Appunti microbiologia industriale

Microbiologia industriale 1CM

Evoluzione scientifica (capitolo 1)

Le biotecnologie hanno origini antichissime: nel settore alimentare sono sempre avvenute elaborazioni spontanee di materie prime alimentari da parte di microrganismi ambientali. Esempi: fermentazione del succo d'uva, produzione di aceto, tipi di latte fermentato (yogurt e Kefyr), produzione di formaggi, fermentazione di ortaggi (crauti)…

Nel tempo siamo stati in grado di identificare i responsabili dei processi fermentativi che avvenivano spontaneamente. Le conoscenze acquisite hanno convertito le biotecnologie classiche da tecnologie sfruttate passivamente a sistemi di trasformazione pilotati e controllati.

Infatti nella seconda metà del XVII secolo con l’invenzione del microscopio è nata la possibilità di riconoscere i microrganismi; le biotecnologie si sono sempre evolute. La moderna microbiologia industriale deriva dall’applicazione di agenti microbici selezionati per specifiche esigenze di processo.

Principali tappe biotecnologiche

• 4000 a.C. Lievitazione del pane e produzione del vino (Egiziani), produzione di birra e formaggi (Egiziani, Sumeri e Babilonesi), produzione di aceto da bevande fermentate (Egiziani Assiri e Babilonesi).
• 1663 Prima osservazione microscopica e nascita del termine cellula (R. Hooke).
• 1781 Produzione di lievito per panificazione (Dutch process, Olanda).
• 1881 Produzione di acido lattico.
• 1185-90 Sviluppo dei primi vaccini (colera, difterite e tetano).
• 1928-29 Scoperta della penicillina (A. Fleming) | Antibiotico: molecola in grado di uccidere uno o più microrganismi.
• 1953 Prima descrizione della struttura del DNA (J. Watson e F. Crick).
• 1972-1973 Nascita della tecnologia del DNA ricombinante (S. Cohen e H. Boyer).

Le biotecnologie microbiche trovano applicazione nella microbiologia industriale.

La biotecnologia è l’applicazione deliberata e controllata di agenti biologici semplici, quali cellule microbiche, vegetali, animali, vive o morte, o componenti cellulari, in operazioni tecnologiche utili, al fine di produrre sia beni che servizi.

Inoltre la biotecnologia: in senso stretto è considerata un’attività relativa alla biologia molecolare, mentre in senso lato è associata alle operazioni di biologia applicata a diversi settori (non solo molecolare).

È largamente impiegata nella produzione industriale di beni. I beni sono oggetti materiali acquistabili sul mercato, e tra questi troviamo:

• Biomasse microbiche per nutrizione animale e umana;
• Commodities chimiche (acido citrico, acido glutammico, alcuni aminoacidi);
• Specialità (antibiotici, vitamine);
• Probiotici (microrganismi colonizzanti l’intestino) e vaccini;
• Starters, enzimi (agenti chiave della moderna tecnologia alimentare);
• Inoculanti del suolo (azoto fissatori) e delle piante (lotta biologica).

Abbiamo anche detto che la biotecnologia fornisce servizi, tra i quali:

• Trattamento di rifiuti liquidi e solidi: ad esempio la depurazione delle acque di scarico o la potabilizzazione (purificazione) dell’acqua;
• Valorizzazione di residui agro-industriali: i microrganismi ci aiutano a rendere riutilizzabili i materiali industriali di scarto;

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• Diagnostica mirata (anticorpi monoclonali) e terapia mirata (anticorpi monoclonali come carriers di farmaci).

Tra le varie discipline scientifiche e tecnologiche (microbiologia, biochimica, genetica, ingegneria meccanica, chimica, finanza…) esistono una serie di connessioni che ci permettono di mettere a punto un processo biotecnologico. Quest’ultimo consiste in 4 fasi:

1. Riconoscimento dei microrganismi.
2. Studio del substrato sul quale è in grado di agire il microrganismo.
3. Studio delle reazioni che avvengono durante l’azione del microrganismo.
4. Utilizzo delle tecnologie adatte.

