Appunti biochimica clinica

Biochimica clinica

La biochimica clinica si occupa dello studio:

• Delle alterazioni biochimiche di natura patologica misurabili nei fluidi biologici
• Dell'applicazione e dello sviluppo di tecniche analitiche su base chimica, strumentale ed immunochimica per effettuare determinazioni diagnostiche o di routine sui campioni biologici

Terminologia

• Anamnesi: la raccolta delle informazioni sul paziente
• Diagnosi: individuazione di una patologia
• Prognosi: previsione sul decorso e sull'esito di un quadro clinico
• Follow-up (catamnesi): fase di controllo continuo o periodico e programmato, raccolta di dati clinici dell’ammalato nel periodo successivo alla diagnosi e alla terapia
• Programma di screening: strategia sanitaria volta ad individuare un'eventuale malattia nelle sue fasi iniziali

Fase pre-analitica

Le richieste dell’esecuzione delle analisi possono essere indirizzate a:

• Controllo del mantenimento dello stato di salute
• Screening per la prevenzione di patologie
• Completamento diagnostico nel sospetto di una patologia
• Monitoraggio di una malattia durante trattamento farmacologico
• Nella gestione di uno stato di emergenza/urgenza
• Monitoraggio in fase pre- e post-operatoria

La richiesta al laboratorio degli esami di biochimica clinica deve contenere dove necessario:

• L’ipotesi diagnostica, motivazione della richiesta
• Ragguaglio su eventuali terapie in corso
• Ora in cui effettuare il prelievo
• Tipo di indagine (basale, test da carico, test di soppressione o stimolazione)

Preparazione del paziente

• Accertamento dell’identità
• Paziente riposato, a digiuno da almeno 6-8 ore
• Firma del consenso informato (per analisi genetiche, test HIV, rilevazione di droghe)
• Alimentazione del giorno precedente
• La postura (es. clinostatismo o ortostatismo nella valutazione di aldosterone)
• L’attività fisica (evitare sforzi fisici intensi nelle 12 ore precedenti)
• Stato di idratazione (evitare eccessiva sudorazione il giorno precedente)
• Accertamento sull’uso di farmaci

Il campione biologico

La scelta del campione biologico dipende dalle indagini da eseguire. I campioni più utilizzati sono:

• Sangue venoso per le indagini ematologiche e biochimico-acido-base
• Cliniche di routine
• Sangue arterioso per misurare i parametri dell’equilibrio
• Urine (campione della mattina, campione della raccolta delle 24 ore)

Altri esami possono essere effettuati su:

• Feci
• Fluido cerebrospinale (LCS o CSF o liquor o liquido cefalo-rachidiano)
• Biopsie di tessuto
• Materiale aspirato (liquido pleurico, asciti, fluido sinoviale, liquido amniotico)
• Calcoli
• Capello
• Saliva

La riduzione degli errori in fase pre-analitica prevede l’utilizzo di strumenti sterili (ad es. provette ed aghi monouso) e chimicamente inerti. Le etichette sulle provette devono:

• Non essere facilmente asportabili
• Permettere l’identificazione inequivocabile del paziente (nome, cognome, codice fiscale, codice a barre)
• Presentare almeno un doppio codice di identificazione (consigliato dalle linee guida internazionali)
• Rispettare la tempistica della processazione del campione

La raccolta del campione di sangue

• Prelievo venoso (di solito dalla vena mediana, davanti all’articolazione del gomito)
• Prelievo arterioso (dall’arteria radiale)
• Prelievo capillare (dal polpastrello)

Per le analisi biochimico cliniche sul sangue si utilizzano: sangue intero o eritrociti (per analisi ematocitometriche), leucociti (per analisi genetiche). Ricordando che il sangue è un tessuto fluido presente nell’essere umano e negli animali con apparato circolatorio. Presenta numerose funzioni tra cui il trasporto di ossigeno e nutrienti alle cellule dell’organismo e la rimozione da esse di anidride carbonica ed altri metaboliti.

Plasma: contiene i fattori della coagulazione del sangue; per ottenerlo bisogna aggiungere delle sostanze anticoagulanti al sangue prelevato. Composto da 92% di acqua, proteine 8% e Sali minerali. Privo di cellule.

Siero: privo dei fattori della coagulazione, si ottiene lasciando coagulare il campione di sangue prima della centrifugazione. Si usano provette contenenti: attivatore della coagulazione gel separatore, per facilitare la separazione del siero. È il risultato di un liquido formato da plasma (= fase liquida del sangue) senza fattori di coagulazione.

