Appunti di Microbiologia agraria

Microbiologia agraria: ecofisiologia dei microrganismi

Significato dell'ecofisiologia

L'ecofisiologia è lo studio dei parametri che influenzano la crescita dei microrganismi; si occupa anche dei fattori che influenzano le loro performance. Come performance si intende la capacità che questi hanno di raggiungere un determinato obiettivo tecnologico, nutrizionale o organolettico. Conoscere i parametri che influenzano la crescita dei microrganismi ci consentirà sia di favorire la crescita quando parliamo di microrganismi utili al nostro processo biologico, sia di arrestarla o rallentarla nel caso in cui facciamo riferimento a microrganismi alteranti o patogeni:

• Alteranti sono quelli che attraverso il loro metabolismo sono in grado di modificare negativamente le caratteristiche strutturali e organolettiche di una matrice alimentare (brutto sapore, brutto odore);
• Patogeni sono quelli in grado di causare reazioni avverse e patologie al consumatore (matrice alimentare dannosa per il consumatore).

Non necessariamente un patogeno è alterante e viceversa.

Fattori che influenzano la crescita dei microrganismi

• Intrinseci legati alle caratteristiche proprie della matrice alimentare nella quale il microrganismo si sviluppa. I più importanti sono:
  • pH
  • Potenziale ossido-riduttivo
  • Contenuto in sostanze nutritive
  • Attività dell'acqua (a_w)
  • Contenuto in sostanze inibitrici (antimicrobici)
  • Presenza di particolari strutture biologiche (strutture che per esempio consentono il passaggio dei gas, ritenzione di acqua ecc., quindi caratteristiche strutturali).
• Estrinseci legati all'ambiente nel quale la matrice alimentare è posta. I più importanti sono:
  • Temperatura
  • Umidità ambientale relativa
  • Presenza e concentrazione di alcuni gas
  • La presenza e l'attività di altri microrganismi (possono consumare sostanze nutritive, essere un forte competitore, secernere sostanze inibitrici).

Temperatura

La temperatura influenza la velocità delle reazioni la quale è descritta dall'equazione di Arrhenius. L'andamento della velocità di reazione è lineare ed aumenta all'aumentare della temperatura. In particolare, in un sistema biologico bisogna considerare un insieme complesso di reazioni; la velocità delle reazioni chimiche si può relazionare alla crescita dei microrganismi (essendo direttamente proporzionali). In realtà la linearità tra incremento della temperatura e l'incremento della velocità di crescita si verifica solo in un determinato intervallo. La curva devia dalla linearità in più punti originando una curva che ha l’aspetto a campana; infatti, dopo un certo valore di temperatura la velocità di crescita decresce.

Velocità di crescita è il rapporto tra la variazione del numero di microrganismi nell’intervallo di tempo. Esistono tre punti specifici detti temperature cardinali:

• Temperatura minima: la temperatura al di sotto della quale la velocità di crescita è uguale a zero;
• Temperatura ottimale o optimum: la temperatura alla quale la velocità di crescita è massima;
• Temperatura massima: la temperatura oltre la quale la velocità di crescita è pari a zero.

1. Valori più bassi della temperatura minima o più alti della temperatura massima non sono necessariamente letali.
2. Il massimo di temperatura è generalmente più vicino all’optimum rispetto al minimo.
3. I motivi per i quali la velocità di crescita si azzera sono differenti per il valore minimo ed il valore massimo. In particolare, a temperature inferiori alla minima si ha una solidificazione delle membrane cioè una perdita di fluidità che impedisce gli scambi della cellula con l'esterno e viceversa (le due code di acidi grassi dei fosfolipidi si solidificano nella membrana); al di sopra della temperatura massima si ha la denaturazione delle proteine e degli acidi nucleici (abbiamo tutti gli enzimi e i trasportatori che si denaturano).

Sulla base delle temperature cardinali possiamo classificare i microrganismi in grandi gruppi:

• Microrganismi psicrofili: hanno optimum intorno a 4°C.
• Microrganismi mesofili: hanno optimum intorno ai 37°C.
• Microrganismi termofili: hanno optimum intorno ai 60°C.
• Microrganismi ipertermofili: hanno optimum superiore agli 80°C.

In campo alimentare bisogna considerare anche un altro gruppo microbico: i microrganismi psicrotrofici i quali sono dei microrganismi che hanno l’optimum dei mesofili o termofili ma presentano un minimo prossimo allo zero. È importante questo gruppo poiché riescono a crescere, seppur in modo molto rallentato, alle temperature di refrigerazione. Tra questi troviamo molti alteranti e patogeni.

