Appunti esame biologia molecolare

Il dogma centrale della biologia

Il dogma centrale della biologia afferma che l’informazione genetica fluisce dal DNA all’RNA e ai polipeptidi, quindi da un gene si ottiene una proteina. Questo dogma è stato messo in discussione soprattutto dopo il sequenziamento del genoma umano. Si sapeva che il numero di proteine era altissimo e, sulla base della conoscenza di questi numeri, ci si aspettava dei numeri altrettanto elevati di geni che codificassero per le proteine. In realtà, la sorpresa è stata proprio che il numero di geni codificanti per le proteine è risultato estremamente basso rispetto a quello atteso (circa 20.000). Di conseguenza, sono state proposte diverse definizioni di gene. Gerstein nel 2007 propose una nuova definizione di gene: “Il gene è l’unione di sequenze genomiche che codificano per un set di prodotti funzionali potenzialmente sovrapposti”. Un gene può codificare per più prodotti e il meccanismo alla base di questo fenomeno è lo splicing alternativo.

Storia della biologia molecolare

La nascita della biologia molecolare risale alla scoperta della doppia elica del DNA da parte di Watson e Crick (1953). Negli anni precedenti si verificarono una serie di eventi che hanno portato alla scoperta del DNA. Queste scoperte si riferiscono a tre campi della biologia: l’eredità e i geni (Mendel), i cromosomi e infine il DNA (Miescher parlò di nucleina, Griffith). Solo quando le scoperte relative a questi tre campi sono riuscite a convergere è stata possibile la scoperta della doppia elica. Weaver fu il primo a parlare di “biologia molecolare” per designare il nuovo ramo della biologia che usava tecniche fisiche per studiare macromolecole presenti negli organismi.

Negli anni ’40 si costituì il “Phage group”, di cui fanno parte Max Delbruck, Salvatore Luria e Alfred Hershey. Schrödinger nel suo libro “What is life” parla di gene come portatore d’informazione. Tante discipline hanno quindi contribuito a costruire la biologia molecolare (fisica, batteriologia, virologia, biochimica, genetica). Oggi le scoperte della biologia molecolare contribuiscono allo sviluppo di moltissime discipline. “La biologia molecolare è la disciplina che localizza la spiegazione dei fenomeni biologici nelle proprietà delle macromolecole presenti negli organismi…si è passati progressivamente dalla morfologia e dalla fisiologia alle cellule, fino ai costituenti cellulari, considerati all’origine dei fenomeni biologici” (Michel Morange).

Esperimenti chiave nella scoperta del DNA come materiale genetico

Esperimento di Griffith

Vediamo ora quali sono gli esperimenti che hanno portato alla dimostrazione che il DNA è il materiale genetico. Nel 1928 Griffith dimostrò l’esistenza di un principio trasformante ereditabile. Inoculando i topi con il ceppo di pneumococco capsulato o ceppo di tipo S, il topo moriva. Inoculando i topi con il ceppo senza capsula o di tipo R, il topo non moriva. Inoculando i topi con cellule di tipo S uccise dal calore, il topo non moriva. Inoculando delle cellule di tipo R e delle cellule di tipo S uccise dal calore, il topo moriva. Egli concluse che le cellule R di pneumococco erano state trasformate. Il principio trasformante poteva essere DNA o proteine.

Esperimenti di Avery, Mac Leod e McCarty

Nel 1944 Avery, Mac Leod e McCarty fecero degli esperimenti in vitro, ripartirono con i batteri S uccisi con il calore e mescolati con i batteri R vivi inoculati nel topo e prelevarono dal topo morto i batteri S che dovevano contenere il famoso principio trasformante. Isolarono quindi questo principio trasformante per cercare di capire se si trattasse di proteine o di DNA. Una volta isolati i batteri S, li fecero crescere su delle piastre di agar e li inocularono in un terreno liquido. Proseguirono con la preparazione dell’estratto cellulare e frazionarono l’estratto nei suoi componenti macromolecolari. In tutte le provette vennero aggiunti pneumococchi R vivi. Questa miscela venne poi lasciata crescere su piastre di agar in modo da andare a visualizzare in quale dei diversi casi si otteneva la trasformazione consistente nel vedere crescere dei batteri di tipo S anziché di tipo R. Solo nel caso di DNA mescolato con batteri R si osserva la trasformazione.

