Biochimica alimentare

Schema biochimica

Soluzione di alcol: prolamine (gliadine nel frumento; secaline).

L'interazione proteine-ambiente definisce le caratteristiche del prodotto: texture, non solubili in un sistema alimentare: scleroproteine, modalità di conservazione, consistenza degli impasti. La solubilità può variare in base a fattori ambientali (non cambia la struttura nativa) o per denaturazione.

Regolo le interazioni tra proteine e macromolecole in modo da controllare le caratteristiche del prodotto.

Le modificazioni proteiche possono essere:

• Strutturali: modifica della funzione strutturale (actina miosina) o della struttura (denaturazioni).
• Funzionali: modifica di enzimi (funzione di conservazione o protecnologica).

Acqua

Nell'alimento ha 3 ruoli:

• Solvente.
• Strutturante: influenza i sistemi tridimensionali.

Suddividiamo l'acqua in base alla funzione strutturante in:

• Acqua pura Aw=1.
• Acqua libera Aw=0.8-0.9 è a disposizione dell'attività microbica e delle reazioni enzimatiche.
• Acqua coordinata Aw=0.8-0.25 solo per le reazioni enzimatiche (non ho crescita microbica).
• Acqua legata Aw=0.25-0.0 non congela mai; è un mezzo di reazione: sia per MO che per enzimi.

Water Holding Capacity: capacità all'interno di un alimento di trattenere l'acqua la quale altrimenti migrerebbe verso la superficie modificando la texture. La misuro tramite l'attività dell'acqua; in particolare guardando l'acqua legata, coordinata e libera.

L'interazione tra proteine-micromolecole può essere positiva (solubilizza i micronutrienti es. ferro) o negativa (lega fortemente le vitamine).

Interazioni proteine-solvente

L'interazione proteine-acqua definisce la solubilità. La solubilità è influenzata da:

• Caratteristiche ambientali: forza ionica, pH, presenza di metalli.
• Struttura della proteina: nativa più solubile, denaturata meno solubile.

Classifichiamo in base alla solubilità in diversi mezzi:

• Water: albumine (sieroalbumine, lattoalbumine nel latte).
• Soluzioni saline: globuline (immunoglobuline) possono essere fattori anti-nutrizionali in quanto inibitori di proteasi.
• Soluzioni alcaline o acide: gluteline (caseine nel latte; glutenine nel frumento).
• Soluzione di alcol: prolamine (gliadine nel frumento; secaline).

Caso 1: Forza ionica

Aumento la concentrazione dei sali in soluzione; essi dissociano, si idratano e l'acqua così non interagisce più con le proteine che espongono le regioni idrofobiche e nel mentre, a causa dell'azione dei sali, vedono le proprie cariche schermarsi, così sono costrette ad aggregarsi e poi precipitano (salting out) → diminuisce la solubilità. In questo caso la struttura della proteina non è cambiata (fattore ambientale). Se allontano il sale ritornano solubili → processo reversibile.

• Conta anche la natura del sale; alcuni hanno un'azione più o meno violenta e oltre a schermare modificano la struttura.
• I sali sono classificati in base alla loro affinità con l'acqua: strutturanti (sfera di idratazione elevata), destrutturanti (sfera non elevata; rompono le coppie ioniche delle proteine; solo in questo caso ho denaturazione).

Caso 2: pH

Se ho un pH elevato o basso la proteina è solubile; al PI però ho carica netta 0 e quindi le proteine si aggregano e precipitano. Non ho modificazioni strutturali, tranne che a range limite di pH (proprio di ogni proteina).

Applicazioni della variazione della solubilità negli alimenti

• Classificazione proteine nei cereali: citoplasmatiche (albumine e globuline) e di riserva (prolamine e glutenine).
• Controllo dei trattamenti termici: a pH 4.6 le caseine precipitano e se sono denaturate (hanno subito trattamento termico) precipitano anche le sieroproteine. Più trattamenti ho fatto, più sieroproteine avrò.

Modificazioni tecnologiche della solubilità

• Utilizzo il pH come agente modificante → formaggio.
• Riscaldo, acidifico e salo il latte → ricotta.
• Aggiunta di ioni metallici → tofu.
• Albumina subisce un trattamento termico: meringa o uovo sodo.
• Enzimi: tagliano le strutture in complessi più piccoli ed aumenta la solubilità (birra).

Gel

Gel: sostanza che evidenzia proprietà simili ad un sistema solido dove sono presenti grandi quantità di solvente.

Ricotta

RICOTTA: gel irreversibile stabilizzato da interazioni idrofobiche ed elettrostatiche. Prodotto dalle sieroproteine, contiene lipidi+acqua.