La reazione tra velocità di crescita è temperatura può anche essere analizzata da un altro punto di vista prendendo in considerazione il parametro chiamato tempo di generazione cioè il tempo che intercorre tra la generazione di cellule figlie a partire dalla cellula madre. Se consideriamo il tempo di generazione e non la velocità di crescita il grafico assume un andamento a campana rovesciata. Ciò significa che all'optimum di temperatura abbiamo il tempo di generazione minimo.

Caratteristiche principali dei microrganismi psicrotrofici

Microrganismi termofili o perlopiù mesofili che sono in grado di crescere a temperature uguali o inferiori a 7°C. Esempi: Alcaligenes, Brochotrix, Corynebacterium, Flavobacterium, Pseudomonas, Lactobacillus, Micrococcus, Enterococcus...

• Migliore funzionalità dei sistemi di trasporto a livello della membrana cellulare: sono in grado di modificare la composizione degli acidi grassi di membrana consentendo il trasporto anche a basse temperature; incremento degli acidi grassi insaturi della membrana associato con meccanismi fisiologici della cellula (decremento del punto di congelamento della membrana cellulare che quindi rimane in uno stato fluido ed attivo). Per esempio sostituendo nei fosfolipidi agli acidi grassi, acidi grassi a catena più corta o modificando la struttura grazie alla formazione di doppi legami (attraverso la desaturasi) e di ramificazioni.
• Metabolismo adattato alle basse temperature; questi microrganismi hanno valore di Q₁₀ relativamente basso, cioè un valore che esprime come cambia la velocità della reazione enzimatica al variare di 10 gradi della temperatura. In realtà in un sistema biologico il Q₁₀ è intorno a 1-1,5 ciò significa che quel microrganismo passando da 20 gradi a 30 gradi moltiplica per 1,5 la velocità di crescita (viceversa rallenterebbe). Valori di Q₁₀ pari a 2 sono tipici dei termofili (raddoppia la velocità di crescita aumentando di 10 gradi la temperatura). Gli psicrotrofici hanno valori di Q₁₀ più bassi quindi al diminuire delle temperature continuano a crescere anche se lentamente.
• Tolleranza al cold shock (shock da basse temperature) che deriva da una maggiore resistenza delle proteine al danneggiamento causato dalle basse temperature.
• Sintesi di elevate concentrazioni di sostanze polisaccaridiche cioè carboidrati complessi generalmente dall'aspetto mucillaginoso che sono in grado di sintetizzare in grande quantità e conferiscono protezione alle basse temperature.
• Produzione di pigmenti cioè molecole in grado di comprendere alcune sostanze nutritive aumentandone la biodisponibilità all'abbassarsi delle temperature.
• Utilizzazione di un grande numero di substrati differenti.

Caratteristiche dei microrganismi termofili

• Presentano enzimi termoresistenti, enzimi la cui struttura permette una resistenza alla denaturazione (presenza di aminoacidi idrofobici che aumentano la termostabilità; per esempio la TAC polimerasi).
• Presenza di ribosomi termostabili per la sintesi di proteine.
• Maggiore esigenza di ossigeno e sostanze nutritive.
• Membrana nella quale gli acidi grassi saturi sono particolarmente abbondanti (decremento degli insaturi).

pH

Possiamo distinguere i tre valori di pH:

• pH minimo: oltre il quale la velocità di crescita è zero;
• Optimum di pH: massima velocità di crescita;
• pH massimo: oltre il quale la velocità di crescita è zero.

Possiamo distinguere in base agli optima di pH dei microrganismi tre gruppi:

• Microrganismi acidofili: optimum 3-4
• Microrganismi neutrofili: optimum 7
• Microrganismi basofili o alcalofili: optimum superiore a 8; tra questi ci sono anche gli aloalcalofili che necessitano anche di elevate concentrazioni saline.

Il pH è riferito alla matrice, infatti il pH citoplasmatico è intorno alla neutralità in tutti i gruppi. Quindi cambia l'efficienza a difendersi dalle concentrazioni idrogenioniche presenti nella matrice alimentare impedendo l'acidificazione del citoplasma. Ciò è legato all'efficienza delle pompe protoniche.

