per capire se il gene è espresso utilizzo un RNA perché per l’espressione si deve passare dalla trascrizione e sintesi del messaggero; mentre il DNA si utilizza come sonda per vedere se c’è il gene. Non si utilizza l’RNA come sonda anche se non ha gli introni questo perché è una molecola molto difficile da lavorare in provetta poiché si degrada velocemente, mentre il DNA è stabile.

Cap. 2 Un gene codifica per una proteina

Come viene usata una sequenza di DNA per costruire una sequenza di amminoacidi di una proteina? Nel 1961 l’analisi genetica delle mutazioni nella regione rll del fago T6 ha dimostrato che il codice genetico deve essere letto a triplette consecutive.

Ogni sequenza di DNA ha tre cornici di lettura possibili poiché se ho un frammento di gene posso partire dalla prima base, dalla seconda o dalla terza; se parto dalla quarta base torno alla modalità di lettura uguale alla prima.

In generale un gene che codifica per una proteina mostra una cornice di lettura aperta chiamata ORF, Open Reading Frame = fase di lettura aperta, cioè possibile lettura dell’informazione genetica da DNA a RNA.

Le altre due cornici di lettura sono bloccate, chiuse, perché altrimenti si formerebbero dei codoni di stop.

Geni colineari e mappe genetiche

Una proteina formata da 100 amminoacidi viene codificata da un gene di 3 volte lo stesso numero di nucleotidi.

La mappa degli amminoacidi della proteina si trova sequenziando il prodotto proteico finale; invece per la mappa di ricombinazione del gene: conosco il gene, lo sequenzio e deduco le triplette e i codoni. Esperimento: i mutanti di un codone della proteina li incrocio con quelli dello stesso codone nel gene → calcolo la frequenza di ricombinazione e scopro la distanza tra le mutazioni.

Corrispondono la mappa di ricombinazione con la mappa fisica della proteina? C’è quasi corrispondenza, si alterano solo alcune posizioni.

Se ho due possibili mutazioni che cascano su due basi diverse di una tripletta posso mapparle, ma la frequenza di ricombinazione è bassa; se invece le mutazioni capitano nella stessa posizione, sulla stessa base della tripletta non cambia nulla e quindi non c’è una distanza, non c’è una ricombinazione e non posso mapparla, test di complementazione.

• Il gene è espresso tramite la produzione di un mRNA: i filamenti del DNA sono uno codificante e uno stampo o non codificante. L’RNA ha la stessa sequenza del filamento superiore del DNA ed è complementare al filamento inferiore.

Il gene è più lungo della sequenza della proteina, quindi anche l’RNA è più lungo: la lunghezza dell’RNA definisce la regione del gene, mentre la proteina definisce solo la regione codificante.

• Nei batteri la trascrizione e traduzione avvengono nello stesso compartimento; mentre negli eucarioti la trascrizione avviene nel nucleo e la traduzione nel citoplasma. In più ci sono delle regioni dette introni che devono essere eliminate per formare l’RNA maturo perché separano le regioni codificanti dette esoni. La maturazione dell’RNA avviene nel nucleo.
• Le proteine agiscono in trans mentre i siti nel DNA agiscono in cis.

Test di complementazione

Una tappa cruciale nel percorso che ha portato alla definizione di gene è stata la comprensione che tutte le sue parti devono essere presenti su un tratto continuo del DNA. I siti che si trovano nello stesso DNA sono detti in cis, mentre i siti localizzati su due molecole diverse sono detti in trans, quindi due mutazioni possono essere in cis, stesso DNA, e non sono complementabili, o in trans, DNA diversi.

Quindi l’espressione del gene può cambiare sia se muto il gene all’interno della cornice di lettura, mutazione stop, sia se colpisco il sito di legame dell’RNA polimerasi o delle proteine che controllano l’espressione di quel gene, se non riconoscono più il sito di legame, il gene non viene espresso. Entrambi i due casi trattano di mutazioni sul gene, ma se viene a mancare l’azione del gene regolatore che dovrebbe riconoscere un sito del gene che sto studiando, allora agisce in trans.

Entrambi gli alleli sintetizzano RNA nel tipo selvatico. Una mutazione sul sito di controllo influenza un allele e interrompe la sintesi di RNA su di esso, mentre continua sull’allele 2: mutazione cis-agente.