In una raccolta del campione di sangue si vanno a misurare i valori plasmatici degli elettroliti, per far questo è necessario separare il plasma dalle cellule, facendo attenzione al tempo stesso a non romperle, altrimenti si andrebbe a compromettere il buon risultato delle analisi stesse. Però i fattori di coagulazione possono interferire con le analisi, quindi si può lavorare sul siero che risulta esserne privo. La preparazione del campione ematico ha bisogno di una centrifugazione a 150 x g per 10 min.

Anticoagulanti

• Eparina: agisce inibendo la trombina ed altri fattori della coagulazione. L’eparina è considerata l’anticoagulante naturale per eccellenza, in quanto presente a bassi livelli nel sangue e nei tessuti. Il campione che si ottiene è utilizzabile per ogni analisi biochimica.
• "Chelante": significa che sequestra il calcio

Le provette utilizzate per raccogliere il sangue possono contenere anticoagulanti specifici. I tappi delle provette hanno un codice di colore. Esempio:

• Tappo rosso/giallo = senza anticoagulanti, il sangue coagula, si separano siero, globuli rossi e bianchi. Sulla parete della provetta particelle di silice attivano la coagulazione e un gel sul fondo aiuta la separazione del siero dalla parte corpuscolata.
• Tappo viola = anticoagulante EDTA
• Tappo verde = litio eparina
• Tappo grigio = fluoruro ossalato, per glicemia.
• Tappo azzurro = sodio citrato
• Tappo blu = sodio eparina, particolarmente per elementi in traccia (Fe, Zn, Cu, Pb, Ni, Mg)

Plasma e proteine plasmatiche

Il plasma contiene più di 300 proteine diverse e sono tutte di origine epatica, tranne le immunoglobuline, molte sono permanenti e hanno un ruolo specifico (molte compaiono nel plasma a seguito di una condizione patologica):

• Mantenimento della pressione osmotica colloidale (albumina)
• Trasporto (trasportatori di lipidi, ormoni, bilirubina, ferro)
• Difesa immunitaria (Immunoglobuline, sistema del complemento)
• Coagulazione e fibrinolisi
• Enzimi di provenienza tissutale
• Marcatori tumorali

Le proteine plasmatiche si suddividono in 6 diverse frazioni distinguibili elettroforeticamente:

1. Albumina: più abbondante proteina sierica, pressione oncotica e trasporto
2. Alfa 1 globuline = proteine inibitrici di proteasi
3. Alfa 2 globuline = aptoglobina, ceruloplasmina, alfa 2 macroglobulina
4. Beta 1 globuline = transferrina, emopessina, fibrinogeno
5. Beta 2 globuline = lipoproteine, sistema del complemento
6. Gamma globuline = immunoglobuline
7. Settima frazione: transtiretrina o pre-albumina

Elettroforesi delle proteine sieriche

Principio dell’elettroforesi delle proteine: migrazione, attraverso un mezzo liquido e/o solido, e sotto l’impulso di un campo elettrico, di particelle dotate di cariche, ioni o polielettroliti. Molte molecole biologiche (aa, peptidi, proteine, DNA, RNA) hanno gruppi ionizzabili e ad un determinato pH esistono in soluzione come specie cariche elettricamente, cationi (+) e anioni (-), che, sotto l’azione di un campo elettrico migrano al catodo o all’anodo.

L’alimentazione fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica. I cationi migrano verso il catodo (-) mentre gli anioni verso l’anodo (+) a una velocità che dipende dall’equilibrio tra la forza di spinta e le forze frenanti (frizionali ed elettrostatiche) esistenti tra ioni e mezzo circostante. Quindi la migrazione è direttamente proporzionale alla carica netta di una molecola (che dipende dal proprio punto isoelettrico e dal pH del mezzo), ed inversamente proporzionale alle dimensioni.

L’elettroforesi di proteine utilizza di norma supporti costituiti da gel di policrilammide (PAGE) che separano le proteine in base alle dimensioni ed alla carica delle molecole. È un supporto molto usato perché ha una porosità omogenea e riproducibile. Per esempio: le proteine in un tampone a pH= 8 sono cariche negativamente e quindi migrano verso l’anodo.

Colorazione per evidenziare le bande proteiche sul gel

La scelta del colorante dipende dalla sensibilità di colorazione. Esempio: Colorazione con colorante Coomassie.

• Si immerge il gel in una soluzione tampone acida contenente il colorante Coomassie
• Esso si lega a residui basici e idrofobici delle proteine, cambiando il suo colore (da rossastro a blu intenso)

Le proteine appaiono quindi sul gel come bande blu, posizionate ad altezze corrispondenti alla loro carica o al loro peso molecolare.