Esperimento di Hershey e Chase

Nel 1952 Hershey e Chase misero a punto l’esperimento del frullatore che pose fine alla diatriba proteine-DNA. Hershey e Chase utilizzarono il batteriofago T2 e cellule di E. Coli. Marcarono due componenti del fago in modo diverso così da poterli distinguere. All’epoca potevano essere sintetizzate delle molecole che erano precursori del DNA e delle proteine. Questi precursori sono stati fatti in maniera tale da contenere un isotopo radioattivo. Nel caso del precursore del DNA si scelse un nucleotide in cui il fosforo era sostituito dall’isotopo radioattivo ³²P. Nel caso del precursore delle proteine si scelsero amminoacidi marcati con l’isotopo radioattivo ³⁵S.

La marcatura selettiva è ottenuta permettendo ai fagi di infettare cellule di E. Coli che stanno crescendo in un terreno liquido che contiene i due precursori. Tutti i fagi che si produrranno da cellule cresciute nel terreno contenente ³²P saranno marcati con il ³²P. Allo stesso modo, tutti i fagi che si produrranno da cellule cresciute nel terreno contenente ³⁵S saranno marcati con il ³⁵S. I fagi marcati vengono isolati e utilizzati per fare infettare dei nuovi batteri non marcati. Il contatto tra fagi marcati e batteri non marcati viene mantenuto solo per un tempo limitato. Poi usarono il frullatore per staccare le porzioni proteiche che rimanevano all’esterno della cellula batterica. Le cellule venivano poi centrifugate ottenendo un pellet e un sopranatante. Il pellet corrispondeva alle cellule batteriche con tutto il materiale del fago che era entrato nel batterio mentre nel sopranatante rimanevano le parti di involucro proteico rimaste all’esterno. Hershey e Chase misurarono il tipo e la quantità di radioattività presente sia nel sopranatante sia nel pellet. La radioattività derivante dalle proteine si trova nel sopranatante. La radioattività derivante dal DNA si trova nel pellet di cellule batteriche. Solo il DNA (³²P) è in grado di entrare nelle cellule batteriche e di dare origine ad una progenie fagica.

Scoperta della struttura del DNA

Successivamente ci furono altre scoperte. Pauling scoprì la struttura delle proteine, prese ispirazione da ciò e ipotizzò una struttura a tripla elica del DNA completamente sbagliata. La tecnica che contribuì alla scoperta della struttura tridimensionale del DNA è la diffrazione dei raggi X. Un cristallo è un sistema in cui tutte le copie di una stessa molecola si dispongono in maniera ordinata. I raggi colpiscono gli atomi che si trovano all’interno del cristallo e vengono diffratti con un certo angolo. I raggi diffratti colpiscono il rivelatore. Sulla base dell’immagine restituita è possibile ricostruire la struttura tridimensionale di tutti gli atomi. All’epoca però, riuscire ad ottenere cristalli di DNA era impossibile.

Franklin e Wilkins riuscirono ad ottenere qualcosa che si avvicinava a un cristallo, ossia delle fibre di DNA in cui i filamenti risultavano paralleli tra loro. Attraverso esperimenti di diffrazione dei raggi X, Franklin ottenne delle immagini formate da una croce centrale e da macchie più dense sopra e sotto. Watson e Crick, dopo aver osservato queste immagini, ebbero l’idea dell’elica e ipotizzarono una serie di misure. L’analisi dei profili di diffrazione dei raggi X ottenuti da fibre di DNA indicava che: il DNA ha una forma regolare ad elica, l’elica compie un giro completo su se stessa ogni 34 Å; l’elica ha un diametro di circa 20 Å; la distanza tra due nucleotidi adiacenti è di 3,4 Å (10 residui per ogni giro d’elica); la densità del DNA suggerisce che esso debba contenere due o più catene polinucleotidiche; il diametro costante dell’elica si spiega supponendo che le basi su ciascuna catena siano affacciate verso l’interno con limitate possibilità di combinazione.

Un aiuto venne dal lavoro di Chargaff (1949). Chargaff analizzò la quantità di DNA presente in diversi organismi. Procedette estraendo il DNA e trattandolo con un acido in modo da ottenere singoli nucleotidi. Quantificò poi ciascun nucleotide mediante cromatografia su strato sottile. Fece poi diversi rapporti fra le basi azotate. Si limitò a pubblicare il suo lavoro senza dedurne alcuna ipotesi. Watson e Crick si soffermarono su questi rapporti. La proporzione di G è sempre uguale a quella di C e la proporzione di A è uguale a quella di T. Le basi azotate possono essere presenti in più forme e possono subire tautomerizzazione. Inizialmente Watson e Crick sbagliavano in quanto osservavano le basi nella loro forma meno frequente. Fu grazie al suggerimento di Donohue che scoprirono la doppia elica. Donohue suggerì quale dovesse essere la conformazione corretta delle diverse basi per rendere possibile la formazione dei legami H.