Acidifico con acido citrico il sireo, riscaldo a 90°, sosta per 30 minuti, e raffreddo → si forma un gel dall'interazione di beta-latto-globuline e alfa-latto-globuline, stabilizzato da interazioni elettrostatiche idrofobiche. Le proteine a causa del calore e dall'acidificazione denaturano e creano nuove strutture quaternarie che inglobano acqua e lipidi.

Uovo sodo

UOVO SODO: gel irreversibile, stabilizzato da interazioni covalenti di tipo S-S e idrofobiche. Le ovoalbumine sono ricche di cisteine (tanto solfo), hanno 17 residui di cisteina che formano 8 ponti intracatena mentre quello spaiato rimane all'interno della struttura.

Scaldo, denaturo e l'SH spaiato viene esposto e interagisce con un ponte S-S determinandone la rottura e avviene lo scambio di disolfuro. Il nuovo SH a sua volta interagisce con altri ponti e ciò crea un reticolo ben ordinato stabilizzato da interazioni S-S; e permette l'interazione con altre proteine (ponte intercatena).

Formaggio

FORMAGGIO: gel irreversibile stabilizzato da interazioni elettrostatiche e idrofobiche.

• AlfaS1, alfa S2, beta: non hanno una separazione di zone (idrofiliche-idrofobiche).
• Elevato contenuto di serina e prolina (sono quelle delle curve) e sono cariche negativamente. La serina può andare incontro a modificazioni post-traduzionali (fosforilazione e glicosidazione) → ciò porta la proteina ad assumere una struttura random.
• K-caseina: le zone idrofobiche sono concentrate verso la parte centrale; ci sono due residui di cisteina che formano un ponte.

Per raggiungere una stabilità di cariche in ambiente acquoso deve creare delle micelle: risultato dell'associazione delle 4 caseine in una struttura che permette la stabilità in acqua. Le caseine si associano in submicelle in modo da nascondere le parti idrofobiche; il calcio fa da ponte e stabilizza i fosfati delle caseine stabilizzando la struttura e garantendo l'aggregazione. La micella è quindi stabilizzata da legami elettrostatici mediati dal calcio e interazioni idrofobiche tra submicelle.

Posso modificare le interazioni tra le submicelle in modo da avere prodotti con particolari caratteristiche: formaggio fuso, mozzarella per la pizza.

Posso modificare il pK dei gruppi fosfati e di conseguenza modifico l'associazione con il calcio, oppure utilizzo un agente chelante che modifica la funzione del calcio (e quindi le interazioni tra submicelle). Otteniamo il formaggio fuso.

Collagene

COLLAGENE: gel reversibile stabilizzato da interazioni elettrostatiche, legami idrogeno e legami covalenti. Se scaldo disorganizzo i legami H, il collagene solubilizza; se raffreddo le proteine si riorganizzano formando una rete stabilizzata da legami H che ingloba acqua.

Tofu

TOFU: gel irreversibile formato da globuline della soia ricche di residui amminoacidici acidi; aggiungo il calcio si forma una rete proteica stabilizzata da interazioni elettrostatiche. Può inglobare lipidi o acqua per una texture migliore; uso il calcio che è meno amaro.

Ruolo delle proteine nella stabilizzazione di due fasi

Ruolo delle proteine nella stabilizzazione di due fasi che altrimenti sarebbero separate.

SOL: fase continua liquida al cui interno è dispersa una fase solida (caseine nel latte).

EMULSIONE: fase liquida idrofilica al cui interno è contenuta una fase liquida idrofobica.

• Maionese: le proteine del tuorlo hanno esposte le regioni idrofiliche, tramite azione meccanica denaturo e la proteina espone le zone idrofobiche che si legano all'olio → inglobo la sostanza grassa. La denaturazione deve essere controllata (azione meccanica regolare) e l'olio va aggiunto piano (altrimenti impazzisce – separazione nette fasi).
• Burro: emulsione inversa; incorporo l'acqua in una matrice grassa.

SCHIUMA: liquido idrofilico e un gas.

• Meringa: monto l'albume e per azione meccanica denaturo e inglobo aria → si forma una schiuma per scambio di residui S-S che formano un reticolo che trattiene l'area.
• Impasto: glutenine e gliadine si denaturano per azione meccanica formando il glutine (rete proteica stabilizzata da S-S e idrofobiche) che incorpora i gas che si sviluppano dalla lievitazione. Il sistema è però instabile e quindi devo cuocerlo altrimenti si smolla. La struttura è formata da alveoli al cui interno c'è l'aria; le parti idrofobiche sono esposte all'ambiente idrofobico, mentre le idrofiliche verso la fase acquosa continua. Le cause di instabilità: permeabilità del gas (esce dalla struttura), scorrimento dell'acqua verso in punti nodali, evaporazione dell'acqua. Per rallentare questi processi controllo la T o faccio un intervento ingredientistico (aggiungo zucchero per aumentare la viscosità).

