Biochimica degli alimenti della nutrizione e delle malattie metaboliche

Biochimica degli alimenti, della nutrizione e delle malattie metaboliche - parte I

Protein quality: an elusive concept

Un ruolo nella definizione della qualità di un alimento è svolto anche dalle proteine. La qualità proteica dell’alimento dipende innanzitutto dalla safety, che può essere determinata da diversi aspetti:

• La presenza di allergeni, che possono essere dannosi per alcune persone: ad esempio la lipid transfer protein presente nella frutta.
• La presenza di glutine (gda 0, gda2, gda4, gda9, γ-gliadina...) dannosa per soggetti celiaci.
• Attività anti-nutrizionali di determinate proteine: si tratta di agenti sequestranti e inibitori delle proteasi e di idrolasi in generale (l’effetto è che se l’alimento è ricco di questi inibitori gli enzimi vengono bloccati e l’alimento non verrà digerito e metabolizzato completamente). L’avidina presente nell’uovo, ad esempio, è una proteina che lega fortemente due molecole di biotina (legami non covalenti ma molto forti). Per fare in modo che non si verifichi questo legame si può denaturare la proteina cambiandone la struttura, ad esempio con il trattamento di cottura, o “rompendola” attraverso le proteasi. Tutti gli inibitori sono proteine che agiscono su degli enzimi, il primo conosciuto è stato l’inibitore della tripsina. Si tratta di proteine molto grosse che legano attraverso legami non covalenti l’enzima viene associato nella zona del sito catalitico e nella zona con interazioni proteina-proteina: di riconoscimento del substrato (NB: non sempre le due parti coincidono). Un altro esempio sono i legumi, i quali sono molto ricchi di inibitori delle proteasi e per fare in modo che non agiscano è necessaria la cottura. L’ovoalbumina, ha una struttura molto simile a quella dell’antitripsina e inoltre, svolge una funzione analoga di inibitore sull’enzima tripsina.
• Coinvolgimento in malattie metaboliche (come la fenilchetonuria): la fenilalanina-ossidasi necessaria al metabolismo della fenilalanina non è presente e l’accumulo di questo aminoacido può provocare conseguenze molto gravi, fino alla morte. La fenilalanina deriva dagli alimenti e anche dall’aspartame, un estere metilato della fenilalanina.

Un altro aspetto importante nella definizione della qualità proteica di un alimento è l’aspetto nutrizionale:

• Composizione in termini di aminoacidi essenziali e non essenziali.
• Digeribilità e biodisponibilità: possono essere dipendenti dalla sequenza, dal processo tecnologico e dalla matrice. L’aminoacido che si trova all’interno di una struttura deve poter essere liberato dall’enzima proteolitico. Bisogna tenere però conto che anche la proteasi più forte non può agire in siti dove non è in grado di arrivare. Se il sito si trova all’interno di una struttura molto compatta non è automatico che questa riesca a liberarlo e a renderlo accessibile: questo ruolo è del processo tecnologico a cui viene sottoposta la proteina (o dalla struttura della stessa). Le caseine sono proteine poco strutturate, sono infatti pensate per alimentare individui ed esseri viventi che non hanno estese capacità digestive, come i neonati. Il processo a cui la proteina viene sottoposta può rendere più o meno accessibile un aminoacido: una proteina denaturata rende l’aminoacido più accessibile alle proteasi, ma questo vale solo per le proteine isolate, infatti negli alimenti ci sono anche altri nutrienti, come carboidrati e grassi, che creano nuove interazioni modificando gli aminoacidi che non vengono più riconosciuti dalle proteasi o formando degli aggregati che li rendono inaccessibili.

Il processo tecnologico

Nella trasformazione un ruolo importante nella definizione della qualità proteica è rappresentato dal processo tecnologico: l’effetto del trattamento tecnologico ha influenze sulla sequenza amminoacidica, la quale viene modificata covalentemente (e cioè dal punto di vista dei legami covalenti). Ciò significa che il gruppo R tipico di ogni aminoacido viene modificato, ma possono essere modificate anche la struttura e il bilancio idrofobicità-idrofilicità (che non si basa solo sulla conta degli aminoacidi idrofili e idrofobici, ma sulla struttura della proteina, la quale può esporre zone più idrofobiche o idrofile), importante perché va a modificare la capacità di interagire con i solventi come l’acqua, la solubilità delle proteine stesse in un alimento (precipitati nel latte), la capacità di stabilizzare emulsioni, gel e schiume (in cui c’è una fase idrofobica unita dalle proteine ad una fase idrofobica).