Fermentazione

Dal punto di vista storico la fermentazione era definita come un processo microbico di trasformazione di zucchero in etanolo e anidride carbonica. Dal 1945 invece è stata scoperta e studiata, e quindi definita, in senso lato, come un processo che utilizza un microrganismo (indipendentemente dalle condizioni, sia in aerobiosi sia in anaerobiosi). In senso stretto invece le vere fermentazioni sono quelle che avvengono in assenza di ossigeno, ovvero in condizioni anaerobie, e tra queste distinguiamo: la fermentazione lattica, propionica, butirrica…

Processo biotecnologico

Il processo biotecnologico è un processo in cui, ad un substrato (S) vengono aggiunte delle cellule microbiche (X) che crescono e tramite una fermentazione producono: cellule (lieviti da pane), metaboliti primari (ac. lattico), metaboliti secondari (antibiotici), enzimi (lattasi) e/o prodotti di biotrasformazione, ovvero il prodotto (P).

S + X P

X: le cellule microbiche

Le fermentazioni tradizionali vengono allestite (e in alcuni casi lo sono tuttora) impiegando una popolazione mista presente nelle materie prime o in ambienti particolari (ad. es. alimenti fermentati e bevande alcoliche).

Nello sviluppo di processi su larga scala invece vengono impiegate colture pure ovvero costituite da singoli ceppi ottenuti con una procedura di isolamento a partire da habitat naturale.

Nell’ingegneria genetica vengono fatti anche processi che prevedono l’impiego di microrganismi ricombinati, ovvero microrganismi ai quali è stato iniettato del DNA diverso dal loro.

In ambito alimentare si utilizzano solo microrganismi GRAS (Generally Recognized As Safe), cioè sicuri, che hanno nel loro albero genealogico solo microrganismi che non producono tossine e non patogeni.

Si trovano nelle collezioni ufficiali cioè Istituzioni che rappresentano un punto di riferimento ed hanno il compito di mantenere i ceppi esistenti, raccoglierne di nuovi e distribuire su richiesta i ceppi puri (possono anche fungere da riferimento - ceppi type).

I microrganismi si possono raccogliere anche in natura ma non è un metodo sicuro e affidabile.

S: il substrato

Il substrato, o terreno di coltura, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di un processo fermentativo per questo motivo i suoi componenti vengono selezionati in base alle esigenze del microrganismo e in base all’economicità (utilizzando possibilmente scarti di altre attività come i residui agro-alimentari industriali o surplus agricoli, in ogni caso si parla di materie grezze).

I fattori da considerare nella scelta del substrato sono:

• Costo e disponibilità.
• Facilità di trasporto e stoccaggio (conservazione).
• Sterilità: deve essere sterile per assicurarsi che in coltura non siano presenti microrganismi diversi da quelli che andrò a inoculare.

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• Deve essere ininfluente nei riflessi delle variabili di fermentazione (aerazione, agitazione e controllo della schiuma).
• Deve assicurare alte rese di conversione e fermentazione.
• Minima formazione di prodotti secondari.
• Assenza di problemi di tipo igienico-sanitario (tossicità) o di sicurezza (infiammabilità, esplosività).

P: il prodotto

Costituisce ciò che viene prodotto durante il processo fermentativo.

Lo sviluppo di un processo fermentativo dipende dalle conoscenze scientifiche, associate alle richieste del mercato.

L’economicità è influenzata dalla resa associata alla procedura di isolamento e purificazione, in relazione al valore del prodotto.

Abbiamo detto prima che il prodotto può essere di diversi tipi:

• Metaboliti primari: vengono prodotti sempre e sono essenziali allo sviluppo del microrganismo, per la vita e la riproduzione della cellula microbica. Esempi: acido lattico. Sono metaboliti di degradazione isolabili, finali o intermedi del metabolismo energetico che vengono espulsi dalla cellula.
• Metaboliti secondari: vengono prodotti nella fase finale di crescita esponenziale del microrganismo, spesso per un cambiamento delle condizioni ambientali e si accumulano in fase avanzata dello sviluppo; non sono essenziali per lo sviluppo e la riproduzione della cellula. Esempio: Penicillina. Possono avere ruolo metabolico definito o non rilevabile; spesso si formano per modificazione di metaboliti primari o intermedi. Infine possono essere anche antinutrizionali, immunosoppressivi (attività di abbassamento delle difese immunitarie), anticolesterolo (statine: importanti in ambito alimentare).

I prodotti della microbiologia industriale in dettaglio

Otteniamo prodotti considerabili come biomasse microbiche. Le biomasse microbiche possono essere classificate secondo vari aspetti…

In funzione del contenuto le biomasse hanno un impiego:

• Integrale - tra le quali abbiamo:
  • I funghi superiori commestibili.
  • Le biomasse per dietetica.
  • Le alghe.
  • Le biomasse proteiche per mangimistica.
• Per estrazione – ed alcuni esempi sono:
  • I lisati di lieviti.
  • Gli estratti proteico-vitaminici.
  • I lipidi.
  • Gli enzimi.
  • RNA e derivati.