Sono anche in grado di deviare i loro processi metabolici: se producono un metabolita acido, in condizioni particolarmente acide deviano il metabolismo verso un altro prodotto finale (per esempio se normalmente produrrebbero acido butirrico, deviano il metabolismo verso la produzione di butanolo).

Altra possibilità di adattamento è la capacità di modificare alcuni composti citoplasmatici; per esempio la decarbossilazione degli amminoacidi con la formazione di ammine per far alzare il pH.

Facendo riferimento alle matrici alimentari nella maggior parte dei casi si fa riferimento a matrici acide o subacide (cioè con pH inferiore a 6, per esempio il mosto di uva è tra 3,2-3,5). Quindi avremo a che fare con microrganismi acidofili.

Tra i microrganismi le muffe presentano la maggiore capacità di adattamento: troviamo specie che possono crescere da pH intorno allo 0 fino a pH intorno a 11; ciò significa che il pH non può essere un metodo di controllo. Un intervallo un po’ più stretto ma comunque grande hanno i lieviti, da pH 2 a pH 8. La quasi totalità dei batteri sono neutrofili e difficilmente troviamo batteri in grado di svilupparsi a pH inferiore a 4. Tutti i batteri patogeni non crescono con pH inferiore a 4, ma solo due gruppi di batteri possono svilupparsi a pH 4 e hanno grande importanza: i batteri acetici e i batteri lattici. Batteri acetici e lattici possono essere positivi o alteranti ma mai patogeni (nel vino sono alteranti, nello yoghurt sono positivi, nel latte sono alteranti).

Acqua

Non si fa mai riferimento all'umidità in una matrice alimentare (relativamente alla velocità crescita). Il parametro di interesse è l'attività dell'acqua (water activity). L’acqua è necessaria essendo il veicolo delle sostanze nutritive verso il citoplasma e dei metaboliti all’esterno, ovvero è il vettore di tutti i trasporti. Generalmente si ha una certa concentrazione di soluti nel citoplasma che consente il richiamo dell'acqua all'interno della cellula creando una pressione idrostatica sulla membrana che è controbilanciata dalla presenza della parete. Se la concentrazione in soluti della matrice aumenta, nello spazio citoplasmatico può causare un’uscita di acqua provocando disidratazione della cellula la quale muore andando incontro a osmolisi (contrario di plasmolisi).

L’attività dell’acqua è pari al rapporto tra la pressione di vapore della matrice considerata e quella dell'acqua pura. I valori sono compresi tra 0 e 1. Sarà 1 nel caso dell’acqua pura, ma se nell’acqua sono solubilizzate sostanze osmoticamente attive il valore tenderà a 0 all'aumentare della loro concentrazione. Questo valore ci permette di calcolare con precisione il parametro sperimentale della effettiva disponibilità di acqua per il microrganismo. Infatti, esistono matrici con elevate concentrazioni di soluti che rendono l’acqua indisponibile per il microrganismo. Distinguiamo infatti:

• Acqua indisponibile: perché adsorbita (trattenuta) dai soluti (aumenta con l'aumentare dei soluti);
• Acqua libera: effettivamente disponibile per le attività metaboliche del microrganismo.

Per esempio, le confetture hanno elevate quantità di acqua ma la concentrazione di zuccheri è talmente elevata da non avere acqua libera. Quindi il valore di attività dell'acqua in una marmellata sarà basso, ma non la sua umidità. Il valore di acqua libera si abbassa con la disidratazione (pomodoro secco) o aggiungendo alla matrice dei soluti (sale e zuccheri); per questo, per esempio, il panettone si conserva molto meglio rispetto al pane (per la maggiore concentrazione degli zuccheri).

I valori di attività dell'acqua di una matrice si studiano attraverso le curve isoterme le quali vengono ottenute a temperatura costante. Avremo sulle ascisse valori di attività dell'acqua tra 0 e 1 e sulle ordinate la % di acqua. Per una medesima matrice avremo l'isoterma di assorbimento e l'isoterma di desorbimento le quali non si sovrappongono pur avendo un andamento simile. L’isoterma di assorbimento (A) si ottiene partendo dalla matrice secca e si aggiunge acqua: l'incremento di acqua non è direttamente proporzionale all'attività dell'acqua ma ha un andamento ad esse. La prima acqua aggiunta sarà quella adsorbita dai soluti e quindi non libera. Se abbiamo poca concentrazione di soluti questo tratto sarà più corto. L'isoterma di desorbimento (B) viene ottenuta partendo da una matrice completamente idratata alla quale viene sottratta l'acqua.

