Appunti esame Biologia molecolare delle cellule staminali (BMCS)

Biologia molecolare delle cellule staminali

Le cellule che compongono il nostro organismo sono cellule specializzate e svolgono dunque una determinata funzione. Le colture cellulari ci permettono di coltivare in laboratorio le cellule al di fuori dell’organismo di provenienza. Grazie alle colture, queste cellule possono quindi essere mantenute e sopravvivere al di fuori dell’organismo. Le colture cellulari sono estremamente utili sia per la ricerca di base sia per scopi utilitaristici. Per effettuare una coltura cellulare si prende un espianto da un tessuto. Successivamente, le cellule vengono dissociate e coltivate in piastre apposite con un terreno di coltura.

Carrel coltivò i fibroblasti, ossia cellule mesodermiche, al di fuori dell’embrione di pollo. Si rese conto che questi fibroblasti, posti in coltura e nutriti con succo di pollo, sopravvivevano. Iniziò quindi a pensare che i fibroblasti fossero immortali. All’epoca si iniziarono a commercializzare prodotti a base di succo di pollo. In realtà, i fibroblasti non sono immortali ma sono cellule normali: infatti, il succo di pollo che Carrel forniva alle sue colture conteneva altri fibroblasti. Con Carrel è nato però il problema dell’immortalità delle cellule.

Il caso di Henrietta Lacks

Molto importante fu il caso di Henrietta Lacks. Henrietta aveva un cancro all’utero. Si recò nell’unico ospedale in cui accoglievano pazienti di colore. Qui, fondamentale fu l’incontro con dei ginecologi. In particolare, ci sono 2 tipi di carcinomi: 1) in situ non invasivo; 2) maligno. I dottori volevano capire che relazione ci fosse tra il tessuto normale, il carcinoma non invasivo e il carcinoma maligno. Volevano quindi isolare e coltivare in laboratorio questi 3 tipi di cellule. L’8 febbraio del 1951, Henrietta venne sottoposta a radioterapia. Prima, però, le sue cellule vennero prelevate e coltivate in vitro. Grazie a George Gey, alla moglie Margaret Gey (fissata con la pulizia) e all’assistente Kubicek, le cellule di Henrietta furono coltivate in vitro. Si osservò che le cellule tumorali erano veramente immortali in quanto sopravvivevano senza aggiunte (vd. succo di pollo nei fibroblasti di Carrel). Queste cellule addirittura sono sopravvissute anche dopo la morte di Henrietta.

Il limite di Hayflick

Il dubbio sull’immortalità delle cellule venne risolto nel 1961. Hayflick fece infatti un esperimento che permise di dirimere la questione sull’immortalità delle cellule. In particolare, studiò fibroblasti normali e non cellule tumorali. Alcuni di questi fibroblasti derivavano da organismi femminili mentre altri da organismi maschili. I fibroblasti femminili erano andati incontro a 10 cicli di duplicazione mentre i fibroblasti maschili erano andati incontro a 40 cicli di replicazione. Hayflick mise insieme queste popolazioni di fibroblasti e le mantenne nelle stesse condizioni di coltura per un po’ di tempo. Si accorse che nella coltura erano presenti solamente cellule derivanti da organismi femminili (osservò i cromosomi). Quindi, le cellule che avevano subito meno cicli di duplicazione erano in grado di sopravvivere. Questo concetto stravolse l’idea di Carrel: non è il nutrimento a tenere vive le cellule ma le cellule normali presentano un limite intrinseco alla capacità proliferativa. Questo limite venne chiamato limite di Hayflick.

Le cellule normali, a differenza delle cellule tumorali, vanno incontro a senescenza. Il limite intrinseco alla capacità proliferativa è dovuto al fatto che i telomeri sono destinati ad accorciarsi ad ogni ciclo replicativo.

Tipi di colture cellulari

Esistono diversi tipi di colture cellulari. I fibroblasti di Hayflick sono cellule primarie. Le cellule primarie sono cellule normali, hanno capacità di auto-rinnovamento limitata, sono tipicamente differenziate. Le cellule HeLa sono cellule tumorali, come quelle isolate da Henrietta. Esistono poi cellule immortalizzate modificate a partire da cellule primarie. Si tratta quindi di cellule che acquisiscono una capacità di auto-rinnovamento illimitata.