Densitometria

La densitometria consiste nell’analisi quantitativa delle bande, corrispondenti alle frazioni proteiche. Un densitometro è uno strumento che misura il grado di scurezza delle singole bande. Consiste in una fonte luminosa e di una cellula fotoelettrica, determina la densità di un campione posto tra la fonte luminosa e la cellula fotoelettrica, dalla differenza della lettura e si usa per quantificare l’intensità delle bande.

L’analisi elettroforetica si effettua sul siero (assente il fibrinogeno, 4% delle proteine plasmatiche). L’elettroforesi separa le proteine sieriche e ne consente l’identificazione quantitativa e qualitativa.

Elettroforesi capillare

È un metodo di analisi molto rapido e ad alta risoluzione. La corsa elettroforetica avviene in fase liquida in un capillare di silice fusa riempito di soluzione elettrolitica. Le proteine migrano in verso opposto rispetto ad un elettroforesi sul gel di agarosio, vengono trascinate dal flusso elettroendosmotico. Il risultato viene rappresentato come un elettroferogramma che riporta la risposta del detector in funzione del tempo; le proteine separate appaiono come picchi con differenti tempi di ritenzione.

• Lunghezza del capillare: 20-100 cm
• Diametro del capillare: 20-80 μm
• Usato un volume molto piccolo di siero
• Alto voltaggio: 8-15 kV
• Temperatura: 24°C
• Durata corsa: 5 minuti

La visualizzazione delle singole proteine avviene senza bisogno di colorante. Si misura l’assorbanza delle proteine di raggi UV da parte di un rivelatore.

Centrifugazione

Dopo aver ottenuto il campione e scelto l’anticoagulante si procede con la centrifugazione. In un campo centrifugo applicato (maggiore del campo gravitazionale terrestre) le particelle possono essere separate perché sedimentano con velocità diversa a seconda delle diverse caratteristiche di densità, dimensione, forma. In campo chimico-clinico, la centrifugazione è impiegata per la separazione di solidi da liquidi (es. parte corpuscolata del sangue dal plasma, cellule o microcristalli delle urine).

Proteine plasmatiche: elettroforesi o protidogramma

Le proteine plasmatiche sono importanti non solo per comprendere la funzionalità epatica ma anche per avere informazioni relative a possibili patologie e problemi d’assunzione di diversi elementi fondamentali come il ferro.

Risposta di fase acuta

Il concetto di risposta di fase acuta è un insieme di processi sistematici a carattere difensivo, in genere connessi a stimoli infiammatori, che limitano la diffusione di patogeni (batteri, virus, molecole) all’interno dell’organismo e favoriscono i fenomeni riparativi tissutali. Sono cambiamenti di difesa rapidi, transitori o permanenti indotti dai macrofagi, cellule endoteliali, microglia, con produzione di citochine (IL-1, IL-6 e TNF). I possibili effetti: febbre, leucocitosi, inappetenza, stanchezza, diminuzione di ferro e zinco sierico, aumento del catabolismo muscolare, cefalea. Le proteine di fase acuta sono proteine plasmatiche, la cui concentrazione aumenta (proteine positive di fase acuta) o diminuisce (proteine negative di fase acuta) in presenza di infiammazione. Quindi, variazioni delle proteine del protidogramma sierico sono informative di processi infiammatori in corso.

Transferrina (TTR) o pre-albumina

È una proteina globulare non glicosilata, omotetramero PM 55 kDa, si può dire che sia la prima proteina ad essere evidenziata nel protidogramma, ha un picco basso che nell’elettroforesi non si riesce quasi mai ad apprezzare. Si associa alla retinol binding protein (RBP) ed è anche in grado di legare gli ormoni tiroidei. È un marcatore negativo della fase acuta. Ha un’emivita di circa 2,5 giorni e i suoi valori sono: 0,2-0,4 g\L.

