Appunti di Microbiologia

Microbiologia prof. Mastromei - Lezione 5

Capsula

La capsula è il rivestimento più esterno, molto spesso in molti casi. Non è indispensabile per la cellula; nell’immagine il colorante colora solo la capsula senza entrare nella cellula. Di cosa è fatta? Da polimeri di glucidi (zuccheri) o amminoacidi, ad esempio Leuconostoc presenta colonie differenti nei terreni con glucosio e saccarosio. Nel saccarosio abbiamo la capsula e quindi colonie mucillaginose e abbastanza grandi, a sinistra invece, dato che è presente solo glucosio, la cellula deve fare una scelta: o per il metabolismo o per la formazione della capsula. Quindi in questo caso la cellula utilizza il glucosio per il suo metabolismo e non forma la capsula. Da vicino, inoltre, le colonie sono rugose e non lisce come nel saccarosio.

Quando un microrganismo cerca di invadere il corpo di un altro, si scatena una reazione immunitaria in quest’ultimo; la presenza della capsula rallenta la risposta immunitaria. Siccome le prime fasi di una malattia sono un gioco tra chi arriva prima, tra il patogeno o anticorpi, in microrganismi capsulati spesso la capsula è segno di patogenicità dello stesso.

Parete

La parete è presente nella maggior parte dei procarioti, bacteria ed archea, ed è fondamentale per la sopravvivenza. Ci sono microrganismi senza parete che però devono sopperire alla sua mancanza. La parete è un guscio rigido, non è un filtro, non bisogna confondere la funzione della parete con quella della membrana.

Se trattiamo la parete con un enzima, il lisozima, che degrada la parete in soluzione, in un ambiente ipotonico quello che succede è che la cellula continua a richiamare acqua, si gonfia e scoppia. Se si esegue lo stesso procedimento ma in condizioni isotoniche, non c'è pressione osmotica quindi la cellula non scoppia, ma viene rilasciata una cellula priva di parete chiamata protoplasto, che è una cellula vitale; in laboratorio con alcuni accorgimenti può rigenerare la parete. Questo esperimento dimostra che, dato che gli organismi quasi sempre vivono in ambienti ipotonici, la parete è estremamente utile poiché impedisce alla cellula di dilatarsi e quindi di non acquisire troppa acqua. L’enzima lisozima si trova nella saliva e nelle lacrime; a livello dell’occhio non ci sono difese immunitarie per questo la sua presenza è importante. Infatti nei trapianti di cornea non c’è rischio di rigetto nella stragrande maggioranza dei casi.

Costituenti della parete: peptidoglicano (mureina) costituito da una parte glucidica ed un'altra amminoacidica, in particolare NAG (N-acetilglucosammina) e NAM (N-acetilmuramico). Gli amminoacidi sono anche nella forma D e per ottenere questi amminoacidi si deve impiegare un enzima che è la racemasi. Alcuni amminoacidi della sintesi proteica vengono sequestrati e convertiti nella forma D per costituire la NAM.

NAM e NAG sono legati in modo lineare; in corrispondenza del NAM sono legati 5 amminoacidi, le prime tre posizioni sono variabili, ma in posizione 4 e 5 troviamo sempre la D-alanina. Mureina nei batteri gram negativi: NAM è verde, NAG è rosso, i cerchietti blu sono gli amminoacidi. Abbiamo un legame peptidico diretto che collega l’amminoacido di una catena con l’amminoacido della catena adiacente.

Mureina nei batteri gram positivi: in questo caso abbiamo 5 glicine che collegano l’amminoacido in posizione 3 della catena con l’amminoacido in posizione 4 della catena adiacente; il legame peptidico è accompagnato da un ponte interpeptidico (quindi non è detto che ci siano 5 glicine). Quindi il legame diretto è tipico dei batteri gram negativi, nei gram positivi solitamente il ponte che collega gli amminoacidi varia tra i vari microrganismi.

Sito di azione del lisozima

Rompe i legami della catena polisaccaridica, rompendo il legame tra NAM e NAG.