Esempio: la struttura del collagene

Il collagene è una proteina strutturale e ha una funzione ben precisa a seconda del tipo di tessuto in cui si trova; essa è la principale proteina del tessuto connettivo a cui conferisce solidità. Le sue proprietà meccaniche dipendono dalla sua struttura quaternaria: catene polipeptidiche individuali che si uniscono in una tripla elica e tra diverse triple eliche nelle miofibrille. Il collagene ha una struttura ripetitiva formata da colina-glicina-idrossiprolina. Quest’ultima è un aminoacido, derivata dalla prolina, tipico solo del collagene. La stabilizzazione della tripla elica da soli legami idrogeno inter-catena rende la struttura fragile. Se il tessuto che contiene collagene deve sopportare sforzi meccanici di una certa intensità, occorre irrobustire la struttura formando legami covalenti trasversali (cross-link). Questi legami si trovano sia tra le catene polipeptidiche individuali della tripla elica e tra diverse triple eliche nelle microfibrille. I legami covalenti sono basati sull’ossidazione dei residui R di lisina, i quali avvengono in presenza di acido ascorbico come cofattore. Il numero dei legami covalenti delle triple eliche cresce con il peso e con l’aumento dell’età (es. manzo è meno tenero del vitello).

Capacità delle proteine di assorbire acqua

La struttura tridimensionale della proteina è la struttura più stabile che essa assume a seconda dell’ambiente in cui si trova. Tolte le proteine di membrana, tutte le proteine generalmente si trovano in un ambiente acquoso. La struttura nativa delle proteine, dunque, è adatta all’ambiente acquoso: tende a esporre i residui idrofili e a “nascondere” quelli idrofobici. Se i residui idrofili sono esposti, infatti, si formano dei legami idrogeno con l’acqua che crea una sfera di idratazione attorno: questo fa in modo che all’interno dell’alimento l’acqua venga trattenuta. Se la proteina non riesce a trattenere l’acqua, la carne ad esempio risulta molto dura. Le sieroproteine hanno una grande capacità di trattenere l’acqua. L’acido glutammico ha un gruppo COOH in più rispetto alla glutammina e, dunque, ha una maggior capacità di trattenere l’acqua. La proteina può, a seconda delle esigenze, fare in modo di trattenere maggiore o minore quantità di acqua. L’organizzazione strutturale delle proteine è importante per le caratteristiche dell’alimento. Buona parte dei trattamenti tecnologici sugli alimenti vanno a modificare la componente strutturale della proteine.

Le proteine sono normalmente in un ambiente acquoso per cui espongono i residui idrofili, mentre meno esposti al solvente sono le regioni idrofobiche (minimizzata l’esposizione dei residui idrofobi all’ambiente). Ciò da all’alimento la caratteristica di legare l’acqua. La struttura proteica è fondamentale per determinare la solubilità e la capacità di formare gel ed emulsioni. Le proteine in base alle loro caratteristiche hanno la capacità di formare dei gel proteici, ovvero delle organizzazioni strutturali regolari. Una rete proteica è caratterizzata da fori regolari. La rete è in grado di trattenere qualcosa al suo interno, a seconda delle dimensioni: generalmente acqua e possibilmente una componente lipidica, micronutrienti legati a proteine o ad altri componenti. La gelatina è un gel formato da collagene: rete proteica del collagene + acqua. Si tratta di un gel reversibile perché scaldandolo la struttura del gel si perde e si passa allo stato liquido. Anche il formaggio è un gel: caseine che hanno interazioni idrofobiche e idrofile mediate dal calcio.

Agenti che modificano le strutture proteiche:

• Agenti fisici: temperatura, stress meccanico, alte pressioni, radiazioni ad alta energia;
• Agenti chimici: pH, sale, agenti chelanti, composti red-ox, solventi a base di acqua e alcol, solventi, interferenze olio/acqua.

Generalmente nell’alimento avvengono sia modificazioni chimiche che modificazioni fisiche.