In funzione della loro attività vengono invece classificati nel seguente modo:

• Substrati o ambienti complessi – come:
  • Il lievito per panificazione.
  • Starters.
  • Fermenti lattici.
  • Colture azotofissatrici.
  • Colture insetticide.
  • Vaccini.
  • Colture per fanghi attivi.
• Molecole particolari: le biomasse impiegabili in biotrasformazioni.

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Metaboliti primari

Sono metaboliti di degradazione isolabili: prodotti finali o intermedi del metabolismo energetico (fermentativo od ossidativo) che vengono riversati nel terreno colturale, ove si accumulano e da cui vengono estratti. Derivano dalla degradazione del substrato fonte di carbonio ed energia (ad es. un carboidrato) presente in elevata concentrazione.

Esempi: acidi organici (lattico, butirrico, propionico, acetico, citrico, fumarico...), amminoacidi e loro intermedi (acido glutammico, lisina...), alcoli (etanolo), polialcoli (glicerolo, mannitolo...), carboidrati, vitamine, nucleotidi ed acidi nucleici, lipidi, proteine...

Metaboliti secondari

Costituiscono una classe conosciuta anche come prodotti di biosintesi.

Possono avere un ruolo metabolico definito (o comunque individuabile) anche se talvolta il ruolo è secondario o non precisabile.

Esistono punti di interconnessione tra metabolismo primario e secondario.

I metaboliti secondari vengono generalmente prodotti a partire dai metaboliti primari o loro intermedi, che fungono quindi da precursori.

I metaboliti di particolare importanza nell’ambito della microbiologia industriale sono stati oggetto di sviluppo di numerosi processi su larga scala.

Prodotti complessi

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Sono associabili al settore alimentare. Sono prodotti non isolabili perché costituiti dall’insieme del substrato trasformato contenente gli stessi microrganismi responsabili della modificazione. Es: nello yogurt non è possibile isolare i batteri lattici aggiunti al latte per ottenere lo yogurt stesso.

Esempi di prodotti complessi ottenibili per intervento microbico:

• Preparazioni alimentari: bevande alcoliche, aceto, tipi di latte fermentato, prodotti caseari, cibi orientali fermentati;
• Conservazioni alimentari: vegetali fermentati (crauti, olive...), foraggi insilati, stagionatura di carni insaccate;
• Lavorazioni diverse: macerazione di fibre tessili (canapa, lino, juta), trattamento di rifiuti liquidi e solidi.

Prodotti da DNA ricombinante

Viene inserito nella cellula una sequenza di aa, il microrganismo li riconosce e diventa così codificatore per un maggior numero di proteine. Sono di difficile classificazione in relazione all’eterogeneità.

Esempi: Microrganismo Prodotto

Le diverse forme di resa (capitolo 4)

Impo per esame: sapere la differenza fra le due forme di resa.

Resa di conversione (Y)

Y = Prodotto formato (g) / Substrato consumato (g) = 0>Y>1

Quanto più elevato è il valore della resa di conversione, tanto maggiore è la quota di substrato convertito in prodotto.

• Più Y è un numero che si avvicina a 1 gran parte del substrato consumato è stato convertito in prodotto: buona resa di conversione.
• Più Y tende a 0 bassa resa di conversione.

È un numero adimensionale.

Resa di fermentazione

Esprime quanti grammi g di prodotto (espresso in peso secco) si ottengono da ogni litro di coltura (coltura liquida = brodocoltura).

Resa di fermentazione = g/L (ha l’unità di misura!!)

Rese relative alle diverse classi di prodotti

Biomasse microbiche

Resa di conversione (Y):

• Per substrati carboidratici la resa Y è dell’ordine di 0,5: si forma circa metà prodotto (in g) rispetto ai grammi di substrato consumati. Il restante 0,5 delle sostanze viene utilizzato per altre funzioni.

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Per substrati in stato ridotto (ad esempio le n-paraffine che hanno la catena lineare: CH3-CH2-CH2-…-CH3), Y può raggiungere il valore 1.

Resa di fermentazione:

• È variabile: 20 g/L > R.F. > 40 g/L. Può raggiungere un massimo di 60 g/L per il processo industriale di produzione di lievito per panificazione (Saccharomyces cerevisae).