Albumina

L’albumina è la principale proteina plasmatica, da sola rappresenta circa la metà delle proteine circolanti (55-65% della protidemia totale). Per quanto riguarda la sua struttura: quella primaria è una singola catena polipeptidica di 585 AA, MW 66,3 kDa, presenta 17 ponti disolfuro e non risulta essere glicosilata; la sua struttura secondaria è per il 55% formata da alfa elica, la sua struttura 3D è stata determinata tramite cristallografia a raggi X e presenta tre domini omologhi, avvolti in modo ellittico, presenta un’emivita di circa 20 giorni. Viene sintetizzata come pre-pro-albumina e secreta dal fegato. I suoi valori normali di riferimento (da ricordare): 35-52 g/L; 52-68%

Le sue funzioni sono:

• Mantenimento della pressione oncotica plasmatica
• Trasporto ormoni della tiroide ma anche di altri ormoni, in particolare quelli solubili nei grassi (liposolubili); trasporto degli acidi grassi liberi, bilirubina non coniugata; trasporto di molti farmaci (es. barbiturici); legame competitivo con gli ioni calcio (Ca²⁺)
• Ha un ruolo nel tamponamento del pH
• È un marcatore negativo della fase acuta (la sua presenza è indicativa di un processo infiammatorio in corso)

Ipoalbuminemia

Si verifica quando i livelli plasmatici di albumina si abbassano troppo. Tra le cause più comuni: diminuzione della sintesi per vari motivi come malnutrizione, malattia epatica cronica e avanzata; diluizione quindi aumento dell’idratazione, escrezione anomala (accade nella sindrome nefrotica che si ritrova nelle urine), emorragie, ustioni; distribuzione anomala nello spazio interstiziale per aumentata permeabilità capillare (nello shock settico); processi infiammatori (viene privilegiata la sintesi delle proteine positive della fase acuta); gravidanza (per aumento del volume plasmatico). Una delle conseguenze più comuni è l’edema, con questo termine si indica la fuoriuscita di liquido dai capillari e il riempimento dello spazio interstiziale.

In livelli di albumina normali, l’acqua tende a rientrare all’interno dei capillari. Se la quantità di albumina diminuisce, l’acqua viene eliminata da capillari e va a rigonfiare lo spazio interstiziale.

Alfa-1-globuline

Le alfa-1-globuline sono proteine altamente mobili sintetizzate nel fegato e circolanti nel sangue, per quanto riguarda il gruppo vengono prese in studio:

• Alfa-1-anti-tripsina (AAT): è una glicoproteina monomerica, appartiene alla famiglia delle serpine (serpine protease inhibitors), si comporta da inibitore della serin proteasi ed ha la capacità di inibire un gran numero di proteasi a serina. Va ad inibire l’elastasi per esempio. È una proteina positiva della fase acuta. La sua carenza (per polimorfismi genici) può portare danno polmonare ed epatico. v.r. 0,9-2,0 g/L.
• Alfa-1-glicoproteina acida: diminuisce in presenza di insufficienza epatica o malnutrizione, è una proteina positiva di fase acuta.

Alfa-2-globuline

• Aptoglobulina: è una mucoproteina, nella sua forma più semplice è un tetramero (due catene leggere alfa e due pesanti beta collegate da ponti disolfuro), le catene derivano da una proteina precursore comune che viene scissa proteoliticamente durante la sintesi proteica che avviene nel fegato. Lega le catene globiniche libere in caso di emolisi (quindi se i suoi livelli dovessero diminuire qualche motivo, questo sarebbe indice di emolisi intravasale). È una proteina positiva della fase acuta, è stimolata proprio dalle citochine pro-infiammatorie.
• Alfa-2-macroglobulina: è una proteina plasmatica di circa 720 kDa prodotta dal fegato, inattiva numerose proteasi (compresa la trombina) quindi è un’antiproteasi, aumenta nella sindrome nefrosica, non è una proteina della fase acuta.
• Ceruplasmina: è una proteina contenente rame, prodotta dal fegato, ha un’attività ferrossidasica, è coinvolta nell’omeostasi del rame (infatti ne è la principale proteina di trasporto del sangue), è un importante marcatore delle malattie genetiche dell’omeostasi del rame. È una proteina positiva della fase acuta. Può aumentare in gravidanza e in seguito all’assunzione di anticoncezionali ormonali.

Beta 1 e 2 globuline

Il picco di beta 1 è determinato dalla transferrina (la proteina che trasporta il ferro nel sangue) infatti se il paziente è anemico, la transferrina aumenta perché tende a potenziare il trasporto del ferro da tutte le fonti possibili per portarlo poi in circolo e passarlo agli organi ematopoietici (quindi il valore sarà elevato nelle anemie da carenza di ferro). Il picco di beta 2 è determinato dalle lipoproteine che trasportano i lipidi nel sangue, un valore inferiore è spesso connesso alla malnutrizione o alla cirrosi epatica. Fa parte della frazione delle beta globuline anche l’emopessina (lega l’eme liberato dalle globine in caso di emolisi), interviene in caso in cui l’aptoglobina non sia sufficiente.