L’effetto del pH

Il pH cambia lo stato di ionizzazione degli aminoacidi e, dunque, ne modifica la carica, la solubilità, la solvatazione, l’abilità di interagire con ioni, l’abilità di interagire con cofattori organici o inorganici.

• La carica viene modificata quando aggiungendo il limone alla carne, questa cambia il colore o quanto il latte si trasforma in yoghurt.
• Il pH agisce sui residui degli amminoacidici carichi (arginina⁺, aspartato^-, glutammato^-). Variazioni della carica dei residuo amminoacidici fanno sì che questi possano legare in modo diverso microelementi (es. a pH=3 il calcio non è in grado di legarsi alle proteine)

L’effetto del sale

A bassa molarità l’aggiunta di sale “scherma” le cariche sulla superficie delle proteine e influenza gli aggregati che si formano per interazione ionica. A bassa molarità favorisce la solubilizzazione proteica. Ad alta molarità:

• Il sale aggiunto compete con i gruppi carichi sulle proteine per l’acqua libera;
• Effetto “salting out” quando è rimosso il guscio proteico di solvatazione;
• La solvatazione del sale aggiunto sequestra acqua necessaria per la crescita di microrganismi e processi enzimatici;
• Precipita “trascinando” le proteine;
• Riduce la solubilità favorendo l’aggregazione delle proteine.

La quantità di sale necessaria per conservare un prodotto alimentare dipende da come esso vi penetra, ossia da come viene trattenuto dalle proteine, e questo dipende dal pH.

L’effetto degli agenti chelanti

Agenti chelanti usati comunemente nella tecnologia alimentare sono: polifosfati, citrato o acido citrico, lattato o acido lattico, EDTA. Essi modificano i micronutrienti presenti nell’alimento e competono con le catene laterali degli aminoacidi nell’interazione con cofattori metallici o con metalli che stabilizzano regioni strutturali individuali o interazioni multiproteiche.

I polifosfati, chelando il calcio, destrutturano l’aggregazione delle caseine che dunque riescono ad assorbire più acqua, ma in questo modo rendono il calcio non più biodisponibile. Enzimi metallo-dipendenti come proteasi e ossidasi vengono inattivati e reazioni chimiche metallo-dipendenti, come la reazione di Fenton, sono sensibilmente rallentate.

Agenti ossidanti e riducenti

Tali sostanze riducono o ossidano i residui degli aminoacidi. In particolare, in tecnologia alimentare vengono ossidati i gruppi SH della cisteina a formare ponti disolfuro affinché tali residui non siano ossidati dall’ossigeno con formazione di sostanze secondarie dannose → R-S-S-R.

R-SH + R-SH → R-S-S-R + H₂

È possibile anche la reazione (scambio disolfuro):

R₁-S-S-R₂ + R₃-SH → R₁-S-S-R₃ + R₂-SH

Metodi per studiare la struttura e la conformazione delle proteine in una matrice alimentare:

• Metodi spettroscopici: hanno il vantaggio di poter essere eseguiti sull’intero alimento senza che sia necessario isolarne le proteine.
  • Misurazione della capacità di alcuni residui amminoacidici, soprattutto idrofobici, di emettere uno spettro di fluorescenza quando stimolati con certe lunghezze d’onde. Lo spettro (intensità ed energia) emesso dipende dalla struttura della proteina, ossia dalla presenza e dalla disposizione dei sopraddetti residui. Si impiega soprattutto il triptofano in quanto idrofobico e presente 1-2 volte per proteina.
  • Spettrofotometro a luce polarizzata: se il composto è chirale, la luce polarizzata viene ruotata di un angolo dipendente dal potere ottico dei diversi aminoacidi e dalla struttura della proteina. Misurando l’angolo di cui viene ruotata si può determinare la struttura della proteina.
  • Marcatori di fluorescenza (probes): sono molecole che in soluzione non risultano fluorescenti, ma lo diventano quando legati ad una regione proteica. Vi sono probes con diverso ingombro, i più grandi si legano se le regioni idrofobiche delle proteine sono molto esposte. Esistono anche probes spettroscopici in grado di assorbire la luce se legati a specifici residui amminoacidici.