Caratteristiche del modello di DNA di Watson e Crick

Il DNA è strutturato in due catene polinucleotidiche antiparallele, ovvero orientate in direzione opposta; lo scheletro di zucchero-fosfato è situato all’esterno dell’elica e porta cariche negative sui gruppi fosfato; le basi sono orientate verso l’interno e le loro strutture piatte e organizzate in coppie giacciono su un piano perpendicolare all’asse dell’elica, sovrapposte l’una all’altra; basi complementari formano appaiamenti specifici mediante formazione di legami idrogeno (2 tra A e T e 3 tra G e C). La conformazione a doppia elica è quella che suggerisce la struttura energeticamente più favorevole.

Le coppie di basi contribuiscono alla stabilità termodinamica della doppia elica mediante: l’energia che si libera con la formazione delle coppie, l’interazione tra coppie di basi adiacenti, l’impilamento tramite interazioni idrofobiche tra i sistemi di elettroni delle basi impilate (base stacking). Ogni coppia di basi è ruotata di circa 36° intorno all’asse dell’elica rispetto alla coppia successiva (10 coppie di basi portano ad una rotazione di 360°). Il legame C-N forma un angolo di 45° con lo zucchero, si delineano così un solco minore (circa 12 Å di larghezza) e un solco maggiore (circa 22 Å di larghezza). La doppia elica è destrorsa (si avvolge in senso orario).

Struttura della doppia elica del DNA

Non sempre le classiche misure del DNA sono rispettate. Nell’immagine a sinistra osserviamo l’impalcatura esterna zucchero-fosfato e all’interno le basi azotate con i legami idrogeno tratteggiati. Il giro dell’elica è di 34 Å e corrisponde mediamente a 10,5 paia di basi. Il diametro è costante ed è di 20 Å. L’immagine a destra prende il nome di rappresentazione space-filling. Si osservano bene i due solchi maggiore e minore con le relative ampiezze. I solchi sono molto importanti infatti solo a livello dei solchi le basi hanno accesso all’ambiente esterno e possono quindi interagire con le proteine. DNA e RNA infatti sono sempre associati a proteine.

Unità fondamentale del DNA

L’unità fondamentale che costituisce il DNA è il nucleotide. Il nucleotide è costituito da tre componenti: la base azotata, lo zucchero pentoso e il gruppo fosfato. Lo zucchero al centro lega da un lato la base azotata e dall’altro lato il gruppo fosfato. Lo zucchero è uno zucchero pentoso ossia a cinque atomi di carbonio e viene chiamato β-D-2-Deossiribosio. Questo zucchero in realtà può esistere in forma lineare ma all’interno dello zucchero assume la sua struttura ad anello. In questo anello il C1’ e il C4’ sono uniti attraverso l’atomo di ossigeno dell’ossidrile legato al C4’.

Gli atomi di carbonio hanno una nomenclatura particolare: C1’, C2’ ecc. Questo sarà importante quando si parlerà della direzionalità del DNA. Il C2’ non presenta l’ossidrile ma è legato solo a due atomi di idrogeno. Ciò stabilisce la differenza fra il deossiribosio presente nel DNA e il ribosio presente nell’RNA. Le basi azotate sono delle molecole aromatiche, eterocicliche e planari. Si distinguono purine e pirimidine. Le purine sono costituite da due anelli e quelle presenti all’interno del DNA sono l’adenina e la guanina. I gruppi funzionali sono responsabili della formazione dei legami a idrogeno fra le basi complementari. L’azoto in posizione numero 9 è l’azoto che forma il legame con il C1’ dello zucchero. Le pirimidine sono anelli singoli a sei atomi. Le pirimidine presenti all’interno del DNA sono citosina e timina. Anche qui si osservano i gruppi funzionali. L’azoto responsabile della formazione del legame con il C1’ dello zucchero è l’azoto in posizione 1. L’uracile si trova al posto della timina nell’RNA.