Le cellule staminali

Ma allora cosa sono le cellule staminali? Le cellule staminali sono cellule che si auto-rinnovano illimitatamente generando cellule figlie che sono identiche alla cellula madre (quindi, proliferano similmente alle cellule tumorali ma non sono cellule tumorali) e che possono differenziarsi in cellule specializzate che svolgono una specifica funzione all’interno dell’organismo (vd. neuroni). La cellula figlia è identica alla cellula madre: quindi, la cellula figlia ha le stesse capacità di auto-rinnovarsi e di differenziare. Se questa caratteristica non venisse rispettata, non parleremmo di auto-rinnovamento ma di semplice replicazione.

Origine del termine "staminale"

Ma come è nato il termine “staminale”? Ernst Haeckel (1834-1919) era uno dei maggiori fautori della teoria dell’evoluzione di Darwin. A supporto della teoria di Darwin, era solito disegnare alberi filogenetici. Si riferiva a questi alberi filogenetici in relazione ad antenati comuni, in relazione alla complessità degli organismi e in relazione agli stadi dello sviluppo embrionale. “Stambäume” in tedesco significa albero di famiglia.

In particolare, secondo Haeckel la cellula staminale costituiva l’antenato comune di tutti gli organismi pluricellulari, i quali dovevano necessariamente essersi evoluti a partire da un organismo unicellulare. Inoltre, Haeckel considerava “stem cell” anche lo zigote: infatti, a partire dallo zigote, ossia la cellula uovo fecondata, si generano strutture via via più complesse fino a dar vita all’organismo adulto. Haeckel sintetizzò questa sua teoria della ricapitolazione nella frase “l’ontogenesi ricapitola la filogenesi”.

Oltre a “stem cell” Haeckel coniò altri termini come “ecologia”. Queste affermazioni non possono essere applicate alla definizione odierna di cellula staminale. Infatti, l’antenato unicellulare comune non differenzia e lo zigote si differenzia ma non si auto-rinnova in maniera illimitata. Weismann (1834-1914) era più interessato all’aspetto dello sviluppo embrionale e propose la teoria dell’eredità del plasma germinale. Secondo questa teoria, il plasma germinale poteva essere trasmesso da una generazione all’altra in maniera inalterata e conferiva la capacità di originare tutte le cellule differenziate dell’organismo.

Boveri e Häcker (1887-1892) pensarono che questa sorta di plasma rimanesse inalterato solo nella linea germinale mentre veniva perso o inattivato nella linea somatica. Per questi scienziati, il termine “staminale” fa quindi riferimento alle cellule della linea germinale. Nel 1905 si sono studiate le cellule del sangue. Le cellule del sangue si generano durante tutta la vita dell’organismo. Infatti, all’interno del sistema ematopoietico ci sono cellule che possono differenziare e originare nuove cellule del sangue.

Definizione di cellule staminali adulte

Esistevano 2 linee di pensiero opposte. Secondo la prima linea di pensiero esistono 2 cellule: una dà origine alla serie bianca del sangue mentre l’altra dà vita alla serie rossa del sangue. Secondo l’altra linea di pensiero esiste una sola cellula che poi origina tutte le cellule del sangue. Quest’unica cellula venne definita “cellula staminale”.

Siamo dunque arrivati a definire le cellule staminali adulte. Le cellule staminali adulte sono staminali perché sono in grado di auto-rinnovarsi e di differenziare. A differenza delle cellule staminali si tratta però di cellule committed: le cellule staminali del sangue non possono originare cellule del muscolo ma solo cellule del sangue. Il mito di Prometeo già spiegava l’esistenza di cellule in grado di rigenerare i tessuti. Quindi, in realtà, si tratta di un concetto molto antico.

Le cellule staminali adulte hanno quindi la funzione di rigenerare i tessuti. Non tutti i tessuti hanno però questa capacità. Ad esempio, le cellule staminali adulte si trovano nella pelle, nel sangue, nel fegato e nei muscoli mentre non sono presenti a livello del sistema nervoso e a livello del cuore. Oltre a rigenerare i tessuti, le cellule staminali adulte hanno la funzione di mantenere l’omeostasi e cioè mantengono costante la composizione cellulare di un determinato tessuto.

Potenziale differenziativo delle cellule staminali adulte

Le cellule staminali adulte hanno uno specifico potenziale differenziativo. La multipotenza è la capacità di una cellula di differenziare in molteplici tipi cellulari del tessuto di appartenenza. L’unipotenza è la capacità di una cellula di differenziare verso un unico tipo cellulare. Le cellule staminali del sangue sono cellule multipotenti in quanto originano il progenitore della linea mieloide e il progenitore della linea linfoide. I progenitori si differenziano ma non si auto-rinnovano illimitatamente.