La proteina attiva agisce su entrambi gli alleli, quindi una proteina mutante non può legarsi a nessun allele e significa che la mutazione si trova sul gene regolatore che codifica per questa proteina: mutazione trans-agente che è complementabile. Se fornisco alla cellula il gene che codifica questo regolatore, i due alleli torneranno ad essere espressi.

Se una mutazione è trans-agente deve esercitare i propri effetti attraverso un prodotto diffusibile, es. una proteina o un RNA, il quale agisce su numerosi bersagli all’interno della cellula.

Se una mutazione è cis-agente deve influenzare direttamente le proprietà del DNA contiguo, il che significa che non è espresso sotto forma di RNA o di proteina.

Cap. 3 Il gene interrotto

Il gene è molto più lungo rispetto a quello che realmente serve per la sintesi proteica, perché sono presenti introni, cioè segmenti non codificanti che separano le sequenze codificanti, esoni. Splicing è l’eliminazione degli introni e avviene per la maturazione, può avvenire durante la trascrizione o alla fine.

Gli esoni si mantengono nell’mRNA nello stesso ordine in cui si trovano nel DNA, ma le distanze lungo il gene non corrispondono alle distanze lungo l’mRNA o i prodotti proteici.

Le mutazioni negli esoni possono influenzare la sequenza polipeptidica; negli introni possono influenzare lo splicing e quindi impedire la produzione della proteina.

• Come caratterizziamo un gene che codifica per un mRNA? Tramite ibridazione dell’mRNA con il DNA.

Caratterizzazione di un gene non interrotto: alla fine vedo una doppia elica ibrida DNA-RNA.

Caratterizzazione di un gene interrotto: gli introni sono le anse, non hanno trovato una controparte con cui appaiarsi.

Mappa di restrizione e cDNA in provetta

Es. Nell’esone 1 ci sono due siti di taglio di enzimi di restrizione.

Creazione di DNA complementare o cDNA, in provetta: estraggo mRNA dalla cellula e aggiungo poli(T) che si appaia alla coda di poli(A). Aggiungo una DNA polimerasi RNA dipendente, trascrittasi inversa, che mi ricopia un filamento complementare all’mRNA, ma sta sintetizzando DNA. Dopo la degradazione dell’mRNA rimane il poli(T) legato alla sequenza che sarebbe lo stampo → formazione della forcina e sintesi del filamento complementare. cDNA è la prima forma di clonaggio del gene.

Il confronto della sequenza nucleotidica genomica con quella dell’mRNA, cDNA, permette di identificare i siti di giunzione degli esoni.

• Nell’introne sono presenti dei siti di terminazione, codoni di stop, in caso lo splicing vada male appena si entra nell’introne e prima di uscirne ci sono una coppia GT e una AG, uguale per tutti; se una mutazione cambia queste coppie, lo splicing non funziona bene perché non legge queste basi.
• I geni delle globine, alfa e beta, originati dalla duplicazione di un gene ancestrale, quindi detti paraloghi, hanno un’organizzazione comune: i polipeptidi sono molto simili tra di loro, ci sono regioni che si conservano; la differenza tra i due geni riguarda la misura degli introni.

Es. nel topo il gene alfa è di 150 bp, mentre il beta è di 585 bp.

Le sequenze degli esoni invece sono molto simili; ci sono cambiamenti amminoacidici tra una globina e l’altra ma la lunghezza rimane simile, mentre negli introni no.

I geni correlati dal punto di vista evolutivo hanno un’organizzazione strutturale correlata, in cui le posizioni degli introni sono abbastanza conservate. Le variazioni nella lunghezza dei geni sono determinate soprattutto da differenze nella lunghezza degli introni stessi.

Gli introni di questi geni paraloghi non hanno in comune quasi nulla, solo il meccanismo di splicing e quindi gli elementi interni che servono a far avvenire correttamente tale processo.

Le sequenze degli esoni sono conservate; se anche l’introne è conservato significa che quasi tutti gli elementi che contiene servono per lo splicing.

Dot plot, grafico, di ampie regioni nucleotidiche può evidenziare cambiamenti genomici.

La regione verde è identica a quella che dovrebbe essere rossa, ma è spostata e invertita.

Se la regione manca completamente, né rossa né verde, significa che c’è stata una delezione.

La regione verde posizionata lungo la linea rossa indica che c’è stata un’inversione sul sito.

In generale, le mutazioni avvengono con la stessa frequenza sia negli esoni che negli introni, ma le mutazioni degli esoni sono eliminate dalla selezione; mentre gli introni possono accumulare mutazioni e altri cambiamenti, se non influenzano lo sp