Biosintesi della mureina

Nucleotide di Park, catena pentapeptidica legata al NAM e all’uridina tramite due legami fosforici. Park notò l’accumulo di questo nucleotide nel processo di biosintesi della mureina essendo esso un intermedio. Fruttosio-6-P viene trasformato in glucosamina-6-p, l’acetil coenzima A dona il gruppo acetilico e abbiamo la formazione della NAG-6-P. Il gruppo P passa dalla posizione 6 alla 1 e successivamente l’attacco dell’uridin difosfato alla N-acetil-glucosamina ottiene UDP-NAG. Alla fine l’UDP-NAG viene trasformato in UDP-NAM. Si è formata quindi una parte del nucleotide di Park poiché manca la catena amminoacidica. Quindi ad esempio L-alanina viene attaccata con l’utilizzo di un ATP, l’acido L-glutammico viene trasformato in D-glutammico e poi attaccato, viene legata anche la L-lisina ed infine da 2-L-alanina si forma un dimero di Ala-D-Ala con l’utilizzo di 2 molecole di ATP. Il nucleotide di Park a questo punto si è formato, UDP-NAM pentapeptide. La molecola dovrà attraversare la membrana; al nucleotide di Park viene legata una molecola di bactoprenolo ottenendo pentapeptide-NAM-P-P-bactoprenolo. A questo punto l’UDP NAG viene addizionato alla molecola formando NAM-NAG(pentapeptide)-P-P-bactoprenolo. Abbiamo ora 5 glicil t-rna, le 5 glicine si legano all’amminoacido in posizione 3 rilasciando il t-rna. A questo punto entra in gioco il bactoprenolo che con due gruppi P fornisce l’energia necessaria per il legame della mureina al NAG. Il bactoprenolo è un trasportatore ciclico, portando fuori la mureina e tornando all’interno della cellula in forma difosfata.

Meccanismo d’azione della transpeptidasi: forma un legame peptidico tramite la scissione della D-alanina in posizione 5, questo è il motivo per cui durante la biosintesi abbiamo una catena di 5 amminoacidi legati al NAM e alla fine del processo ne abbiamo 4.

Gram positivi vs gram negativi

In linea generale la parete nei batteri gram positivi è molto più spessa rispetto ai gram negativi. Senza mureina non c’è rigidità, ma sono importanti anche altri componenti come lipopolisaccaridi, lipidi soprattutto nei gram negativi. Il peptidoglicano è più abbondante nei gram positivi. Il fatto di avere meno peptidoglicano non vuol dire che la parete dei gram negativi sia meno robusta dei gram positivi, sono entrambe abbastanza resistenti per un ambiente ipotonico.

• Parete gram positivi
• Parete gram negativi

I gram negativi presentano una membrana esterna (verde) costituita da lipopolisaccaridi e fa in modo che si crei uno spazio periplasmatico (azzurro) assente o presente in minoranza nei gram positivi. Lo spazio periplasmatico è importante; per attaccare macromolecole è più facile secernere enzimi che importare il substrato all’interno della cellula. Tuttavia, l’enzima secreto diminuisce la sua concentrazione mano a mano che si allontana dalla cellula ed inoltre c’è il rischio che il prodotto della degradazione enzimatica venga utilizzato da qualche altro organismo, quindi la membrana esterna permette l’entrata del substrato (molto più facile rispetto alla membrana citoplasmatica) in un’area intermedia tra citoplasma e ambiente esterno ovvero il periplasma.

Acidi teicoici: Con il termine acidi teicoici si indicano tutti i polimeri della parete, della membrana e della capsula contenenti residui di glicerolfosfato e ribitolfosfato. Gli acidi teicoici sono tipici dei batteri Gram-positivi.

Parete gram positivi

Composta da uno strato esterno di peptidoglicano che aderisce alla parte esterna della membrana citoplasmatica, al di sopra osserviamo acidi teicoici, acidi lipoteicoici e proteine associate di membrana.

Parete gram negativi

Composta da una sezione di peptidoglicani che danno rigidità e dalla membrana esterna con minore permeabilità rispetto alla membrana citoplasmatica. Sulla superficie esterna della membrana esterna i polisaccaridi sono legati a lipidi (cubetti gialli); queste catene sono la parte più sporgente della cellula ed in molti casi ne permettono il riconoscimento. Sono presenti anche condotti che permettono il collegamento tra ambiente esterno e spazio periplasmatico, costituiti da proteine chiamate porine che si dispongono a formare cerchi quindi condotti quando si sovrappongono. Non hanno il compito della membrana plasmatica di selezionare gli agenti di entrata ed uscita.

Archea pseudomureina

NAT (acido N-acetiltalosaminuroico), legame tra NAG e NAT avviene con un legame beta 1-3 glicosidico.