Lo zucchero, la base e il fosfato si legano quindi per costituire il nucleotide. Il legame che si forma tra la base e lo zucchero è un legame β-glicosidico che porta all’eliminazione di una molecola d’acqua. L’unione di una molecola di zucchero con la base azotata porta alla formazione del nucleoside. Il gruppo fosfato è legato tramite un legame fosfoesterico al C5’ del deossiribosio. Anche in questo caso si ha l’eliminazione di una molecola d’acqua.

I nucleosidi possono essere nucleosidi monofosfato, difosfato e trifosfato a seconda del numero di gruppi fosfato legati al C5’. I nucleosidi monofosfato, difosfato e trifosfato possono anche essere denominati nucleotidi. I gruppi fosfato sono definiti α, β e γ con l’α più vicino al carbonio in posizione numero 5. I legami tra il primo e il secondo fosfato e tra il secondo e il terzo fosfato sono dei legami ricchi di energia. I nucleotidi trifosfato sono precursori nella sintesi degli acidi nucleici.

Polarità del filamento di DNA

Ogni nucleotide è unito al nucleotide adiacente da un legame covalente fosfodiesterico che si viene a formare tra il fosfato legato al C5’ di un nucleotide e il gruppo OH legato al C3’ di un nucleotide adiacente. In questo modo si forma l’impalcatura zucchero-fosfato. Il filamento di DNA ha quindi una sua polarità: generalmente si ha un’estremità 3’-OH e un’estremità 5’-P. I due filamenti appaiati hanno un andamento antiparallelo. La sintesi del DNA avviene ad opera di enzimi particolari che sono detti DNA polimerasi. Le DNA polimerasi aggiungono nucleotidi soltanto nella direzione 5’-3’ grazie a uno stampo. Le DNA polimerasi sono quindi DNA-dipendenti.

Stabilità della doppia elica di DNA

La doppia elica di DNA viene stabilizzata da numerosi fattori tra cui i legami idrogeno (C≡G e A=T) fra basi complementari e l’impilamento (stacking) delle basi. Lo stacking deriva da: interazioni idrofobiche (sovrapposizione degli orbitali p), interazioni di Van der Waals ed interazioni elettrostatiche. Il fatto che C e G formano tre legami a idrogeno e A e T ne formano due comporta che regioni diverse di DNA potrebbero avere stabilità diversa. Un DNA particolarmente ricco di C e G avrà una stabilità maggiore mentre un tratto con maggiore quantità di A e T sarà caratterizzato da una minore stabilità.

Le basi possono esistere in forme tautomeriche diverse: forma chetonica (prevalente) o forma enolica (situazione rara che può fare insorgere mutazioni nel DNA) per quanto riguarda timina e guanina e forma amminica (prevalente) e imminica per quanto riguarda adenina e citosina. Watson e Crick ringraziarono il loro collega per avergli indicato quale fosse la forma corretta delle basi. Nelle diverse forme la possibilità di formare legami idrogeno cambia completamente. Coppie di basi adiacenti possono avere un’energia di stacking diversa a seconda del tipo di base. Se si ha la sovrapposizione di basi CG e GC, a questo corrisponderà un’energia di impilamento maggiore. Cambiando il tipo di basi che si sovrappongono cambierà anche l’energia di stacking. La somma tra i legami idrogeno e le interazioni di impilamento fa sì che ci siano zone più stabili e meno stabili all’interno dello stesso genoma (la stabilità non è uniforme).

La forma a elica aumenta la capacità di sovrapposizione, diminuisce infatti la distanza tra le basi. La rotazione che seguono le basi per formare l’elica fa sì che la distanza tra le basi sia minima. In questo modo si evita l’ingresso di acqua.

Flessibilità strutturale del DNA

Non sempre le misure del DNA sono rispettate. La doppia elica è infatti dotata di una certa flessibilità strutturale. Esistono diversi fattori che contribuiscono a questa flessibilità:

• Il movimento del legame tra C2’ e C3’ dello zucchero produce l’effetto “sugar pucker”;
• La rotazione attorno al legame β-N-glicosidico tra la base e lo zucchero produce due diverse conformazioni delle basi che sono chiamate conformazione sin e conformazione anti;
• Modificazioni delle basi che producono movimenti twist, roll e slide;
• Propeller twist.

Parliamo quindi di polimorfismi strutturali del DNA. L’anello dello zucchero è dotato di un certo grado di flessibilità e, per motivi sterici, non può essere planare. Due atomi di carbonio si spostano infatti fuori dal piano. Questi atomi sono il C3’ o il C2’...