Caratteristiche delle proteine in schiume ed emulsioni

• Entrambe devono avere zone idrofobiche e idrofiliche bilanciate.
• Per la schiuma devono essere solubili nella zona continua.
• Per le emulsioni può essere stabilizzata da proteine non perfettamente solubili; l'importante è che espongano le zone idrofobiche.

Microemulsioni

MICROEMULSIONI: uso una sostanza solida per dare più rigidità all'emulsione in quanto non avviene la compenetrazione tra fasi. La parte solida è rappresentata da nanoparticelle. Ho caratteristiche differenti come si evince dallo spettro di fluorescenza.

Fluorescenza: tecnica spettroscopica che sfrutta la capacità di alcune specie chimiche di riflettere in un salto quantico discreto e ampio l'energia assorbita sotto forma di radiazione luminosa.

La lunghezza d'onda di emissione è superiore rispetto a quella di eccitazione.

Spettro: caratterizzato dall'intensità di fluorescenza e dalla lunghezza d'onda del massimo d'emissione.

Le capacità emulsionanti delle proteine si hanno quando non sono denaturate.

Le proteine trattengono i composti volatili (aromi) quindi possono essere integrate nella matrice per trattenere gli aromi.

ES: l'albumina del siero è in grado di legare acidi grassi (potenzialmente volatili) all'interno di una tasca idrofobica, ma se viene denaturata perde questa capacità.

Interazione proteine con i polifenoli

I polifenoli (antiossidanti) si legano fortemente alle proteine modificando il funzionamento di alcuni enzimi → assorbiamo meno peptidi.

Nel vino posso influenzare positivamente il colore o formare degli aggregati che precipitano dando torbidità, quindi il mosto viene chiarificato in modo da eliminare quest'ultimi. L'operazione di chiarifica migliora le proprietà organolettiche (nei bianchi migliora la stabilità): aggiungo proteine con affinità verso i polifenoli che mi danno fastidio.

Uso diversi tipi di proteine:

• Beta-siero-albumina o ovoalbumina: vanno dichiarate in quanto sostanze allergeniche.
• Proteine vegetali: proteine del pisello, soia, glutine e lenticchia.
• Soia: funziona bene ma è un OGM.
• Lenticchia: funziona male.
• Glutine: funziona male, crea allergie → dovrei dichiararlo.
• Pisello: funziona bene e non va dichiarato.

Li confronto misurando la variazione di torbidità in diversi campioni di mosto. Dopo aver chiarificato controllo la variazione dell'aroma: in alcuni casi possono perdere parte della componente aromatica.

Denaturazione da processo delle proteine alimentari

Distinguiamo i trattamenti in base all'agente modificante:

• Agenti fisici: calore e azione meccanica.
• Agenti chimici: pH, glicosidazione, isomerizzazione.
• Agenti microbiologici e enzimatici: i cui prodotti sono peptidi e singoli amminoacidi.

Utilizzati per produrre prodotti come pasta, pane, formaggio.

Denaturazione termica

Non ho la rottura del legame peptidico, ma cambiano le interazioni interne deboli (legami non covalenti; idrofobiche e S-S). L'effetto del trattamento termico dipende dall'intensità del trattamento e dal tempo di processo; il primo bersaglio sono:

• Cellule intere.
• Piccole molecole.
• Polimeri strutturati.
• Polimeri non strutturati.
• Spore.

Con questo trattamento le proteine si denaturano a causa della disorganizzazione dell'acqua intorno alle proteine. La denaturazione in questo caso può essere reversibile o irreversibile e la struttura che la proteina acquista durante il processo è chiamata struttura transiente. L'effetto del trattamento dipende anche dall'ambiente intorno alla proteina: possono esserci composti che interagiscono con la forma transiente o che la proteggono.

1. Primaria: non cambia niente a livello della sequenza amminoacidica perché il legame peptidico non viene rotto, ma possono esserci modificazioni dei gruppi R (viene modificata di conseguenza la digeribilità e il valore nutrizionale del prodotto). Reazione di Maillard tra una lisina e lo zucchero; la lisina non è più utilizzabile perché non viene riconosciuta dagli enzimi. È come se lo zucchero diventasse il nuovo R. La struttura della proteina è più accessibile dagli zuccheri se è denaturata.
2. Secondaria e terziaria: sono influenzate dalla modifica dell'acqua intorno alla loro struttura e quindi si modifica l'interazione proteina-ambiente → influenza le interazioni che stabilizzano la struttura della proteina e quindi la sua biodisponibilità e l'attività biologica.