Membrana citoplasmatica

Propria di tutte le cellule, è un sistema di separazione, decide chi può entrare e chi può uscire. Abbiamo una regione idrofila superiore e inferiore, una sezione interna formata da acidi grassi idrofobica. Il doppio strato fosfolipidico è accompagnato da proteine di membrana che mettono a contatto l’ambiente interno con quello esterno. Le proteine non sono ferme ma galleggiano in un mosaico fluido di fosfolipidi.

Membrana degli archea

Abbiamo sempre un glicerolo legato al fosfato tramite un legame etere; inoltre c’è ramificazione nella catena di phytanile (prime molecole ramificate apparse sulla terra). Perché viene prodotta una membrana monostrato? A destra si nota come le code dei lipidi siano continue. A livello degli archea ci sono organismi che crescono a temperature superiori a 100 gradi, la membrana monostrato funziona male a temperature anche di 70 gradi ma nelle condizioni in cui vivono i microrganismi ipertermofili ha una funzionalità ottimale.

Funzionalità principali della membrana

• Sito di ancoraggio di proteine
• Conservazione dell’energia della forza proton-motrice

Meccanismi di trasporto:

• Semplice, trasporto di molecole senza alcuna modifica tramite l’energia associata alla forza proton-motrice
• Traslocazione di gruppo, modificazione chimica della sostanza trasportata
• Sistema ABC, utilizza ATP e proteine di legame periplasmatiche

Eventi di trasporto

• Uniporter
• Antiporter
• Symporter

Un esempio classico di traslocazione di gruppo è il trasporto del glucosio. Il glucosio-6-P viene formato per inserire direttamente la molecola nella via metabolica ed impedirne l’espulsione.

Membrane fotosintetiche: fa in modo che gli organismi coinvolti nella fotosintesi risiedano in posizioni ben precise.

Separazione fisica: Formazione di strutture lamellari nei batteri fotosintetici; formazione del mesosoma. Il mesosoma forma il setto al momento della divisione e serve a ripartire il cromosoma nelle due cellule figlie.

Permeabilità: Regola l’ingresso di ioni e metaboliti all’interno della cellula, mantenendo una concentrazione superiore a quella esterna.

Lezione 6 - Nucleoide

Il nucleoide è il materiale genetico della cellula. Nell’immagine in rosso è colorato il DNA della cellula; notiamo come sia localizzato in una regione centrale. Cellula di Escherichia coli che ha rilasciato il proprio DNA; la cellula è stata trattata delicatamente in modo da far rilasciare all’esterno l’intero DNA senza rompersi. Capiamo quindi che la lunghezza del filamento di DNA è enorme rispetto alle dimensioni della cellula. In rapporto ad una cellula di qualche micron, il DNA raggiunge qualche millimetro, ne consegue che deve essere impacchettato per occupare poco spazio. Allo stesso tempo il DNA porta l’informazione genetica e questa deve essere fruibile e chiara; ci devono essere dei meccanismi che permettono di accedere all’informazione.

In questa immagine notiamo come il DNA (zona scura centrale) sia rinchiuso all’interno di una membrana, che ricalca quella nucleare. In realtà questo è un nucleo “finto” poiché è sempre di una cellula procariotica, ma visivamente è molto simile alle cellule eucariotiche.

DNA -> trascrizione -> RNA -> Proteine: poi si differenziano le loro funzionalità in anticorpi (difese), ormoni (proteine segnale, vedremo che anche nei procarioti ci sono dei sistemi di segnalazione per la comunicazione intercellulare), proteine strutturali (modifica della forma cellulare), enzimi. Questo è il flusso dell’informazione genetica che deve essere regolare e continuo; esiste anche un flusso inverso dove, in particolari situazioni, l’informazione va dall’RNA al DNA.

Gli acidi nucleici sono formati da nucleotidi composti da una base, uno zucchero ed un gruppo fosfato; le basi sono divise in basi pirimidiniche e puriniche, si ritrovano nel DNA e RNA ad eccezione di timina (DNA) ed uracile (RNA). Il DNA è una molecola a doppio filamento, con regole ben precise per quanto riguarda l’associazione delle basi e legami. I filamenti hanno un inizio, chiamato estremità 5’, ed una fine, estremità 3’; il filamento complementare avrà polarità opposta. Nell’RNA si ha un singolo filamento, sono molecole lineari, più corte e con l’uracile al posto della timina. In natura, all’interno della cellula, è difficile trovare l’RNA nella forma distesa, in quanto se trova sequenze complementari tra loro forma regioni d’appaiamento tra le basi e quindi strutture secondarie; queste hanno ruoli importanti all’interno della cellula.