Come possiamo dimostrare tutto quello che abbiamo detto riguardo le cellule staminali del sangue? Utilizzo un organismo modello come il topo e lo irradio in modo da eliminare le cellule staminali che si trovano nel midollo osseo. Il midollo osseo è la nicchia staminale delle staminali ematopoietiche. A questo punto fornisco al topo delle staminali ematopoietiche marcate con il gene reporter e verifico se nel sangue di questo topo si formano cellule differenziate di entrambi i lineage marcate con il gene reporter, quindi fluorescenti.

Faccio la stessa cosa con il progenitore mieloide e vado a vedere cosa si forma nel sangue. Questo esperimento può essere perpetuato per tutta la vita dell’organismo. Nel primo caso, ossia fornendo cellule staminali ematopoietiche, mi aspetto di trovare cellule fluorescenti per tutta la vita dell’organismo. Contemporaneamente nel midollo osseo osserverò un pool di cellule staminali del sangue fluorescenti. Nel secondo caso, ossia fornendo il progenitore mieloide, all’inizio troverò cellule fluorescenti della linea mieloide ma, con il passare del tempo, questa popolazione si perderà.

Se dopo 3 anni prelevo le cellule del midollo osseo contenenti le staminali fluorescenti e trapianto queste cellule in un secondo topo, allora, se la cellula era veramente staminale, per tutta la vita del secondo topo sarà in grado di generare cellule differenziate e di mantenere un pool non differenziato. Posso fare la stessa cosa con un terzo topo e così via. Le cellule staminali della cornea sono cellule unipotenti in quanto sono in grado di differenziarsi solo in cellule corneali.

Il concetto di nicchia staminale

Nel 1978 Schofield elaborò il concetto di nicchia staminale. Questo concetto è venuto fuori dallo studio delle cellule staminali ematopoietiche. La nicchia staminale è quel microambiente altamente organizzato che controlla l’omeostasi della cellula staminale. La nicchia staminale delle cellule staminali del sangue è rappresentata dal midollo osseo. Il trapianto del midollo osseo permette infatti di rifornire la componente staminale che genera la parte corpuscolata del sangue.

Esistono anche altre nicchie staminali. Schofield si rende conto che all’interno di questa nicchia le cellule staminali del sangue sono in contatto con altre cellule che non sono staminali ematopoietiche ma che controllano il comportamento della staminale ematopoietica. Quando la cellula staminale ematopoietica viene rimossa dalla nicchia va incontro a differenziamento. Se invece questa cellula staminale rimane all’interno della nicchia allora il differenziamento non avviene.

Funzioni e importanza della nicchia staminale

All’interno della nicchia la cellula staminale può andare incontro a mitosi. Una delle 2 cellule figlie mantiene il contatto con la nicchia oppure esce ma poi rientra nella nicchia. Questa cellula sarà identica alla madre e sarà quindi una staminale ematopoietica. Infatti, il suo differenziamento sarà bloccato dai segnali che vengono dalla nicchia. L’altra cellula figlia, invece, è destinata a differenziarsi. Si parla quindi di una divisione asimmetrica.

Cos’è che previene il differenziamento? La nicchia staminale invia segnali alla cellula staminale. Il segnale che arriva dalla nicchia attiva le cosiddette vie di trasduzione del segnale che tipicamente partono con il legame di un ligando su un recettore, che può trovarsi a livello della membrana oppure a livello citoplasmatico o nel nucleo. Si genera così una cascata di trasduzione del segnale che dà vita a cambiamenti nell’espressione genica e/o a modifiche post-traduzionali delle proteine. Le vie di trasduzione del segnale sono molto complicate.

Componenti della nicchia staminale

Quali sono i componenti della nicchia staminale della cellula staminale ematopoietica? Nel midollo osseo troviamo osteoblasti, osteoclasti, cellule mesenchimali, adipociti, cellule vascolari, cellule di Schwann che non fanno mielina. Tutti questi componenti possono quindi influenzare la staminale ematopoietica. Come facciamo a capire quali sono le componenti essenziali della nicchia? Ad esempio, posso considerare un promotore attivo solo nelle cellule di Schwann. Sotto il controllo di questo promotore inserisco un gene di suicidio. Quindi, elimino selettivamente solo le cellule in questione. Osservo poi quello che succede. Se si perde la componente staminale del sangue, questo significa che le cellule di Schwann erano in realtà delle componenti essenziali della nicchia.