Metodi di rilevazione delle modificazioni delle proteine

Per vedere queste modificazioni → metodi di rilevazione delle modificazioni delle proteine: senza danneggiare la struttura.

1. Misura dell'assorbanza: metodo che si basa sulla misura della fluorescenza del triptofano. Faccio uno spettro di fluorescenza e noto che il triptofano riemette la luce a frequenze differenti a seconda della struttura in cui si trova il triptofano (nativa-denaturata).
2. Misura dell'assorbanza tramite l'utilizzo di marcatori: si basa sull'utilizzo di PROB (marcatori) unito alla spettroscopia. Utilizzo una sonda per mappare i gruppi R degli amminoacidi (tra i più comuni uso quello che analizza gli SH della cisteina). La sonda interagisce con l'SH e quindi il gruppo idrofobico entra in risonanza emettendo una luce differente dalle altre. Se la proteina è nativa l'SH è interno quindi il marcatore non si lega e non emette luce, se invece la proteina è denaturata il marcatore si lega ed emette luce.

ES. ALA ha tre residui di triptofano: dopo la pastorizzazione si denatura e lo vedo con la fluorescenza:

• ALA legata al calcio: siero del latte ottenuto per precipitazione isoelettrica. Abbiamo una oloproteina; faccio la fluorescenza e vedo che fino a 60° non ho modificazioni del max di emissioni (non denatura), dopo i 60° inizia a modificarsi (denaturazione).
• ALA senza calcio: siero del latte ottenuto per coagulazione enzimatica. Abbiamo una apoproteina; dopo i 40° inizia già a denaturarsi.

In base a ciò che voglio ottenere uso uno piuttosto che l'altro. Ne conosco quindi la T critica → aumentando la temperatura la velocità di esposizione aumenta.

ES. BLG ha due residui di triptofano.

Considero tre sieri con concentrazione di BLG diversa: confrontando i max di emissione notiamo che più la proteina è concentrata, più è meglio.

Ogni triptofano riemette l'onda in modo diverso all'interno della stessa proteina e ciò che ottengo (sul grafico) è una media dell'emissione dei tre.

Gli altri due metodi si basano sull'utilizzo di marcatori (danno indicazioni rispetto alle modificazioni avvenute).

1. Mappatura regioni idrofobiche superficiali: si basa sulla fluorescenza. I marcatori si legano alle zone idrofobiche superficiali (non entrano nelle proteine); quando si denatura le parti idrofobiche vengono esposte e i marcatori si legano, quindi avrò una risposta differente (fluorescenza) dalla nativa. Se non si denatura non ho cambiamento.

Esistono diversi tipi di marcatori a seconda dell'ingombro sferico, della proteina ecc. e posso anche usare marcatori di diverso tipo contemporaneamente. Posso denaturare la proteina e aggiungere marcatori ottenendo una curva di titolazione ottenendo le seguenti informazioni:

• Fluorescenza max: equivale al numero delle regioni idrofobiche (rilevo la variazione del numero di siti).
• Costante di dissociazione: ci dà informazioni relativa l'affinità tra il marcatore e la proteina (variazione regioni idrofobiche).

Il rapporto tra questi due parametri si chiama indice di idrofobicità superficiale. Analizzo campioni con diversa concentrazione della proteina e scopro che più è concentrata meno si denatura (come prima).

Utilizzando questo metodo riesco a distinguere un latte pastorizzato da uno sterile (il primo ha subito trattamento termico → sieroproteine denaturate), ma non lo distinguo da un UHT (entrambi hanno subito un trattamento termico). Utile per le frodi.

Se titolo con i marcatori durante il trattamento ed ottengo un valore x di emissione, e a fine trattamento un valore y inferiore parte delle denaturazioni erano reversibili.

Formazione dei polimeri

La struttura quaternaria è alla base delle proprietà delle proteine e dei polimeri proteici.

Formazione polimeri: sono stabilizzati da interazioni covalenti di tipo idrofobico e dagli scambi di disolfuro. Le proteine coinvolte negli scambi di disolfuro devono avere dei gruppi SH che con il trattamento termico diventano reattive nei confronti delle interazioni SS intracatena; interferiscono rompendo i legami SS, appropriandosi dell'S formando un nuovo SS e un SH (si scambiano) per cui si crea un polimero nuovo.

Ciò è un problema negli impianti perché a seguito di trattamenti termici se i polimeri sono troppo lunghi precipitano, si aggregano e formano le incrostazioni.

La formazione di incrostazione dipende dai processi di preriscaldamento e di raffreddamento negli impianti; più lentamente il latte veniva esposto al calore membrana (vecchia+caseine).