Queste tecniche possono essere impiegate per esempio per studiare come la sostituzione del 20% del saccarosio in un dolce abbia effetti sulla stabilizzazione delle proteine. La β-lattoglobulina è particolarmente stabile poiché lega una serie di acidi grassi del latte. Per questo motivo essa non è facilmente idrolizzabile al fine di produrre un latte anallergico. Per rendere più agevole l’operazione è necessario privare il latte di parte degli acidi grassi. La modifica della struttura ha rilevanza anche nella digeribilità delle proteine. Infine, alcune proteine (es. sieroproteine) hanno cavità idrofobiche in cui possono “infilarsi” composti idrofobici come polifenoli, aromi, ecc. Tali informazioni sono state dedotte dall’utilizzo delle tecniche sopradescritte.

Effetti della temperatura

Il calore non è quasi mai in grado di rompere il legame peptidico, tuttavia le proteasi che eseguono tale operazione sono più efficienti ad elevata temperatura. Il calore può rompere il legame idrogeno il quale ha un ruolo nello stabilizzare il reticolo acquoso attorno alla proteine. Questo va ad influenzare la struttura tridimensionale, generalmente si traduce nell’esposizione di regioni idrofobiche (instabilità). La temperatura agisce anche in modo ridotto sul pKa dei residui amminoacidi. I gruppi R di alcuni aminoacidi in dipendenza della temperatura e pH possono dare reazioni:

• β-eliminazione: residui di cisteina e serina a dare deidroalanina. La deidroalanina è molto reattiva e da come principale prodotto la lisinoalanina. Questa composto che si ritrova negli alimenti è stabile e non è presente in natura. Il fenomeno determina una riduzione del valore aminoacidico dell’alimento (riduzione di cisteina, serina, lisina e tripsina). Nell’organismo la lisinoalanina alimenta metabolismi secondari (cancerogeno?), ma può essere metabolizzata dal microbiota a dare composti meno tossici.
• Glicazione aspecifica con formazione di composti di Maillard: modificazioni covalenti che formano composti non fisiologici.
• Formazione di furosina attraverso modificazioni dei residui di lisina. Il quantitativo di furosina presente nel latte è discriminante per distinguere quello sterilizzato da quello pastorizzato. Viene valutato anche nei formaggi e nella pasta secca (essiccamento a bassa e ad alta temperatura).
• Formazione di acrilamide in seguito a cottura: il composto si forma durante la deaminazione dell’asparagina in acido aspartico. Può essere presente in prodotti da forno e amidi fritti; per impedirne la formazione il prodotto può essere pretrattato per deaminare in condizioni controllate l’asparagina in acido aspartico.

Una proteina presenta una sola struttura nativa, ma può assumere numerose strutture denaturate diverse in quanto sono tanti i trattamenti che possono alterare tale struttura. Le modificazioni strutturali possono essere reversibili, ossia perdurare per la sola durata del trattamento, o irreversibili, ossia mantenersi anche una volta che il trattamento è cessato. Nel 99% dei casi le proteine vengono modificate durante il trattamento termico e poi riassumono la struttura nativa al termine di questo. Per osservare le modifiche strutturali si possono utilizzare le tecniche precedentemente illustrate (vedi metodi per studiare la struttura e la conformazione delle proteine). Infatti, la struttura nativa e le diverse strutture denaturate hanno tutte uno spettro di fluorescenza differente. Per esempio, la β-lattoglobulina nativa ha due residui di triptofano, uno un po’ esposto, altro completamente nascosto. Questa struttura ha uno spettro di fluorescenza caratteristico (uguale per la proteina in soluzione acquosa e nel siero se non per una modifica di intensità determinata dall’effetto schermo di altri componenti). β-lattoglobulina in un’emulsione di latte ed olio presenta uno spettro differente (diversa intensità e spostamento del massimo), quindi si deduce che la struttura della proteina in emulsione è diversa da quella in soluzione. Lo spettro è ancora diverso se la proteina viene sottoposta all’azione della tripsina, se sottoposta ad un trattamento termico o se si impiega un agente denaturante. Questo è molto rilevante, ad esempio un trattamento può rendere un allergene non più allergizzante.

Allo stesso scopo possono essere utilizzati i marcatori di fluorescenza (probes) i quali indicano la presenza di residui idrofobici superficiali. Le modificazioni strutturali (trattamenti) aumentano l’esposizione delle regioni idrofobiche. I residui idrofobi esposti conferiscono la tendenza delle proteine a polimerizzare e divenire meno solubili, influenzando così le proprietà funzionali delle proteine negli alimenti.