Valori di a_w in alcuni alimenti

• > 0,98: carne e pesce fresco, frutta fresca e vegetali, latte ed altre bevande
• Tra 0,93-0,98: pane, insaccati, latte concentrato, carne cotta, formaggi
• Tra 0,85-0,93: carne essiccata, formaggi a lunga maturazione, prosciutto crudo
• Tra 0,60-0,85: frutta secca, cereali
• Inferiore a 0,60: confetture, biscotti, cioccolato

I microrganismi crescono in modo ottimale con valori di attività dell'acqua superiori a 0,95.

• Maggior parte dei batteri alteranti (optimum 0,9) cominciano ad avere difficoltà con valori inferiori a 0,9.
• Maggior parte dei lieviti alteranti (optimum 0,88) non cresce a valori inferiori a 0,85.
• Maggior parte delle muffe alteranti (optimum 0,80) non cresce a valori inferiori a 0,80. Quindi le muffe riescono a crescere anche a bassi livelli di attività dell'acqua.

Ci sono microrganismi adattati a crescere a bassi valori di pH per questi gruppi. In particolare:

• Lieviti osmofili e muffe xerofile con optimum fino a valori di attività dell'acqua pari a 0,6.
• Batteri alofili fino a 0,75. A bassi valori di a_w c’è solo un batterio che riesce a crescere ed è Staphylococcus Aureus.

I microrganismi che possono resistere a bassi valori di a_w presentano dei meccanismi di adattamento. Consistono nella possibilità di accumulare a livello citoplasmatico elevate concentrazioni di sostanze osmoticamente attive (concentrazione osmotica interna superiore a quella esterna). Non è possibile l'accumulo di un qualsiasi soluto. La sostanza che un microrganismo accumula non deve risultare tossica per lo stesso. Si parla quindi di accumulo di soluti compatibili con il metabolismo microbico.

All'interno del mondo microbico ci sono diversi soluti di questo tipo: derivati amminoacidici come la glicina betaina (una molecola di glicina in cui i residui idrogeno sono sostituiti da gruppi metilici i quali conferiscono grande capacità osmotica), carboidrati come il saccarosio o il trealosio, polialcoli (più gruppi OH) come il glicerolo o il mannitolo. I soluti compatibili possono essere o traslocati dall'esterno verso l'interno se presenti nella matrice o possono essere sintetizzati ex novo nel momento in cui compare lo stress osmotico. In entrambi i casi il meccanismo di difesa prevede il coinvolgimento di proteine, in un caso sono proteine di trasporto, nel secondo caso sono enzimi necessari alla sintesi del composto. L'attivazione del meccanismo dipende da alcune molecole di membrana chiamate sensori che percepiscono i cambiamenti di turgore della membrana stessa.

Potenziale ossido riduttivo

Il potenziale ossido riduttivo di una matrice è descritto dall'equazione di Nernst:

E = E₀ + (RT/mF) ln([Ossidante]/[Riducente])

Il rapporto tra la concentrazione delle specie chimiche ossidanti e quella delle specie chimiche riducenti. La specie ossidante più importante nei substrati che analizziamo è l'ossigeno, motivo per il quale si parla di influenza dell'ossigeno sulla crescita microbica (anche se dovremmo parlare di potenziale redox). Il potenziale ossido riduttivo di un alimento dipende da:

• Accesso dell’ossigeno sulla superficie dell'alimento (la carne macinata, per esempio, è più soggetta allo sviluppo di microrganismi rispetto al pezzo di carne intero, stessa matrice ma maggiore esposizione all'atmosfera).
• Presenza di composti riducenti (negli alimenti ci sono composti riducenti: sostanzialmente gli zuccheri ma anche aminoacidi, specialmente gli aminoacidi solforati).
• Resistenza intrinseca all’alimento ai cambiamenti di potenziale: a seconda delle caratteristiche della matrice l’alimento può reagire in modo differente ai cambiamenti di potenziale, ci sono matrici che tamponano l'effetto riducente.
• Trattamenti tecnologici del processo di trasformazione: impastamento ad elevata velocità consente di inglobare molta aria e influenzare la crescita microbica, la filtrazione, i travasi, la cottura (portano all'allontanamento dei gas).
• Tensione di ossigeno dell'atmosfera a ridosso dell'alimento.