Ma come faccio a capire che la cellula di Schwann non è essa stessa una cellula staminale? Trapianto le cellule di Schwann in un topo che non ha il midollo osseo. Ovviamente, quello che mi aspetto è che non si rigeneri il sangue dalle cellule di Schwann. Ad oggi, non riusciamo a mantenere indifferenziate le cellule staminali ematopoietiche in laboratorio. Per questo è necessario il trapianto di midollo osseo. Se noi sapessimo ricreare in laboratorio il microambiente della nicchia staminale potremmo coltivare ed espandere queste cellule a scopi terapeutici risolvendo così il problema della disponibilità di donatori di midollo osseo.

Le cellule staminali adulte si trovano quindi in contatto fisico con la rispettiva nicchia staminale. Finché c’è questo contatto fisico la nicchia staminale previene il differenziamento. In caso di divisione asimmetrica si originano 2 cellule figlie: una è identica alla cellula madre e rimane quindi staminale, l’altra lascia la nicchia e differenzia. La cellula che lascia la nicchia può differenziare in modo immediato oppure può prima proliferare e poi differenziare. In caso di divisione simmetrica le cellule figlie vanno a ripopolare il pool di cellule staminali presenti nella nicchia staminale.

L’attività delle cellule staminali è sotto il controllo di tutta una serie di segnali provenienti dalle cellule che popolano la nicchia. Infatti, questi segnali avviano vie di trasduzione del segnale che portano al mantenimento della nicchia o al differenziamento.

La nicchia delle cellule staminali ematopoietiche

La nicchia delle cellule staminali ematopoietiche è il midollo osseo. Il microambiente di questa nicchia è molto complesso. Ad esempio, gli osteoblasti producono il segnale SDF1 che trova il suo recettore CXCR4 a livello delle cellule staminali ematopoietiche. L’immunoprecipitazione e quindi l’utilizzo di anticorpi primari e secondari ci consente di visualizzare la presenza del recettore CXCR4 in membrana. Come facciamo a dimostrare che il segnale SDF1 è uno sei segnali importanti per regolare l’attività delle cellule staminali del sangue?

Innanzitutto, possiamo pensare di inibire il segnale SDF1 attraverso competitori o comunque impedendo in qualche modo il legame al recettore CXCR4. Se SDF1 era un segnale fondamentale, allora osserveremo che la cellula staminale differenzierà. Tuttavia, potrebbero esistere altri segnali in grado di stimolare il recettore CXCR4. Quindi, oltre a impedire il legame di SDF1 al recettore dobbiamo silenziare il recettore sulla cellula staminale ematopoietica. L’effetto che osserveremo sarà sempre lo stesso: la cellula staminale differenzia.

In questo caso abbiamo descritto saggi funzionali per perdita di funzione. Il calcio ha sicuramente un ruolo molto importante nella nicchia staminale delle cellule staminali del sangue, ossia il midollo osseo. Il calcio è molto concentrato in prossimità dell’osso mentre allontanandosi via via dall’osso la sua concentrazione diminuisce. Quindi, il calcio controlla l’attività delle cellule staminali ematopoietiche. Secondo questo modello, quando la cellula staminale lascia la nicchia allora differenzia.

Esistono però delle eccezioni. Infatti, secondo il fenomeno della mobilizzazione le cellule staminali potrebbero lasciare la nicchia, entrare nel circolo sanguigno e poi compiere l’homing ossia rientrare in nuova nicchia rimanendo indifferenziate. Questo fenomeno è molto importante. Infatti, il sangue non è un tessuto localizzato in una particolare regione del corpo ma è un tessuto diffuso. Dunque, ci sono diverse nicchie che potrebbero avere la necessità di essere ripopolate.

Il trapianto del midollo osseo non riguarda tutte le ossa del paziente malato ma si sfruttano la mobilizzazione e l’homing. L’epidermide è un tessuto con un elevato turnover in quanto ci protegge dalla disidratazione e dall’ambiente esterno. Quindi, anche qui si trovano delle cellule staminali adulte. In particolare, queste cellule si trovano a livello dello strato basale dell’epidermide. Quando le cellule staminali dell’epidermide differenziano, danno origine a cellule ad amplificazione transiente (TA cells).

Le TA cells sono in grado di proliferare ma lo fanno con un numero definito di cicli replicativi. Successivamente si formano le cellule PMD. Si tratta di cellule postmitotiche che smettono di proliferare e differenziano migrando verso gli strati superiori dell’epidermide per poi perdersi.

Un derivato delle cellule dell’epidermide è rappresentato dalle cellule della cornea. La cornea è trasparente in quanto viene attraversata dalla luce che però può danneggiare le cellule. Per questo la cornea deve essere continuamente rigenerata. Le cellule della cornea vengono rigenerate dalle cellule staminali limbali che non si