Prodotti complessi

Sono prodotti in gran parte appartenenti al settore alimentare.

La resa di conversione Y e la resa di fermentazione non sono generalmente determinabili perché sono noti i g di substrato consumato ma non è possibile definire i g di prodotto.

Composizione dei terreni colturali (capitolo 4)

Il terreno colturale deve fornire al microrganismo tutte le sostanze nutritive necessarie alla crescita, alla produzione di energia e alla biosintesi dei metaboliti desiderati. Sono per il 90% liquide: sono composti da qualcosa disciolto in acqua.

Il terreno colturale deve contenere tutti i nutrienti opportuni, che sono: fonti di carbonio, fonti di azoto, sali inorganici, vitamine o altri fattori di crescita ed eventuali precursori.

I terreni colturali possono essere suddivisi in: domanda d’esame: tipi di terreni e differenze fra sintetici e complessi.

• Terreni sintetici:
  • Costituiti da materie prime chimicamente pure, quindi costosi.
  • Impiegati generalmente a livello di laboratorio.
  • Di più facile standardizzazione qualitativa e quantitativa.
  • In genere forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti limitate (minori).
• Terreni complessi:
  • Contenenti materie prime grezze.
  • Utilizzati su larga scala.
  • Limitata standardizzazione qualitativa e quantitativa.
  • Più economici rispetto a quelli sintetici.
  • In genere forniscono crescita microbica e produzione di metaboliti elevate (maggiori).

Principali differenze tra terreni sintetici e terreni complessi

I terreni sintetici sono costituiti da componenti puri e noti, per questo sono costosi e utilizzati su piccola scala, in laboratorio (pochi litri); sono di facile standardizzazione e praticamente sempre riproducibili (vengono formulati facilmente come fare una torta seguendo una ricetta). Le rese però sono basse.

I terreni complessi invece sono costituiti da componenti grezzi (es: melasso come fonte di C) e quindi molto meno costosi. Di conseguenza vengono utilizzati su larga scala, nelle aziende, per produrre prodotti nell’ordine dei metri cubi. Un altro aspetto positivo è che essendo naturali, di composizione leggermente variabile, oltre che a contenere la fonte di C, ad esempio, contengono anche vitamine e altri precursori; le vitamine sono molto costose, infatti questo è un super vantaggio dal punto di vista economico (che non abbiamo nei terreni sintetici). Purtroppo sono di difficile standardizzazione, di difficile purificazione, la formazione di schiume è maggiore (a differenza dei sintetici) e non sempre si riesce a riprodurre lo stesso terreno identico (infatti per renderlo più uniforme si miscelano i vari lotti di substrato). Al contrario le rese sono più elevate.

Fattori da considerare nella messa a punto di un terreno colturale per un processo industriale

• Considerazioni legate al metabolismo microbico:
  1. La resa di conversione Prodotto/Substrato deve essere massima.
  2. La resa di fermentazione (g/L) deve essere massima.
  3. La velocità di formazione del prodotto deve essere massima e quindi il tempo deve essere il più basso possibile.

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4. La formazione di prodotti secondari indesiderati deve essere, ovviamente, minima.

• Deve esserci la possibilità di avere un rifornimento costante nel tempo delle materie prime.
• Si devono tenere in considerazione gli eventuali inconvenienti tecnologici legati alle materie prime (aerazione, agitazione – schiuma; estrazione e purificazione prodotto…).
• I costi devono essere più contenuti possibile (l’economicità è fondamentale).

Fonti di carbonio

Le fonti di carbonio possono essere classificate secondo diversi criteri.

Il primo metodo si basa sull’origine e quindi sulla rinnovabilità delle fonti, esistono:

• Fonti rinnovabili (di origine naturale): la CO2 è la più semplice, rinnovabile e disponibile fonte di carbonio;
• Fonti non rinnovabili (di origine petrolchimica): alcoli a corta catena (alcani) che provengono dalla lavorazione del petrolio o del gas naturale.

Il secondo è il più utilizzato e si basa sulla loro natura chimica, troviamo fonti carboidratiche e fonti non carboidratiche.

Fonti carboidratiche: a loro volta si dividono in:

• In forma pura: vengono usate fonti più o meno complesse. Tra i monosaccaridi che sono i più semplici usiamo prevalentemente glucosio (sotto forma di sciroppo proveniente da idrolizzati di amido), tra i disaccaridici sono il sa