• MRNA: porta il messaggio per la sintesi proteica, l’informazione per mettere assieme gli amminoacidi
• TRNA: legge l’informazione del messaggero in modo da portare l’amminoacido corretto, consente il passaggio da sequenza amminoacidica
• RRNA: componente importante dei ribosomi

Molecola di DNA nella cellula

Replicazione: sfrutta la complementarietà delle basi; l’informazione su un’elica viene letta e viene sintetizzata l’elica complementare. Si otterranno quindi due nuove molecole di DNA.

Trascrizione: porta alla sintesi di una molecola di RNA, utilizza solo una delle due eliche. L’informazione viene letta a gruppi di tre, triplette o codoni, ognuno dei quali codifica per un amminoacido.

Procarioti

Nella cellula procariote tutto avviene nel citoplasma; questo è alla base della regolazione della cellula batterica. Le sequenze codificanti sono compattate e vicine tra loro nei procarioti. L’RNA polimerasi, quando effettua la trascrizione, forma un trascritto (mRNA) che porta l’informazione di più geni. Un messaggero che porta l’informazione di due, tre, quattro geni viene chiamato policistronico. La trascrizione e traduzione avvengono entrambe nel citoplasma, fondamentale nei batteri poiché non è necessario che un passaggio termini per far iniziare quello successivo.

Eucarioti

Il DNA è nel nucleo, la trascrizione avviene nel nucleo ma la traduzione avviene nel citoplasma, quindi sarà necessario più tempo. L’informazione genetica negli eucarioti è spezzata, ovvero sono presenti gli introni (sequenze non codificanti) che si intromettono nella sequenza degli esoni. Avviene quindi la trascrizione e successivamente c’è il fenomeno dello splicing con cui gli introni vengono rimossi e gli esoni legati assieme. A questo punto si ha il trasporto dell’mRNA nel citoplasma dove avviene la traduzione nella proteina. Per ogni mRNA si ha un gene. Questo processo crea dei problemi ai virus animali; il primo problema è che la cellula eucariote ha una divisione spaziale, compartimentazione, e in secondo luogo si formano mRNA policistronici virali. Inoltre, in questo caso occorre molto tempo poiché dall’attivazione del gene al suo prodotto si ha molta latenza, cosa che non avviene nei batteri.

Informazione genetica nei procarioti: le sequenze cromosomiche possono avere origini differenti, ad esempio informazioni fornite da virus che non serve a formare un nuovo virus, è stata incamerata nel genoma. Sono presenti anche frammenti di DNA plasmidico, quindi extracromosomico. Abbiamo anche i trasposoni o elementi mobili. Si ha una sorta di puzzle che va a comporre l’informazione genetica.

Superavvolgimento del DNA

Se si ha un taglio a singola elica si ha il fenomeno del rilassamento per cui il cerchio si apre. Questo fenomeno avviene facilmente in molecole di DNA circolari piccole, nelle molecole più grandi si creano delle anse stabilizzate dalla presenza di proteine, chiudendo questa regione si ha una lunghezza del DNA ben definita che permette il superavvolgimento. Quindi si ha il superavvolgimento di regioni e non dell’intero DNA. La compattazione del DNA avviene grazie a proteine chiamate istoni che permettono anche lo svolgimento delle regioni interessate quando il DNA deve essere letto. Nei procarioti ci sono proteine “histone-like” che svolgono funzioni simili alle proteine istoniche.

Per molti anni si è ritenuto che i procarioti avessero esclusivamente genomi circolari mentre negli eucarioti fossero tutti lineari. Negli eucarioti l’informazione genetica è suddivisa in più cromosomi, nei procarioti si pensava che ci fosse un solo cromosoma. Successivamente si sono scoperte cellule batteriche con informazione distribuita su più cromosomi. Le dimensioni sono esposte come Mb (milioni di paia di basi); possiamo dire che i batteri hanno avuto il tempo nel corso dell’evoluzione di affinare la capacità di compattare l’informazione in un unico cromosoma. Si conoscono batteri con genomi di 200-300 paia di basi, ovvero la dimensione di alcuni dei più grandi genomi virali. Si sta cercando di capire quindi qual è la dimensione minore possibile del genoma compatibile con la vita. All’estremo opposto si notano gli streptomiceti con un genoma di 8,66 Mb (genoma medio circa 4 Mb).